MATERI DAN METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Departemen Nutrisi dan Teknologi Pakan, Laboratorium Ruminansia Kecil Departemen Teknologi Produksi Ternak, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor, Unit Rehabilitasi Reproduksi dan di Laboratorium Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan Insitut Pertanian Bogor. Waktu pelaksanaan dimulai bulan Mei 2007 dan berakhir bulan Desember 2007.
Metode Penelitian
Percobaan menggunakan 18 ekor Domba Garut jantan umur ± 1.5 tahun dengan bobot badan ± 35 kg. Ternak dikelompokan berdasarkan bobot hidupnya menjadi tiga kelompok. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak kelompok. Seluruh ternak dipelihara dalam kandang metabolis. Setiap ternak mendapatkan salah satu ransum perlakuan secara acak.
Pakan yang dicobakan terdiri atas enam jenis ransum dengan nilai perbandingan kation-anion ransum (PKAR) basal (+14), basa (+40), dan asam (-40). Pakan tersebut ada yang disuplementasi minyak ikan sebanyak 3% dan tanpa suplementasi minyak ikan. Seluruh pakan mengandung mineral Zn 150 mg/kg BK ransum dengan cara menambahkan (ZnSO4) untuk mencapai kadar tersebut, dengan demikian terdapat enam macam ransum perlakuan. Ransum percobaan sebagai perlakuan disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Jenis ransum perlakuan
Ransum Nilai keseimbangan
kation-anion Minyak ikan (%BK)
RN0 Basal (+14) 0
RNI Basal(+14) 3
RB0 Basa (+ 40) 0
RBI Basa (+ 40) 3
RA0 Asam (- 40) 0
RAI Asam (- 40) 3
Keterangan: RN0=ransum basal tanpa minyak ikan, RNI=ransum basal dengan 3% minyak ikan, RB0=ransum basa tanpa minyak ikan, RBI=ransum basal dengan 3% minyak ikan, RA0=ransum asam tanpa minyak ikan, RAI=ransum asam dengan 3% minyak ikan.
Bahan pakan penyusun ransum berupa: jerami jagung, bungkil kelapa , dedak, onggok, jagung kuning, bungkil kedelai, minyak ikan lemuru, Na2CO3,
K2CO3, MgCl2, MgSO4 dan ZnSO4. Semua bahan pakan dalam bentuk tepung dan dicampur berdasarkan formulasi yang sudah ditentukan (Wolzl-Tomaszewska et al. 1993) untuk kebutuhan protein dan (NRC 1985) untuk kebutuhan mineral.
Alat-alat yang diperlukan antara lain : kandang metabolis modifikasi, tempat pakan, tempat minum, tempat penampungan feses, kantung penampung urin, timbangan kapasitas O Haus 500 g dengan tingkat ketelitian 0.1 gram, 15 kg dengan tingkat ketelitian 50 g dan timbangan 100 kg dengan ketelitian 0.5 kg.
Peralatan untuk analisis kecernaan BK dan BO, peralatan untuk analisis darah dan peralatan untuk peubah-peubah reproduksi.
Ransum basal adalah ransum komplit yang tersusun dari bahan-bahan dalam bentuk tepung dengan kandungan nutrien yang sama. Ransum ini diperoleh dari hasil penyusunan ransum tanpa penambahan sumber ion negatif dan positif dengan nilai PKA-nya sama dengan +14 (Tabel 4).
Tabel 4. Komposisi dan kandungan nutrien ransum basal Komposisi Pakan (% BK ransum basal)
Hijauan jagung 35.0
Dedak 7.0 Onggok 10.5
Jagung kuning 17.5
Bungkil kelapa 8.0
Bungkil kedelai 22.0
Jumlah 100.0
Kandungan Nutrien ransum basal (% BK)
Bahan kering 89.41
Abu 8.19
Protein kasar 14.94
Lemak kasar 2.98
Serat kasar 14.71
BETN 56.17 Keterangan: Ransum dianalisi di Laboratorium Ilmu Nutisi Ternak Perah Fakultas Peternakan
IPB 2007
Ransum perlakuan merupakan ransum basal yang ditambah dengan garam- garam mineral sehingga mempunyai nilai PKAR +40 dan -40 meq masing-masing ada yang ditambahkan minyak ikan 3% dan tidak. Ransum basa diperoleh dengan menambahkan Na2CO3 dan K2CO3 ke dalam ransum basal, masing-masing sebagai sumber kation Na dan K agar nilai NKA menjadi +40. Kelompok ransum
asam diperoleh dengan menambahkan MgCl2 dan MgSO4 ke dalam ransum basal masing-masing sebagai sumber kation Cl dan S agar nilai NKAnya menjadi -40.
Suplementasi garam-garam mineral dan minyak ikan masing-masing ransum perlakuan disajikan dalam tabel 5. Ransum tersebut dianalis kandungan Na, K, Cl, dan S total, dilanjutkan dengan menghitung besarnya neraca kation-anion berdasarkan persamaan Tucker et al. (1992) sebagai berikut:
PKAR = ( Na + K ) – ( Cl + S ) (meq/100 g BK ransum).
Tabel 5. Suplementasi garam-garam mineral dan minyak ikan Ransum Perlakuan
RN0 RNI RB0 RBI RA0 RAI Suplementasi garam mineral dan minyak ikan (g/100 g BK ransum)
ZnSO4 0.030 0.030 0.030 0.030 0.030 0.030
Na2CO3 - - 4.356 4.356 - -
K2CO3 - - 1.663 1.663 - -
MgSO4 - - - - 12.36 12.36
MgCl2 - - - - 2.26 2.26
Minyak ikan 0.0 3.0 0.0 3.0 0.0 3.0 Kandungan Mineral (g/100g BK ransum)
Natrium 0.041 0.041 1.957 1.957 0.041 0.041 Kalium 0.1076 0.1076 1.048 1.048 0.1076 0.1076 Klorida 0.193 0.193 0.193 0.193 1.882 1.882 Sulfur 0.151 0.151 0.151 0.151 3.447 3.447 Kalsium 0.020 0.020 0.020 0.020 0.020 0.020 Fosfor 0.019 0.019 0.019 0.019 0.019 0.019 Mg 0.42 0.42 0.42 0.42 3.043 3.043 Seng 0.150 0.150 0.150 0.150 0.150 0.150
Keterangan: RN0=ransum basal tanpa minyak ikan, RNI=ransum basal dengan 3% minyak ikan, RB0=ransum basa tanpa minyak ikan, RBI=ransum basal dengan 3% minyak ikan, RA0=ransum asam tanpa minyak ikan, RAI=ransum asam dengan 3% minyak ikan.
Keenam ransum perlakuan tersebut di atas dicobakan kepada Domba Garut yang sudah dikelompokkan ke dalam rancangan acak kelompok (RAK), kelompok yang digunakan sebanyak 3 yaitu:
I. Kelompok domba jantan dengan bobot badan 34.58±2.38 kg II. Kelompok domba jantan dengan bobot badan 30.75±0.42 kg III. Kelompok domba jantan dengan bobot badan 29.67±0.68 kg
Jumlah satuan percobaan pada penelitian ini sebanyak 18 berupa Domba Garut jantan. Setiap ransum perlakuan secara acak dicobakan ke dalam masing-masing domba jantan pada kelompok yang sama. Sebelum perlakuan ransum diberikan, semua ternak diberi ransum basal tanpa suplementasi ZnSO4 selama dua minggu.
Tata letak satuan percobaan pada penelitian ini seperti yang tertuang pada Gambar 9.
I II III D
F B E C A
C E A B D F
A C E D F B
Gambar 9. Tata letak satuan percobaan pada penelitian
Peubah yang Diamati Peubah Nutrisi Peubah yang diukur meliputi :
a. Konsumsi Bahan Kering (g/hari)
Jumlah konsumsi ransum harian diperoleh dengan cara seperti di bawah ini:
Jumlah konsumsi (gram) = jumlah ransum yang diberikan (gram) – jumlah sisa ransum keesokan harinya. Pengukuran konsumsi ransum dilakukan setiap hari selama penelitian.
b. Kecernaan Bahan Kering (KCBK) dan Kecernaan Bahan Organik (KBO) (%) Kecernaan bahan kering dan bahan organik diperoleh dengan cara seperti di bawah ini :
Kecernaan BK/BO = Konsumsi BK/BO – BK/ BO dalam feses x 100%
Konsumsi BK/BO ransum
Penganbilan sampel feses untuk pengukuran KCBK dan KCBO dilakukan pada hari ke-14 sanpai hari ke-20 penelitian.
c. Pertambahan bobot badan (PBB) (g/hari)
Pertambahan bobot badan diperoleh dengan cara seperti di bawah ini : PBB (g/hari) = Bobot Awal – Bobot Akhir
Waktu
Peubah Fisiologis Peubah yang diamati meliputi :
a. Status mineral plasma
Pengambilan sampel darah dilakukan pada hari ke-50 penelitian. Mineral plasma yang dianalisis yaitu K, Na, Zn, Mg, S dan Cl. Mineral Na+, Zn dan K+ dengan menggunakan alat AAS; sedangkan Cl- dengan menggunakan alat buret dan S dengan menggunakan spektrofotometer.
b. Status mineral semen.
Analisis satus mineral semen dilakukan terhadap semen yang dikoleksi pada hari ke-28 penelitian Pada hari ke-21 penelitian pengaruh nutrisi sudah stabil di dalam tubuh ternak. Mineral Na+, Zn, dan K+ dengan menggunakan alat AAS; sedangkan Cl- dengan menggunakan alat buret dan S dengan menggunakan spektrofotometer.
c. Hematokrit darah
Pengambilan sampel darah dilakukan pada hari ke-50 penelitian.
d. pH darah
Pengambilan sampel darah dilakukan pada hari ke-50 bersamaan dengan pengambilan sampel darah untuk analisis hematokrit darah. Pengukuran pH darah menggunakan Radiometer ABL series 700.
e. pCO2, pO2 dan HCO3-
Pengambilan sampel darah dilakukan pada hari ke-50, dianalisis menggunakan Radiometer ABL series 700.
f. cBase (Ecf)c (mmol)
Pengambilan sampel darah dilakukan pada hari ke-50, dianalisis menggunakan Radiometer ABL series 700.
g. pH urin.
Pengukuran pH urin dilakukan seminggu sekali, dimulai sebelum ransum perlakuan diberikan ( hari k-7, 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 dan 49).
Peubah Reproduksi
Koleksi dan analisis semen secara makroskopis dilakukan pada hari ke-14, -7, 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 dan 49. Analisis semen secara mikroskopis dilakukan pada hasil koleksi semen pada hari -14, -0 (sehari sebelum perlakuan pakan diberikan), hari ke-21 dimana pengaruh nutrisi dari ransum sudah stabil pada tubuh ternak (Bannink et al. 1999) dan hari ke-49 (berdasarkan waktu yang dibutuhkan untuk keseluruhan proses spermatogenesis pada domba 46-49 hari (Salisbury and VanDemark 1985; Bearden and Fuquay 2000)). Peubah yang diamati meliputi :
a. Kualitas semen secara makroskopis (Arifiantini et al. 2004)
• Volume (ml)
Volume semen didapat dengan cara mengukur jumlah semen yang tertampung pada saat koleksi semen dalam satu ejakulasi.
• Konsistensi atau kekentalan
Kekentalan semen ditentukan dengan cara memiringkan tabung penampung semen ke arah pinggir, kemudian dilihat kecepatan cairan semen tersebut pada posisi semula. Nilai kekentalan semen adalah kental, sedang dan encer.
• Warna
Warna semen diamati langsung ketika semen dikoleksi. Warna semen yang normal bervariasi yaitu krem, putih susu dan kekuningan.
• pH
pH semen diukur dengan cara meneteskan semen pada pH indicator paper (skala 6-8), kemudian dilihat perubahan warnanya dan dicocokkan dengan nilai yang ada pada skala pH indicator paper.
• Bau
Bau semen diamati langsung dengan cara mencium semen. Semen yang normal akan mempunyai bau yang spesifik.
b. Kualitas semen secara mikroskopis (Arifiantini et al. 2004)
• Gerakan massa
Diamati dengan cara meneteskan semen pada gelas objek (tidak ditutup dengan cover glass) dengan menggunakan pipet pasteur, kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 10. Nilai gerakan masa adalah sebagai beirkut:
+++ : gelombang tebal, cepat berpindah dan aktif. Tebal gelombang ada hubungannya dengan konsentrasi spermatozoa aktif dan motilitas sangat baik.
++ : gelombang sedang dan cukup aktif, motilitas spermatozoa cukup aktif.
+ : Gelombang jarang dan lemah, motilitas spermatozoa jelek.
- : Tidak ada gelombang.
• Gerakan spermatozoa secara individual (%)
Amati gerakan sperma secara individual dengan cara sebagai berikut:
teteskan 2-3 ml cairan fisiologis, tambahkan sedikit semen, dengan cara menyentuhkan ujung pipet yang mengandung semen kepada gelas obyek, kemudian homogenkan. Perbandingan semen dengan cairan fisiologis adalah 1:10. Ambil satu tetes, pindahkan ke gelas obyek yang baru kemudian tutup dengan gelas penutup. Lihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 40 x 10. Cara menilai motilitas sperma : lihat dan perhatikan banyaknya yang bergerak aktif ke depan (progresif) kemudian bandingkan dengan banyaknya spermatozoa yang gerakannya abnormal dan spermatozoa yang diam di tempat (mati). Gerakan abnormal yang ditemukan umumnya adalah gerakan berputar-putar (sirkuler), gerakan mundur ke belakang (reverse) dan gerakan di tempat (vibrator).
Pengamatan dilakukan terhadap 5 (lima) lapang pandang, masing-masing lapang pandang mengandung spermatozoa berkisar 20 sel.
• Konsentrasi spermatozoa (sel/ml)
Penentuan konsentrasi sperma menggunakan haemocytometer. Prosedur pelaksanaannya adalah sebagai beikut : hisap semen menggunakan pipet eritrosit sampai angka 0.5 kemudian lap dengan tissue bagian ujung luar
pipet tersebut. Selanjutnya hisap larutan eosin 0.2% sampai angka 101.
Homogenkan dengan cara menggerak-gerakkan pipet eritrosit tersebut dengan gerakan seperti membuat angka delapan selama 2 – 3 menit.
Buang sebagian larutan dengan cara meneteskan pada kertas tissue.
Masukkan ke dalam kotak hitung haemocytometer yang telah ditutup dengan gelas penutup dari kedua sisi. Lihat dan hitung di bawah mikroskop dengan pembesaran 40 x 10. Hitung spermatozoa dari 5 kotak besar dalam kotak hitung haemocytometer. Kaidah perhitungan : kepala sperma di dalam kotak dihitung 1 (satu), kepala sperma yang terletak di batas garis dihitung ½ (setengah) dan ekor spermatozoa di dalam kotak tidak dihitung.
• Abnormalitas morfologi spermatozoa (%)
Pengamatan abnormalitas morfologi spermatozoa menggunakan preparat deferensial, dengan prosedur sebagai berikut: sediakan 3 (tiga) gelas obyek yang bersih dan bebas lemak (bersihkan dengan alkohol dan keringkan dengan kertas tissue). Teteskan eosin 2% sebanyak 2-3 tetes di atas gelas obyek, campurkan sedikit semen (dengan cara menyentuhkan gelas pengaduk yang telah dicelupkan kedalam semen kepada gelas obyek).
Homogenkan secara cepat. Ambil gelas obyek kedua, singgungkan ujungnya pada campuran tadi, lalu buat preparat ulas pada gelas obyek ketiga. Keringkan di atas api sampai kering (fiksasi). Waktu pengerjaan preparat deferensial tidak boleh lebih dari 15 detik. Hitung jumlah spermatozoa yang normal maupun yang abnormal. Pengamatan dilakukan terhadap 5 (lima) lapang pandang, masing-masing lapang pandang mengandung spermatozoa berkisar 20 sel.
Abnormalitas (%) = ∑ total spermatozoa abnormal x 100%
∑ total sperma abnormal + ∑total sperma normal
• Persentase spermatozoa hidup (%)
Prosedur pengerjaannya sama dengan prosedur abnormalitas morfologi spermatozoa, namun yang diamati adalah spermatozoa yang hidup dan
yang mati. Spermatozoa mati berwarna ungu sedangkan sperma hidup tidak berwarna karena mempunyai kemampuan untuk menolak cairan kedalam selnya.
Spermatozoa hidup (%) = ∑total spermatozoa hidup x 100%
∑ total sperma hidup + ∑ total sperma mati
• Rasio spermatozoa X dan Y
Perhitungan spermatozoa X dan Y dibedakan berdasarkan besarnya luas kepala spermatozoa, dengan asumsi bahwa spermatozoa Y mempunyai kepala lebih kecil daripada X. Preparat yang digunakan adalah preparat ulas dengan pewarnaan William. Cara pembuatannya adalah sebagai berikut : fiksasi preparat ulas dari semen segar yang dikoleksi dengan bunsen. Cuci dalam alkohol absolut selama 4 menit. Biarkan sampai kering. Masukkan ke dalam larutan 0.5% chloramin selama 1-2 menit, sambil diangkat dan dimasukkan kembali berkali-kali dengam tujuan menghilangkan mukus dan ulasan terlihat jernih. Cuci dalam destilated water selanjutnya masukkan ke dalam alkohol 95%. Warnai dengan larutan Williams selama 8-10 menit. Cuci dengan air, pada air mengalir sampai air jernih, kemudian keringkan (Wiliams 1920). Untuk mengukur luas kepala, ekor dipisahkan secara manual dengan mempergunakan line tool pada Image J. Kualitas foto diubah dari kualitas warna dengan kedalaman 24 bit menjadi grey scale dengan kedalaman warna 8 bit. Latar belakang dibersihkan dengan perintah substract background. Untuk dapat dianalisa, foto diubah menjadi format binary hitam putih dengan perintah threshold, partikel-partikel kotoran kemudian dikurangi dengan perintah remove outliers dan celah-celah dalam kepala sperma diisi dengan perintah fill holes. Analisa luas kepala spermatozoa dengan mendefinisikan sebagai partikel dengan ukuran antra 30-60 µ2 dengan sirkularitas (tingkat kebundaran) 0.7-0.85 (dari skala 0 sd 1). Selanjutnya montase area terukur (region of interest) pada foto asal untuk melihat
tingkat akurasi pengukuran. Simpan hasil pengukuran dalam format exel untuk dianalisa. Nilai luas area yang berada diluar sebaran normal tidak dimasukkan dalam perhitungan untuk menghindari bias data akibat abnormalitas ukuran kepala spermatozoa. Untuk nilai area lebih kecil sama dengan median dikurangi setengah dari nilai standar deviasi dianggap sebagai spermatozoa Y, sedangkan sperma dengan nilai lebih besar sama dengan median ditambah setengah dari standar deviasi dianggap sebagai spermatozoa X. Penambahan dan pengurangan dengan nilai setengah dari standar deviasi dimaksudkan sebagai faktor koreksi untuk menghindari bias data. Masing-masing sampel diukur panjang dan lebar kepala spermatozoanya dengan mikrometer sebanyak 50-100 sel.
Kemudian cari nilai tengahnya. Besar kepala spermatozoa yang kurang dari nilai tengahnya adalah spermatozoa Y sedangkan yang besarnya lebih dari nilai tengah adalah spermatozoa X (Révay et al. 2004). Tahapan- tahapan tersebut disajikan dalam gambar 10.
Analisis Data
Data hasil penelitian akan dianalisis dengan menggunakan The SAS System for Windows 6.12. dengan menggunakan Anova, kemudian dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan Multiple Range Test, kontras ortogonal (Mattjik and Sumertajaya 2006).
Gambar 10 Tahapan pengukuran luas area kepala spermatozoa mempergunakan perangkat lunak ImageJ. A. kepala spermatozoa dan leher dipisahkan secara manual mempergunakan line tool; B. kualitas foto diubah dari kualitas warna dengan kedalaman 24 bit menjadi grey scale dengan kedalaman warna 8 bit dan latar belakang dibersihkan; C. foto diubah menjadi format binary hitam putih; D.
celah di dalam kepala sperma akibat perbedaan kontras diisi dan partikel-partikel kotoran kemudian dikurangi; E. luas kepala sperma kemudian dianalisa dengan didefinisikan sebagai partikel dengan ukuran antra 30-60 µ2 dengan sirkularitas (tingkat kebundaran) 0.7-0.85 (dari skala 0 sd 1). Area terukur kemudian di montase pada foto asal untuk melihat tingkat akurasi pengukuran.
A B
C D
E F
