LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA (Kinetika Reaksi Enzim)

(1)

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

(Kinetika Reaksi Enzim)

DISUSUN OLEH KELOMPOK D1

10060310105 Siti Aminah

10060310106 Irma Yunita Aryani 10060310107 Selly Nurul Ulfah 10060310108 Haniva Humanisya 10060310109 Tara Verina

ASISTEN KELOMPOK:

Adi Supriyadi, S. Farm.

LABORATORIUM FARMASI TERPADU UNIT B PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MIPA UNISBA

2011

I. Tujuan

• Dapat memahami prinsip kinetika reaksi enzim dan faktor yang mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim.

• Dapat melakukan percobaan sesuai Standard Operasional Procedur.

(2)

II. Teori Dasar

Enzim mengkatalisis hampir semua reaksi-reaksi biologis penting. Oleh karena itu bagi ahli kesehatan pengetahuan mengenai sifat-sifat kimia dan fungsi enzim sangat diperlukan apabila akan mempergunakan nya dalam prosedur diagnosa. Beberapa cabang ilmu kesehatan telah memperoleh manfaat dari pemakaian analisis enzim ini, seperti pada penyakit infark miokardial, hepatitis, kanker prostat, penyakit penyumbat hati. Aktivitas enzim pada beberapa penyakit mungkin tinggi dan pada beberapa yang lainnya mungkin rendah. Proses uji enzim juga menjadi semakin penting pada pemeriksaan genetik, karena dapat dipakai untuk mendeteksi pembawa heterozigot penyakit- penyakit keturunan seperti fenilketonuria. Telah diketahui dengan jelasbahwa enzim jaringan didistribusikan dengan cara yang terorganisasi baik; sel bukan hanya meruipakan “kantong longgar” enzim. Namun hasil dari reaksi enzim dalam satu komponen jaringan akan mempunyai pengaruh cukup besar pada proses enzim lain pada komponen yang lainnya dalam jaringan tersebut atau bahkan pada jaringan yang lainnya sama sekali. Pengetahuan yang lebih mendalam mengenai distribusi enzim didlaam sel menjadi sangat penting guna pemahaman mekanisme penyakit beserta terapinya.(Mentgomery,Rex. 1993)

Enzim adalah biokatalis yang diproduksi oleh jaringan hidup dan dapat meningkatkan laju reaksi yang mungkin terjadi dalam jaringan. Enzim bekerja dengan urutan yang teratur. Bila reaksi berjalan tanpa adanya enzim, maka reaksi akan berjalan lambat. Misal CO2 bereaksi dengan H2O membentuk asam karbonat, sebagian daripadanya pada suatu pH fisiologis akan terionisasi dan membentuk ion bikarbonat. Disosiasi ini tentunya tidak tergantung pada katalisis enzim, tapi merupakan sifat struktur asam itu sendiri.

H2O + CO2 ↔ HCO3 ↔ H⁺ + HCO3-

Penguraian asam karbonat tapa melalui katalisis menjadi H2O dan CO2 tidak terjasi seketika. karena laju reaksi ini dalam kenyataanya sangat lambat, keseimbangan mungkin tidak akan tercapai dalam 1 jam. Jika diambil contoh air karbonat lalu ditambahkan enzim anhhidrase kabonat, maka keseimbangan akan tercapai dalam 1 menit. Sel darah merah dalam tubuh sangat kaya memacu perubahan CO2 menjadi bikarbonat melalui bentuk perantara asam karbonatyang terdisosiasi. (Mentgomery,Rex. 1993)

Enzim adalah Katalis Biologis yang dapat meningkatkan laju reaksi sampai lebih dari 10⁶kali. Dan dua sifat dasarnya yaitu peningkatan laju reaksi dengan

(3)

tanpa perubahan pada enzim dan peningkatan laju reaksi tanpa perubahan keseimbangan (equilibrium) serta penurunan energi aktivasi.

 Laju Reaksi kimia :

Perubahan konsentrasi per unit waktu (mol l^–1 s^–1)

 Reaksi katalitik enzimatis:

turnover per unit waktu, katal (kat, mol s^–1).

 international unit U (μmol turnover min^–1; 1 U = 16.7 nkat).

Pada enzim faktor-faktor yang mempengaruhi konduksi optimum enzim ialah pH, Suhu, konsentrasi substrat dan enzim, Inhibitor, Aktivator.

Penambahan substrat dengan konsentrasi tinggi akan meningkatkan kerja enzim.

Karena enzim akan tepat berikatan dengan substrat, dan bila substrat lebih banyak maka tidak jadi masalah karena bila terjadi tumbukan, akan terjadi antara substrat dan substrat saat waktu bersamaan. Berbeda hal dengan penambahan substrat konsentrasi kecil, maka akan terjadi tumbukan antara

(4)

substrat lama dan dengan yang baru untuk berikatan dengan enzim. Sehingga aktivitas enzim akan terganggu. Aktivator pada enzim dapat berupa koenzim atau kofaktor. Kofaktor ini berupa aktivator anorganik dan koenzim berupa aktivator organik. Dibawah ini tabel beberapa kofactor Enzyme

Cofaktor Enzim

Coenzyme

Thiamine pyrophosphate Pyruvate dehydrogenase Flavin adenine nucleotide Monoamine oxidase Nicotinamide adenine dinucleotide Lactate dehydrogenase

Pyridoxal phosphate Glycogen phosphorylase

Coenzyme A (CoA) Acetyl CoA carboxylase

Biotin Pyruvate carboxylase

5 -Deoxyadenosyl cobalamin Methylmalonyl mutase

Tetrahydrofolate Thymidylate synthase

Metal

Zn2+ Carbonic anhydrase

Zn2+ Carboxypeptidase

Mg2+ EcoRV

Mg2+ Hexokinase

Ni2+ Urease

Mo Nitrate reductase

Se Glutathione peroxidase

Mn2+ Superoxide dismutase

K+ Propionyl CoA carboxylase

III.Alat dan Bahan III. 1. Alat

- Batang pengaduk - Corong kaca - Cuvet

- Kertas saring - Pipet tetes

- Pipet ukur 1 mL; 5 mL; 10 mL - Stopwatch

- Spektrofotometri / colorimetri - Tabung reaksi

- Water bath 35 C III. 2. Bahan

- Aquadest

- Larutan TCA 20 % - Larutan kasein 2 %

- Larutan dapar posfat 0.1 M pH 8 - Larutan NaOH 0.5 N

- Larutan tripsin ( 10 mg dalam 25 mL dapar posfat 0.1M pH 8 ) - Reagent folin- Ciocalteu

(5)

IV. Prosedur Kerja Tabung t = 0 menit

- larutan dapar posfat dan tripsin dimasukkan kedalam tabung reaksi serta ditambahkan masing-masing 3 mL larutan TCA 20 %, diaduk perlahan dan diinkubasi 30 menit pada water bath 35 C.

Kemudian ditambahkan larutan kasein sesuai tabel dan didiamkan 20 mL dalam lemari es. Lalu disentrifugasi 10 menit dan saring melalui kertas saring untuk diambil supernatannya. Filtrat dilakukan metode anson.

Tabung t = 20 menit

- Diinkubasi 5 menit pada water bath 35 C masing-masing tabung berpengaduk yang berisi kasein sesuai tabel sambil diaduk.

Kemudian ditambahkan berturut-turut larutan buffer posfat dan larutan tripsin. Diinkubasikan selama 20 menit pada inkubator 35 C dihitung setelah penambahan tripsin. Dihentikan reaksi dengan penambahan 3 mL TCA 20 % kedalam masing-masing tabung dan diaduk sangat kuat. Lalu Didiamkan selama 20 menit dalam air es untuk menyempurnakan pengendapan. Dan disentrifugasi selama 10 menit kemudian disaring untuk diambil supernatannya. Filtrat dilakukan metode anson, yaitu dicampurkan 2mL TCA-Filtrat dengan 4mL NaOH 0.5 M kemudian ditambahkan 1 mL larutan Folin- Ciocalteu ( 1 volume reagen ditambah 1 volume aquadest).

Kemudian diamkan 10 menit dan ditetapkan serapannya 650 nm.

V. Data Pengamatan

Tabun g

Perlakuan yang dilakukan Penambahan Larutan

buffer fosfat, tripsin, dan TCA 20%

Diinkubasi dan diberi Larutan

kasein

Sentrifugasi dan disaring

I Larutan berwarna putih dan setelah ditambah

TCA menjadi putih bening

Larutan berwarna putih keruh dan terdapat

sedikit endapan disekeliling tabung

Larutan menjadi berwarna putih

agak bening, namun setelah disaring menjadi

sangat bening II Larutan berwarna putih Larutan berwarna putih Larutan menjadi

(6)

dan setelah ditambah TCA menjadi putih

bening

keruh dan terdapat sedikit endapan disekeliling tabung

berwarna putih agak bening, namun setelah disaring menjadi

sangat bening III Larutan berwarna putih

bening

Larutan berwarna putih keruh dan terdapat endapan disekeliling

tabung tetapi tidak terlalu banyak

sangat bening IV Larutan berwarna putih

bening

Larutan berwarna putih keruh dan terdapat

banyak endapan disekeliling tabung

sangat bening V Larutan berwarna putih

bening

Larutan berwarna putih keruh dan terdapat endapan disekeliling

tabung tetapi tidak terlalu banyak

sangat bening

Tabu ng

Perlakuan yang dilakukan NaOH 0,5 M Reagen Folin-Ciocalteu +

Aquadest

Penentuan Nilai Absorbansi menggunakan

Spektrofotom eter

I Larutan

berwarna putih bening

Larutan menjadi 2 lapisan, dibagian atas berwarna putih bening dan dibagian bawah berwarna kuning, namun setelah diaduk larutan menjadi

homogen dan berwarna kuning

0,050

II Larutan Larutan menjadi 2 lapisan, dibagian 0,051

(7)

atas berwarna putih bening dan dibagian bawah berwarna kuning, namun setelah diaduk larutan menjadi

homogen dan berwarna kuning III Larutan

0,060

IV Larutan

0,069

V Larutan

0,060

Penambahan Larutan buffer fosfat dan tripsin

(8)

Setelah ditambahkan TCA 20%

Ditambahkan Larutan kasein Setelah disentrifugasi

Ditambahkan Reagen Folin-Ciocalteu dan Aquadest

VI. Perhitungan

• Perhitungan Absorbansi ΔAI = At20 – At0

= 0,071 – 0,050

= 0,021

ΔAII = At20 – At0

= 0,081 – 0,051 = 0,030

ΔAIII = At20 – At0

= 0,084 – 0,060

= 0,024

ΔAIV = At20 – At0

= 0,208 – 0,069

= 0,139

• Perhitungan Kecepatan

(9)

Δt = t20 – t0 = 20

VI =

∆ A

∆ t

=

0,021 20

= 1,05 × 10^-3 mmol/menit

1

V (menit/mmol)

1 [S ]

^(1/mmol)

952,3810 3500,1750

666,6667 699,9860

833,3333 350,0053

143,8849 116,6671

Grafik Lineweaver-Burk

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0

200 400 600 800 1000 1200

f(x) = 0.15x + 479.61 R² = 0.41

1/(S) 1/V

y = ax + b, dimana a = Km

Vmax ^{, b =}

1

Vmax

Pada grafik, diketahui y = 0,1452x + 479,61

b =

1

Vmax

479,61 =

1

Vmax

Vmax =

1 479,61

Vmax = 2,085 × 10^-3 mmol/menit