ISOLASI, IDENTIFIKASI MOLEKULER FUNGI ENDOFIT Vitex trifolia L. DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERINYA TERHADAP Staphylococcus aureus MULTI-DRUG RESISTANT
ISOLATION, MOLECULAR IDENTIFICATION ENDOPHYTIC FUNGI OF Vitex trifolia L. AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY TEST
AGAINST MULTI-DRUG RESISTANT Staphylococcus aureus
MUHAMMAD ANUGERAH ALAM WARIS
SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR 2017
ISOLASI, IDENTIFIKASI MOLEKULER FUNGI ENDOFIT Vitex trifolia L.
DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERINYA TERHADAP Staphylococcus aureus MULTI-DRUG RESISTANT
Tesis
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar Magister
Program Studi
Farmasi
Disusun dan diajukan oleh
MUHAMMAD ANUGERAH ALAM WARIS
Kepada
SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR 2017
v PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga penelitian dan penyusunan tesis ini dapat terselesaikan. Salawat dan salam kepada rasulullah Muhammad SAW beserta keluarga, sahabat dan para pengikutnya yang setia hingga akhir zaman.
Tesis ini dibuat sebagai syarat untuk meraih gelar Magister Ilmu Farmasi pada Sekolah Pascasarjana Universitas Hasanuddin.
Penyusunan tesis ini tak lepas dari bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, karenanya penulis dengan tulus menghaturkan terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si, Apt. dan ibu Dr. Mufidah, S.Si., M.Si., Apt selaku Komisi Penasehat yang dengan penuh kesabaran membimbing dan memotivasi penulis sejak penyusunan proposal, proses penelitian, hingga selesainya penulisan tesis ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si, Apt., Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin beserta seluruh staf pengajar dan tenaga kependidikan yang telah mewariskan ilmu kepada penulis selama menimba ilmu di program Magister Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Hasanuddin.
2. Ibu Dr. Hj. Latifah Rahman, DESS., Apt. selaku Ketua Program Studi Magister Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Hasanuddin beserta staf yang telah memberikan fasilitas dan pelayanan selama penulis menempuh pendidikan magister.
3. Ibu Dr. Hj. Sartini, M.Si., Apt., bapak Subehan, S.Si., M.Pharm.Sc., Ph.D., Apt., dan ibu Yulia Yusrini Djabir, S.Si., M.Si., M.BM.Sc., Ph.D., Apt. selaku panitia penilai seminar usul, seminar hasil, dan ujian akhir yang telah banyak memberikan arahan dan saran dalam penyusunan tesis ini.
4. Orang tua tercinta, ayahanda Drs. Summase Waris, S.H., M.H. dan ibunda Hj. Sitti Kamariah Wahab, ayah mertua Drs. Muallifin dan ibu mertua Hj. Ellen Parinussa, saudariku terkasih dr. Nurul Indra Khamariah Waris atas doa dan cinta yang tidak pernah putus.
5. Istriku, Angga Pratiwi Wicaksana, S.Farm. atas cinta dan kasih sayang yang selalu setia menemani dalam terang dan gelapnya perjalanan roda kehidupan.
6. Buah hatiku, Muhammad Rayhan Alam Waris dan Muhammad Wildan Alam Waris yang selalu menjadi penyemangat dalam perjalananku, penawar dalam setiap rintanganku, dan lentera dalam kehidupanku.
7. Bapak Drs. H. Sahibuddin A. Gani, Apt. dan ibu Dra. Hj. Aisyah Fatmawaty, M.Si., Apt. atas nasehat, arahan, dan motivasi yang tak terhingga selama penulis menempuh pendidikan di program Magister Ilmu Farmasi, Sekolah Pascasarjana, Universitas Hasanuddin.
8. Bapak Aminullah, S.Si., M.Pharm.Sc., Apt., ibu Dewi Primayanti, S.Si., ibu Yayu Mulsiani Evary, S.Si., Apt., ibu Haslia, S.Si., ibu Desy Natsir, S.T., saudari Ridha Sari Marsuki, S.Si., Apt. yang telah banyak berbagi ilmu pengetahuan.
vii
9. Rekan seperjuangan Nana Juniarti Natsir Djide, S.Si., M.Si., Apt., Zahira Amody, S.Farm., M.Si., Apt., Andi Ulfah Magefirah Rasyid, S.Farm., M.Si., Apt., Andi Arfah, S.Si., Edi Gunawan, S.Farm., Anshari Masri, S.Si., M.Si., Apt. serta rekan-rekan Magister Ilmu Farmasi angkatan 2013 atas persahabatan yang telah terjalin kini dan nanti.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada banyak pihak yang belum dituliskan, semoga Allah memberikan balasan yang lebih baik.
Penulis menyadari bahwa penulisan tesis ini belum sempurna, karenanya kami mengharapkan saran untuk perbaikan selanjutnya. Semoga tesis ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya ilmu kefarmasian.
Makassar, 16 Agustus 2017
Muhammad Anugerah Alam Waris
viii ABSTRAK
MUHAMMAD ANUGERAH ALAM WARIS. Isolasi, Identifikasi Molekuler Fungi Endofit Vitex trifolia L. dan Uji Aktivitas Antibakterinya terhadap Staphylococcus aureus Multi-Drug Resistant (dibimbing oleh Gemini Alam dan Mufidah)
Fungi endofit merupakan mikroorganisme yang mampu menghasilkan senyawa yang serupa dengan tumbuhan inangnya. V. Trifolia, tanaman dari suku Verbenaceae, diketahui memiliki aktivitas antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengidentifikasi fungi endofit dari V.
Trifolia, mengetahui kemampuan fungi endofit dari V.trifolia untuk menghasilkan senyawa antibakteri S.aureus Multi-Drug Resistant (MDR) dan menentukan golongan senyawa tersebut.
Isolasi fungi endofit dari V. trifolia dilakukan dengan menginokulasi daun V. trifolia pada media Potato Dextrose Agar. Fungi endofit yang diperoleh selanjutnya diidentifikasi berdasarkan sekuens gen 28s rDNA dilanjutkan dengan analisis menggunakan metode Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) dan konstruksi filogenetika dengan metode Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) dalam software Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 (MEGA7). Seluruh isolat fungi endofit juga diuji kemampuannya untuk menghasilkan senyawa antimikroba, khususnya terhadap S.aureus MDR. Uji aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi agar dan KLT bioautografi.
Terdapat empat isolat fungi endofit yang diperoleh dan diidentifikasi sebagai Trichoderma reesei, Nigrospora sphaerica, Trichoderma longibrachiatum, dan Corynespora smithii. Uji antagonis menunjukkan bahwa fungi N. sphaerica memiliki aktivitas anti-S. aureus MDR. Pada konsentrasi 20% metabolit N. sphaerica menunjukkan zona hambat dengan diameter 11,13 mm. Uji KLT bioautografi menunjukkan beberapa bercak aktif terhadap S.aureus MDR yang diduga sebagai senyawa golongan terpenoid.
Kata Kunci : fungi endofit, Vitex trifolia, antibakteri
ix ABSTRACT
MUHAMMAD ANUGERAH ALAM WARIS. Isolation, Molecular Identification Endophytic Fungi of Vitex trifolia L. and Antibacterial Activity Test Against Multi-Drug Resistant Staphylococcus aureus (supervised by Gemini Alam and Mufidah)
Endophytic fungi are microorganisms that capable of producing similar compounds to their host plants. V. trifolia, a plant from Verbenaceae family, is known to have antibacterial activity. This study aimed to isolate, identify the endophytic fungi of V. trifolia, determine the endophytic fungi capability of V. trifolia to produce anti-S.aureus Multi-Drug Resistant (MDR) compound, and determine the class of the compound.
Isolation of endophytic fungi from V. trifolia was done by inoculating V.trifolia leaf on Potato Dextrose Agar media. The obtained endophytic fungi were further identified based on the 28S rDNA gene sequence followed by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) method analysis and phylogenetic construction using Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) in the Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 (MEGA7) software. All endophytic fungal isolates were also tested for their ability to produce antimicrobial compounds, particularly against S. aureus MDR. The antimicrobial activity test was performed by agar diffusion method and bioautographic TLC.
There are four isolates of endophytic fungi were obtained and were identified as Trichoderma reesei, Nigrospora sphaerica, Trichoderma longibrachiatum, and Corynespora smithii. The antagonistic test showed that the endophytic fungi, N. sphaerica had anti-S.aureus MDR activity. At concentrations of 20%, N. sphaerica metabolites showed an inhibition zone of 11.13 mm in diameter. The bioautographic TLC test showed several active spots against S. aureus MDR which are suspected as terpenoid group compounds.
Key words : endophytic fungi, Vitex trifolia, antibacterial
x
halaman
PRAKATA v
ABSTRAK viii
ABSTRACT ix
DAFTAR ISI x
DAFTAR TABEL xiv
DAFTAR GAMBAR xv
DAFTAR LAMPIRAN xviii
DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN xix
BAB I. PENDAHULUAN 1
A. Latar Belakang 1
B. Rumusan Masalah 5
C. Tujuan Penelitian 5
D. Manfaat Penelitian 6
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 7
A. Vitex trifolia L. 7
1. Klasifikasi tumbuhan 7
2. Nama daerah 7
3. Makroskopik tumbuhan 7
4. Kandungan kimia 8
5. Manfaat tanaman 8
B. Endofit 12
xi
1. Simbiosis mikroorganisme dan tanaman 13 2. Hubungan kekerabatan endofit dan tanaman 13
3. Fungsi endofit 14
4. Fungi endofit 15
5. Isolasi dan Kultur Fungi Endofit 20
C. Fermentasi 21
1. Kultur batch 22
2. Kultur fed-batch 23
3. Kultur kontinyu 24
D. Metabolit sekunder 26
E. Antimikroba 29
F. Ekstraksi 32
G. Kromatografi Lapis Tipis 35
H. Bioautografi 36
1. KLT Bioautografi kontak 37
2. KLT Bioautografi langsung 38
3. Bioautografi lapisan agar atau pencelupan 39
I. Polymerase Chain Reaction 41
1. DNA template 43
2. Primer 45
J. Analisis Filogenetik 50
1. Metode Maximum parsimony 58
2. Metode jarak / distance method 60
3. Metode Fitch dan Margoliash 62
4. Pendekatan maximum likehood 63
5. Metode neighbor-joining (NJ) 65
6. Metode unweighted pair group (UPGMA) 66
K. Staphylococcus aureus 67
1. Komponen dan produk 69
2. Epidemiologi 74
3. Patogenesis 76
4. Resisten terhadap beberapa obat 81
L. Kerangka Teori 83
M. Kerangka Konsep 84
BAB III. METODE PENELITIAN 85
A. Rancangan Penelitian 85
B. Waktu dan Lokasi Penelitian 85
C. Alat dan Bahan Penelitian 85
D. Metode Kerja 86
1. Penyiapan Sampel Penelitian 86
2. Isolasi Mikroba Endofit 86
3. Pemurnian Fungi Endofit 87
4. Uji Antagonis Fungi Endofit 87
5. Fermentasi 88
6. Ekstraksi Senyawa Metabolit 88
7. Uji Aktivitas AntiStaphylococcus aureus
Multi-Drug Resistant 89
xiii
8. Pengujian KLT Bioautografi 89
9. Identifikasi molekuler 89
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 93
A. Isolasi fungi endofit Vitex trifolia 93 B. Identifikasi molekuler fungi endofit Vitex trifolia 94 1. Isolasi DNA fungi endofit V. trifolia 94
2. Amplifikasi DNA 94
3. Sequencing DNA 96
4. Analisis Filogenetik 97
C. Uji antagonis fungi endofit V. trifolia terhadap
S. aureus MDR 98
D. Produksi senyawa bioaktif fungi endofit V. trifolia 98
E. KLT bioautografi 100
BAB V. PENUTUP 101
A. Kesimpulan 101
B. Saran 101
DAFTAR PUSTAKA 102
LAMPIRAN
xiv
nomor halaman
1 Mekanisme resistensi S. aureus terhadap antimikroba 82 2 Hasil identifikasi molekuler fungi endofit V. trifolia 97 3 Uji Aktivitas Antibakeri S. aureus MDR fungi endofit Vt2 100
xv
DAFTAR GAMBAR
nomor halaman
1 Jenis endofit dan proses kolonisasi akar 16
2 Sifat dasar endofit 17
3 Struktur senyawa bioaktif dari jamur endofit yang serupa
dengan senyawa tanaman inangnya 19
4 Skema fermentasi batch sederhana 23
5 Skema fermentasi fed-batch sederhana 24
6 Susunan fermentasi kontinyu yang dapat digunakan
di laboratorium 25
7 Struktur kimia dari beberapa senyawa bioaktif yang
dihasilkan oleh mikroba endofit 28
8 Skema Bioautografi Kontak 38
9 Skema Bioautografi Langsung 39
10 Skema Bioautografi lapisan agar atau pencelupan 40
11 Reduksi garam tetrazolium 40
12 Bagan proses Polymerase Chain Reaction 49
13 Asal urutan serupa 54
14 Struktur pohon evolusi 56
15 Kelompok sekuen yang ideal dengan panjang cabang pohon
yang diasumsikan oleh metode Fitch dan Margoliash 63 16 Pohon filogenetika DNA Maximum Likehood virus
Avian Influenza Eropa sangat patogen dan virus
Avian Influenza kurang patogen H7 64
17 Pohon filogenetika Neighbor-joining untuk urutan 16S RNA
dari spesies Lactobacillale 66
18 Scanning Electron Microscope (SEM) dari S. aureus
strain (ILRI_Eymole1/1) 68
19 Molekul virulensi S. aureus 71
20 Struktur dari S. aureus 73
21 Kecenderungan perkiraan jumlah bakteri MRSA dan
G3CREC di wilayah Eropa 75
22 In vitro Fagositosis Sel Endotelial pada S. Aureus 77 23 Patogenesis staphylococcus menginvasi jaringan 78 24 Fagositosis leukosit polimorfonuklear (PMN) dan proses
mikrobisida 80
25 Skema kerja 121
26 Fungi endofit daun V. trifolia pada media Potato Dextrosa
Agar 122
27 Isolat murni fungi endofit V. trifolia pada media Potato
Dextrosa Agar 122
28 Mikroskopik fungi endofit V. trifolia 123 29 Uji antagonis fungi endofit V.trifolia pada media
Mueller-Hinton Agar 124
30 Gel elektroforesis yang diwarnai oleh etidium bromida produk Polymerase Chain Reaction gen 28S rDNA,
primer LROR-LR5 125
31 Hasil penyejajaran DNA isolat fungi endofit Vt1 126 32 Hasil penyejajaran DNA isolat fungi endofit Vt2 127 33 Hasil penyejajaran DNA isolat fungi endofit Vt3 128 34 Hasil penyejajaran DNA isolat fungi endofit Vt4 129
35 Pohon filogenetik fungi endofit Vt1 130
36 Pohon filogenetik fungi endofit Vt2 131
xvii
37 Pohon filogenetik fungi endofit Vt3 132
38 Pohon filogenetik fungi endofit Vt4 133
39 Uji Aktivitas antibakteri S. aureus MDR ekstrak metabolit
fungi endofit Vt2 pada media Mueller-Hinton Agar 134 40 KLT Bioautografi ekstrak etil asetat Vt2 terhadap
S. Aureus MDR 135
41 Lembar uji kepekaan bakteri S. aureus MDR
terhadap antibiotika 136
42 Vitex trifolia L. 137
43 Starter Fermentasi Fungi Endofit 137
44 Fermentasi Fungi Endofit 137
45 McFarland Equivalence Turbidity Standard 138
46 Polymerase Chain Reaction 138
47 Sonicator 138
48 Proses partisi medium fermentasi dan cairan fermentasi 139
49 Proses freeze drying 139
xviii
nomor halaman
1 Skema kerja 121
2 Isolasi dan kultur fungi endofit 122
3 Mikroskopik fungi endofit V. trifolia 123
4 Uji antagonis fungi endofit V. trifolia 124 5 Amplifikasi DNA fungi endofit V. trifolia 125 6 Hasil penyejajaran DNA fungi endofit V. trifolia 126 7 Pohon filogenetik fungi endofit V. trifolia 130 8 Uji Aktivitas Antibakteri S. aureus MDR 134
9 Uji KLT bioautografi 135
10 Lembar uji kepekaan bakteri S. aureus MDR
terhadap antibiotika 136
11 Dokumentasi tesis 137
xix
DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN
Lambang / singkatan Arti dan keterangan
Aur aureolysin
blaZ gen untuk β-lactamase staphylococcus
BsaA glutathione peroxidase homolog
CD Cluster of Differentiation
cfu colony-forming unit
CHIPS chemotaxis inhibitory protein of staphylococcus
Clf clumping factor
Cna collagen adhesion
CPS capsule
Coa coagulase
CR complement receptor
dfrB dihydrofolate reductase
DNA deoxyribonucleic acid
dNTPs Deoxynucleotide triphosphates
Eap extracellular adherence protein
EARSS the European Antimicrobial Resistance Surveillance System
ECM extracellular matrix
Efb extracellular fibrinogen binding protein
Fc fragment crystallizable
FCαR reseptor afinitas tinggi untuk daerah Fc immunoglobulin A
FcγRI reseptor afinitas tinggi untuk daerah Fc immunoglobulin G
FcεRI reseptor afinitas tinggi untuk daerah Fc immunoglobulin E
FLIPr formyl peptide receptor-like 1 inhibitory protein fMLP N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine FnBPAB fibronectin binding protein A and B G3CREC third-generation cephalosporin-resistant
Eschericia coli
Hla a-hemolysin
HlgABC gamma-hemolysin subunits A, B, and C
HOCl hypochlorous acid
hpCF alkyl hydroperoxide reductase subunits C and F IcaADBCR intercellular adhesin subunits A, D, B, C, and R;
ICAM intercellular adhesion molecules
IgA Immunoglobulin A
IgE Immunoglobulin E
IgG Immunoglobulin G
Isd iron-regulated surface determinant
KatA catalase
LTA lipoteichoic acid
Luk leukocidin
mecA Gen yang terdapat pada sel bakteri yang memungkinkan bakteri resisten terhadap antibiotik seperti methicillin, penisilin dan antibiotik lain seperti penisilin (Ubukuta dkk., 1989)
xxi
MHC major histocompatibility complex
MPO myeloperoxidase
MprF multiple peptide resistance factor
MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MSCRAMM Microbial Surface Components Recognizing
Adhesive Matrix Molecules
MSSA Methicillin-Sensitif Staphylococcus aureus
OatA O-acetyltransferase A
PBP2a penicillin-binding protein 2a
PFT platelet–fibrin thrombi
PMN leukosit polimorfonuklear
PSM phenol-soluble modulin
PVL Panton-Valentine leukocidin
QRDR quinolone resistance–determining region
RNA Ribonucleic acid
ROS reactive oxygen species
Sak staphylokinase
Sbi staphylococcal IgG-binding protein SCIN staphylococcal complement inhibitor SdrCDE Ser-Asp rich fibrinogen/bone sialoprotein-
binding protein subunits C, D, and E
SE staphylococcal enterotoxin
SOD superoxide dismutase
Spa staphylococcal protein A
SCCmec staphylococcal cassette chromosome mec SSL staphylococcal superantigen-like protein
SXN staphyloxanthin
TNF- tumor necrosis factor-
TrxAB thioredoxin (TrxA) and thioredoxin reductase (TrxB)
TSST-1 toxic shock syndrome toxin 1 VCAM vascular-cell adhesion molecules
VISA vancomycin intermediate-resistant S. aureus vWbp von Willebrand factor binding protein
WTA wall techoic acid
1 BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Penyakit infeksi merupakan salah satu masalah kesehatan terbesar tidak saja di Indonesia, tetapi juga di seluruh dunia. Infeksi dapat disebarkan oleh personal atau lingkungan melalui kontak langsung maupun tidak langsung. Selain virus, bakteri juga tidak kalah pentingnya dalam menyebabkan penyakit infeksi. Penyakit infeksi juga merupakan penyebab utama kematian di dunia (Mardiastuti dkk., 2007).
Infeksi kulit dan jaringan lunak merupakan salah satu masalah penting yang masih belum terselesaikan. Salah satu genus bakteri penyebab infeksi kulit dan jaringan lunak adalah genus Staphylococcus (Otto, 2010). Staphylococcus aureus adalah spesies yang paling patogen dari genus Staphylococcus yang terlibat dalam infeksi nosokomial. Bakteri ini secara asimptomatis sering berkolonisasi di kulit dan selaput lendir individu sehat, khususnya bagian nares anterior (Wertheim, 2005;
Crossley & Archer, 1997). Diperkirakan sekitar 20 hingga 30% dari populasi secara permanen dikolonisasi oleh bakteri ini, sementara 30%
lainnya bersifat sementara (Wertheim, 2005; Peacock, 2001). Kolonisasi ini merupakan peningkatan resiko infeksi dengan tersedianya sumber nutrisi bakteri ketika daya tahan tubuh suatu individu menurun (Kluytmans, 1997).
S. aureus secara alami rentan terhadap hampir setiap antibiotik yang pernah dikembangkan. Resistansi sering diperoleh melalui transfer horizontal untuk gen dari sumber luar, meskipun kromosom mutasi dan seleksi antibiotik juga sangat penting. Kerentanan dari S. aureus ini yang menyebabkan penemuan penisilin dari Alexander Fleming yang mengantarkan penisilin sebagai obat ajaib di era antibiotik yang dapat menyembuhkan infeksi fatal secara merata. Namun, pada pertengahan 1940-an, hanya beberapa tahun setelah diperkenalkan ke dalam praktek klinis, resistensi penisilin ditemui di rumah sakit dan dalam satu dekade itu telah menjadi masalah yang signifikan dalam masyarakat. S. aureus memiliki kemampuan untuk memperoleh resistensi terhadap beberapa antibiotik (Chambers & De Leo, 2009).
Salah satu sumber senyawa bioaktif adalah mikroba endofit terutama fungi endofit yang hidup dan berkoloni dalam tanaman. Mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif yang sangat potensial untuk dikembangkan menjadi obat. Terdapat beberapa senyawa aktif yang telah dilaporkan dapat diperoleh melalui kultur fungi endofit diantaranya senyawa taxol dari Taxomyces andreanae (Stierle dkk., 1993), alkaloid camptothecin (C20H16N2O4) dari Entrophospora infrequens yang menghuni Nothapodytes foetida (Puri dkk. 2005), pestacin dan isopestacin, senyawa antioksidan dari Pestalotiopsis microspora yang berada di Terminalia morobensis (Strobel dkk., 2002). Senyawa imunomodulator Subglutinol-A (C27H38O4) dan Subglutinol-B dari jamur
3
endofit Fusarium subglutinans, yang menempati Tripterygium wilfordii (Lee dkk., 1995), dan senyawa siklosporin immunosuppressant diisolasi dari Tolypocladium inflatum (Borel & Kis, 1991).
Beberapa endofit diketahui memiliki senyawa antimikroba. Telah dilaporkan bahwa sebuah derivatif baru α-tetralone (3S)-3,6,7-trihidroksi- α-tetralone bersama-sama dengan cercosporamide, β-sitosterol dan trichodermin diproduksi oleh endofit Phoma sp. dari Arisaema erubescens yang menunjukkan aktivitas antijamur dan antibakteri terhadap jamur patogen Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporioides dan Magnaporthe oryzae serta terhadap dua bakteri patogen tanaman Xanthomonas campestris dan Xanthomonas oryzae (Wang dkk., 2012). Senyawa polyketide 5-hydroxyramulosin (C10H14O4) dilaporkan menghambat jamur patogen Aspergillus niger. Senyawa terpenoid dengan aktivitas antibakteri diketahui diperoleh dari etil asetat fraksi dari Phomopsis sp. suatu endofit dari tanaman Plumeria acutifolia Poiret (Nithya & Muthumary, 2010). Antibakteri naphthaquinone Javanicin (C15H14O6) menunjukkan aktivitas terhadap Pseudomonas sp. diisolasi dari Chloridium sp. endofit dari Neem (Kharwar dkk., 2008).
Genus Vitex terdiri dari lebih 270 spesies di seluruh dunia dengan konstituen aktif obat yang beragam. Spesies ini sebagian besar merupakan semak atau pohon yang ditemukan di daerah tropis dan subtropis. Spesies lain dengan buah-buahan, biji, dan juga akar penting sebagai obat tradisional. Di India, ditemukan beberapa spesies Vitex yaitu
Vitex negundo, Vitex glabrata, Vitex leucoxylon, Vitex peduncularis, Vitex pinnata, dan Vitex trifolia L. Banyak spesies Vitex ini telah dipelajari untuk penyelidikan farmakognostik, skrining fitokimia, biologi, dan efek farmakologis (Laxmikant, 2012).
Vitex trifolia L. merupakan tanaman suku verbenaceae yang telah diteliti mengandung senyawa kastisin, luteolin, isoorientin, α-pinene, linalool, terpinyl asetat, β-caryophylline, caryophylline oksida, 5-methyl artemitin, dan 7-desmethyl artemitin (Nair dkk., 1975), β-sitosterol, vitetrifolin, dihydrosolidgenon abietatrien, essentials oil (Pan dkk., 1989) seperti limonene, humulene oxide, (4R,5R)-caryophylline-oxide, α- humulene, 20-hydroxyecdysone, ecdysteroid, flavonoid, lignin, triterpenoid, iridoid, vitexin, β-sitosterol, flavone glycoside (Ramesh dkk., 1986), labdane diterpene; vitexilactone; vitextrifolin-D; vitextrifolin-E;
vitextrifolin-A, (rel 5S,6R,8R,9R,10S)-6-asetoksi-9-hidroksi-13(14)-labden- 16,15-olida; (Zeng dkk., 1996), viteosin-A; vitexicarpin; 3,6,7-trimetil kuersetagetin; luteolin-7-O-β-D-glukuronida; luteolin-3-O-β-D-glukuronida, rotundifuran; heptatriacontane; β-sitosterol-β-D-glukosida (Vedantham &
Subramanian, 1976; Alam dkk., 2002). Pada penelitian yang dilakukan Kurniatama (2014) diperoleh enam isolat fungi endofit V. trifolia dan satu diantaranya diduga aktif sebagai antimikroba yaitu V-R2 namun belum teridentifikasi genus fungi endofitnya.
Salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies fungi endofit yaitu dengan menggunakan teknik Polymerase
5
Chain Reaction (PCR). PCR merupakan teknik cepat untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik secara in vitro yang pertama kali dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1985. Dengan teknik ini sejumlah kecil fragmen DNA fungi endofit yang diinginkan akan diamplifikasi secara eksponensial sampai jutaan kali salinan dalam waktu yang relatif singkat (Handoyo & Rudiretna, 2001).
Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan senyawa bioaktif hasil fermentasi fungi endofit tanaman V.trifolia yang dapat menghambat Staphylococcus aureus Multi-Drug Resistant (MDR) dan gambaran filogenetik fungi endofit.
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan pada latar belakang yang telah diuraikan sebelumnya, maka rumusan masalah dalam penelitian ini adalah:
1. Spesies fungi endofit apakah yang dapat diisolasi dari tanaman V.trifolia?
2. Apakah fungi endofit dari V. trifolia dapat menghasilkan senyawa antibakteri S. aureus MDR?
3. Golongan senyawa anti antibakteri S. aureus MDR apakah yang dihasilkan oleh fungi endofit V. trifolia?
C. Tujuan Penelitian
1. Mengidentifikasi fungi endofit dari V. trifolia berdasarkan hasil Polymerase Chain Reaction.
2. Mengetahui kemampuan fungi endofit dari V. trifolia untuk menghasilkan senyawa antibakteri S. aureus MDR.
3. Menentukan golongan senyawa antibakteri S. aureus MDR yang dihasilkan oleh fungi endofit V. trifolia.
D. Manfaat Penelitian
Identifikasi fungi endofit secara molekuler dan aktivitas antibakteri S. aureus MDR metabolit sekunder yang dihasilkannya memberikan informasi tentang potensi antibakteri metabolit mikroba endofit terhadap bakteri S. aureus MDR. Metabolit sekunder fungi endofit dapat dijadikan sebagai senyawa penuntun (lead compound) sintesis senyawa antimikroba atau analog senyawa pada tanaman.
7 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Vitex trifolia L.
1. Klasifikasi tumbuhan (Backer & Backhuizen, 1963) Divisi : Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Ordo : Tubiflorae Famili : Verbenaceae Genus : Vitex
Spesies : Vitex trifolia L.
2. Nama Daerah
Langgundi (Minangkabau), gandasari (Palembang), lagundi (Melayu), lagondi (Sunda), legundi (Jawa Tengah), langghundi (Madura), galumi (Sumba), sangari (Bima), lanra (Makassar) (de Padua dkk., 1999)
3. Makroskopik tumbuhan
Tumbuhan berupa semak belukar atau pohon kecil, dapat tumbuh dari 1 sampai 4 meter tingginya, dan batang ditutupi oleh rambut halus (Laxmikant, 2012). Daun teratur sepanjang batang dan biasanya majemuk, yang terdiri dari 3 helai daun linier yang berkisar antara 1 sampai 12 cm, Panjang tangkai daun sekitar 5 mm. Bentuk
daun bundar telur, bundar telur terbalik, atau lonjong. Permukaan atas daun berwarna hijau dan permukaan bawah hijau keabu-abuan.
Memiliki bunga warna biru ungu, Bagian luar kelopak bunga penuh dengan bulu, tersusun rapat, berwarna kelabu. Bagian luar berbulu kelabu kecuali pangkal (Padmalatha dkk., 2009).
4. Kandungan kimia
V. trifolia mengandung kastisin, luteolin, isoorientin, α-pinene, linalool, terpinyl asetat, β-caryophylline, caryophylline oksida, 5-methyl artemitin, dan 7-desmethyl artemitin (Nair dkk., 1975), β-sitosterol, vitetrifolin, dihydrosolidgenon abietatrien, essentials oil (Pan dkk., 1989) seperti limonene, humulene oxide, (4R,5R)-caryophylline-oxide, α-humulene, 20-hydroxyecdysone, ecdysteroid, flavonoid, lignin, triterpenoid, iridoid, vitexin, β-sitosterol, flavone glycoside (Ramesh dkk., 1986), labdane diterpene; vitexilactone; vitextrifolin-D;
vitextrifolin-E; vitextrifolin-A, (rel 5S,6R,8R,9R,10S)-6-asetoksi-9- hidroksi-13(14)-labden-16,15-olida; (Zeng dkk., 1996), viteosin-A;
vitexicarpin; 3,6,7-trimetil kuersetagetin; luteolin-7-O-β-D-glukuronida;
luteolin-3-O-β-D-glukuronida, rotundifuran; heptatriacontane; β- sitosterol-β-D-glukosida (Vedantham & Subramanian, 1976; Alam dkk., 2002).
5. Manfaat tanaman
V. trifolia dapat digunakan sebagai antipiretik yang dibuktikan dari pemberian ekstrak heksan dan kloroform biji V. trifolia secara oral
9
menunjukkan efek antipiretik yang ringan pada hewan kelinci yang diinduksi ragi (yeast) (Ikram dkk., 1987). Ekstrak diklorometan daun V.trifolia efektif terhadap Spodoptera frugiperda (Nocturidae), yang merupakan hama pada tanaman jagung, gandum, kedelai maupun tanaman hias (Hernández dkk., 1999). Ekstrak n-heksana maupun etanol daun V. trifolia dilaporkan memiliki efek penghambatan pelepasan histamin yang diinduksi IgE pada sel RBL-2H3 (rat basophilic leukemia cell line), analog tumor dari sel mast masing- masing sebesar 80 dan 70 %. Kedua ekstrak daun V. trifolia tidak menunjukkan stimulasi histamin pada sel RBL-2H3 tanpa diinduksi IgE (Spontaneous histamine release). Hal ini mengindikasi bahwa ekstrak daun V. trifolia tidak menginduksi histamin secara spontan, dan dapat menghambat pelepasan histamin in vitro (Ikawati dkk., 2001).
Ekstrak air dari buah V. trifolia var. simplicifolia Cham.
(V.rotundifolia) memiliki aktivitas terhadap reaksi allergi tipe segera (immediately type allergic reaction) baik in vitro maupun in vivo.
Ekstrak tanaman (10–3 – 1,0 mg/ml) tersebut dapat menghambat pelepasan histamin dari sel mast peritoneal tikus yang diinduksi baik dengan compound 48/80 ataupun IgE anti-DNP. Ekstrak tanaman V.trifolia var. simplicifolia Cham. diduga mengandung banyak polisakarida anionik dan tanin yang dapat mempengaruhi aktivasi protein-G sehingga dapat menghambat pelepasan histamin. Lebih lanjut, esktrak tersebut juga menghambat produksi tumor necrosis
factor alpha (TNF-α) pada sel mast peritoneal tikus yang diinduksi IgE.
TNF-α sel mast merupakan mediator penting dalam proses inflammasi. Penelitian in vivo, ekstrak tanaman V. trifolia var.
simplicifolia Cham. menhambat reaksi allergi sistemik yang diinduksi compound 48/80 maupun reaksi anafilaksis kutaneus pasif yang diinduksi Ig-E antidinitrofenil (DNP) (Shin dkk., 2000).
Ekstrak n-heksan dan diklorometan daun V. trifolia juga menunjukkan aktivitas antifungi. Ekstrak n-heksan menunjukkan aktivitas optimum pada spesies Fusarium sp. dengan menghambat 100 % selama 2 hari masa pertumbuhan, sedangkan ekstrak diklorometan hanya menghambat 54 % pertumbuhan. Namun, ekstrak n-heksan tidak menunjukkan aktivitas antifungi terhadap Aspergillus parasiticus, sedangkan ekstrak diklorometan mampu menghambat 30
% pertumbuhan. Kedua ekstrak tersebut menunjukkan penghambatan 20 sampai 30 % pertumbuhan terhadap Penicillium sp., Aspegillus flavus, dan Tricoderma sp. (Hernández dkk., 1999).
Ekstrak petroleum eter maupun etanol daun V. trifolia menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap bakteri gram positif (Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Sarcina lutea, dan Staphylococcus aureus) maupun negatif (Aerohydrophylla sp., Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B, Shigella boydii, Shigella Dysenteriae, Shigella Flexneri, Shigella Sonnei, Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa, Vibrio
11
cholerae, Vibrio mimicus, dan Vibrio parahaemolyticus) (Hossain dkk., 2001). Penelitian lain menyebutkan bahwa ekstrak (n-heksan, diklorometan dan metanol) daun V. trifolia dapat menghambat pertumbuhan bakteri baik gram positif (Staphylococcus aureus dan Streptococcus faecalis) maupun gram negatif (Escherichia coli, Proteus mirabilis, dan Shigella sonei). Sedangkan terhadap Salmonella tiphy, hanya ekstrak diklorometan yang menunjukkan efek antibakteri sedangkan ekstrak n-heksan dan metanol tidak menunjukkan efek antibakteri (Hernández dkk., 1999).
Hernández dkk. (1999) telah meneliti aktivitas sitotoksik ekstrak heksan, diklorometan dan metanol terhadap empat sel tumor manusia yaitu sel karsinoma leher, sel karsinoma ovarium, sel karsinoma kolon dan sel nasofaringeal manusia. Li dkk. (2005a) berhasil menemukan lima senyawa aktif antikanker diterpen tipe labdan in vitro dengan metode bioassay-guided separation yaitu viteksilakton (1), (rel 5S,6R,8R,9R,10S)-6-asetoksi-9-hidroksi-13(14)-labden-16,15-olida(2), rotundifuran (3), vitetrifolin D (4), dan vitetrifolin E (5). Selanjutnya, enam flavonoid yang diisolasi dari V. trifolia yaitu persikogenin (1), artemetin (2), luteolin (3), penduletin (4), viteksikarpin (5) dan krisosplenol-D (6) mampu menghambat proliferasi sel kanker tsFT210 tikus dengan IC50s (µg/ml-1) >100 (tingkat penghambatan pada 100 µg/ml-1, 47.9%) untuk (1), >100 (tingkat penghambatan pada 100 µg/ml-1, 49,6%) untuk (2), 10,7 untuk (3), 19,8 untuk (4) , 0,3 untuk (5),
dan 3.5 untuk (6) dengan mekanisme penghambatan siklus sel dan menginduksi apoptosis (Li dkk., 2005b).
Ekstrak heksan V.trifolia menunjukkan aktivitas trakeospasmolitik. Dengan metode bioassay-guided fractionation dapat diidentifikasi senyawa-senyawa aktifnya yaitu viteosin-A dan viteksikarpin. Kedua senyawa tersebut dapat mengeblok kontraksi trakea marmut terisolasi yang diinduksi histamin. Akan tetapi, hanya viteksikarpin yang aktif terhadap kontraksi trakea yang disensitisasi ovalbumin. Dari penelitian tersebut, viteksikarpin diduga menghambat pelepasan histamin dari sel mast pada organ trakea marmut maupun mengeblok aksi histamin dalam mengkontraksi trakea marmut (Alam dkk., 2002).
B. Endofit
Endofit adalah mikroorganisme yang menghabiskan seluruh atau sebagian dari siklus hidupnya di dalam jaringan sehat tanaman inang (Sturz dkk., 2000). Definisi lain dari endofit adalah mikroorganisme yang dapat diisolasi dari jaringan tanaman yang didesinfeksi permukaan atau diambil dari dalam tumbuhan, dan tidak membahayakan inang (Hallman dkk., 1997).
Endofit pertama kali dijelaskan oleh ahli botani Jerman Heinrich Friedrich Link pada tahun 1809. Pada saat itu, mereka disebut Entophytae dan digambarkan sebagai kelompok yang berbeda dari sebagian jamur parasit yang hidup di tumbuhan. Endofit dianggap sebagai jamur parasit
13
tanaman dan kemudian disebut sebagai microzymas oleh ilmuwan Prancis, Béchamp. Pendapat awal dikatakan bahwa tanaman sehat adalah tanaman di bawah kondisi steril dan baru pada tahun 1887 ketika Victor Galippe menemukan bakteri yang biasanya ada di bagian dalam jaringan tanaman yang perannya menguntungkan tanaman tersebut diterima sebagai kenyataan (Hardoim dkk., 2015).
1. Simbiosis mikroorganisme dan tanaman
Berbagai kelompok bakteri dan jamur berinteraksi dengan tanaman yang lebih tinggi. Hubungan genetik antara asosiasi tanaman dengan jamur mikoriza arbuskular dan simbiosis akar ditemukan. Kanamori, dkk. (2006) menunjukkan adanya simbiosis gen tumbuhan nukleoporin Lotus japonicas, Nup133, dengan jalur transduksi sinyal yang dimiliki oleh bakteri Rhizobium dan jamur mikoriza arbuskular yang mengkolonisasinya. Hal ini menunjukkan bahwa sebagian segmen populasi endofit bakteri dan jamur saling terkait satu sama lain dan dengan inangnya. Interaksi mutualistik yang mengarah pada manfaat adaptif bagi keduanya berevolusi ke bentuk yang lebih kompleks, yang melibatkan lebih dari dua hubungan simbiosis (Frey-Klett dkk., 2011).
2. Hubungan kekerabatan endofit dan tanaman
Mikroorganisme dapat terikat secara ketat pada tanaman dan menyelesaikan sebagian besar atau bahkan seluruh siklus hidupnya di dalam tanaman. Mikroorganisme yang memerlukan jaringan tanaman untuk menyelesaikan siklus hidupnya diklasifikasikan sebagai obligat.
Contoh endofit obligat yang terekam dengan baik ditemukan di antara jamur mikoriza (Parniske, 2008) dan anggota genus Epichloë, dan Neotyphodium, dari keluarga Clavicipitaceae (Ascomycota) (Schardl dkk., 2004). Pada keadaan ekstrem lainnya adalah endofit oportunistik yang terutama berkembang di luar jaringan tanaman (epifit) dan secara sporadis memasuki endosfer tanaman (Hardoim, dkk., 2008). Di antaranya adalah yang memiliki rhizosfer, seperti bakteri Pseudomonas (Gnanamanickam & Immanuel, 2007) dan Azospirillum (Bashan & de- Bashan, 2010) dan jamur dari genera Hypocrea dan Trichoderma (Druzhinina, dkk., 2011).
3. Fungsi endofit
Beberapa endofit tidak memiliki efek nyata pada kinerja tanaman namun hidup pada metabolit yang dihasilkan oleh inang yang disebut endofit komensal. Sedangkan endofit lainnya memberikan efek menguntungkan pada tanaman, seperti perlindungan terhadap patogen dan herbivora (arthropoda), baik melalui antibiosis atau melalui resistensi yang diinduksi, dan mendukung pertumbuhan tanaman (Gambar 2). Kelompok lain menyebutkan endofit Pseudomonas syringae yang diperoleh dari Corylus avellana L. mampu menghalau hama wereng (Scortichini & Loreti, 2007). Umumnya, endofit dapat memiliki efek netral atau merugikan pada tanaman inang di bawah kondisi pertumbuhan normal. Di samping itu mereka dapat bermanfaat pada kondisi yang lebih ekstrem atau selama fase siklus tanaman yang
15
berbeda. Misalnya, Fusarium verticillioides memiliki peran ganda baik sebagai patogen maupun sebagai endofit bermanfaat dalam jagung (Bacon dkk., 2008). Keseimbangan antara keduanya tidak hanya bergantung pada genotipe inang, tetapi juga pada faktor stres abiotik lokal yang mengurangi daya tahan tubuh, yang mengakibatkan distorsi keseimbangan yang rumit dan dalam terjadinya gejala penyakit pada tanaman dan produksi mikotoksin oleh jamur (Bacon dkk., 2008).
Namun, efek menguntungkan juga telah ditunjukkan, misalnya, strain jamur endofit F. verticillioides menekan pertumbuhan jamur patogen lain, Ustilago maydis, yang melindungi inang mereka terhadap penyakit (Estrada dkk., 2012).
4. Fungi endofit
Fungi endofit adalah jamur yang mengkolonisasi jaringan tanaman hidup tanpa menimbulkan efek negatif langsung (Hirsch & Braun, 1992). Hubungan antara fungi endofit dengan tumbuhan inangnya dapat berupa parasitisme, komensalisme, dan mutualisme (Stone dkk., 2004). Tanaman yang mengandung endofit sering tumbuh lebih cepat dari tanaman yang tidak terinfeksi. Efek ini terjadi karena endofit memproduksi fitohormon seperti indole-3-acetic acid (IAA), sitokin, dan senyawa pemacu pertumbuhan lain. Selain itu endofit dapat membantu inang dalam mengambil nutrisi seperti nitrogen dan fosfor (Tan & Zou, 2001).
Gambar 1. Jenis endofit dan proses kolonisasi akar. Kejadian stokastik dan faktor bakteri deterministik mendorong kolonisasi endosfer, di mana serangkaian kejadian, termasuk pembentukan mikrokolon di permukaan akar, diperkirakan terjadi. Bakteri penghuni tanah bisa menjadi endofit secara kebetulan (melalui kolonisasi luka alami atau setelah invasi akar oleh nematoda). Bakteri tersebut dianggap sebagai endofit penumpang (sel merah) dan seringkali terbatas pada jaringan korteks akar. Endofit oportunistik (sel biru) menunjukkan karakteristik kolonisasi akar tertentu (misalnya respons kemotatik, yang memungkinkan mereka untuk mengkolonisasi rhizoplane dan kemudian menyerang jaringan tanaman internal melalui retak yang terbentuk di lokasi munculnya akar lateral dan ujung akar). Namun, seperti yang terjadi pada endofit penumpang, endofit oportunistik terbatas pada jaringan tanaman tertentu (misalnya korteks akar). Endofit yang kompeten (sel kuning) diusulkan untuk memiliki semua sifat endophytes oportunistik, dan, selain itu, disesuaikan dengan baik dengan lingkungan tanaman. Mereka mampu menyerang jaringan tanaman tertentu, seperti jaringan vaskular, menyebar ke seluruh pabrik dan, dengan memanipulasi metabolisme tanaman, menjaga keseimbangan yang harmonis dengan tuan rumah tanaman, bahkan ketika mereka hadir dalam kepadatan tinggi (Hardoim, dkk., 2008)
17
Fungi endofit telah beradaptasi terhadap lingkungan hidup mereka secara bertahap dengan berbagai variasi genetik, termasuk penyerapan beberapa segmen DNA tanaman menjadi genom mereka sendiri, serta penyisipan mereka segmen DNA sendiri ke dalam genom inang (Zhao dkk, 2010).
Gambar 2. Sifat dasar endofit. Panel kiri menunjukkan tanaman yang dikolonisasi (In) dengan mikroorganisme bermanfaat yang secara signifikan meningkatkan pertumbuhan tanaman dibandingkan dengan tanaman yang tidak diinokokulasi (Ni). Berbagai mikroorganisme, khususnya bakteri (orange) dan jamur (ungu), bisa mengkolonisasi jaringan internal tanaman (panel tengah). Begitu berada di dalam tanaman, bakteri endofitik dan jamur berinteraksi secara dengan sel tumbuhan dan dengan mikroorganisme sekitarnya (panel besar). Jamur endofit, yang diwakili di sini sebagai jamur mikoriza arbuskular (AMF) (lilac), dapat membentuk struktur khusus, yang disebut arbuscules, di mana sumber karbon yang berasal dari tanaman, terutama sukrosa (Su), ditukar dengan fosfat yang dikonsumsi jamur (Pi), nitrogen (NH4+), dan kalium (K+) elemen (biru). Sukrosa sitoplasma tumbuh diangkut ke ruang periarbuscular, dimana diubah menjadi hexose (HEX) untuk diasimilasi oleh jamur. Hexose akhirnya diubah menjadi glikogen (G) untuk transportasi jarak jauh. Fosfat dan nitrogen diangkut di
dalam sitoplasma jamur sebagai butiran polifosfat (Poly-P), yang dikonversi menjadi Pi dan arginin (Arg) dalam keadaan darurat. Pi diangkut ke sitoplasma inang, sedangkan Arg awalnya dikonversi menjadi urea (Ur) dan kemudian menjadi amonium (NH4+). Hormon tumbuhan jamur dan bakteri, seperti auxins (IAA), gibberelin (GA), sitokinin (CKs), senyawa organik volatil (VOC), dan poliamina (Poli- NH), serta metabolit sekunder (SM), dipindahkan ke Tuan rumah (violet). Berbagai struktur bakteri, seperti flanella, pili, mesin sistem sekresi (misalnya, TIV SS dan SEC), dan lipopolisakarida, serta protein dan molekul yang diturunkan dari bakteri, seperti efektor (EF), autoinduser, dan antibiotik, terdeteksi oleh Sel inang dan memicu respons resistensi sistemik (ISR) yang diinduksi (merah).
ACC, prekursor langsung ethylene (ET), dimetabolisme oleh bakteri melalui enzim ACC deaminase (ACCd), sehingga memperbaiki tegangan abiotik (hijau muda). Berbagai enzim detoksifikasi spesies oksigen reaktif (ROS detox) juga dapat memperbaiki stres akibat tanaman (orange). Diazotrophic bacterial endophytes mampu memenuhi nitrogen atmosfir (N2) dan diduga secara aktif mengangkut NH4+ Dan nitrat (NO3+) ke inang (hijau tua). Proses produksi siderophore (Sid) oleh bakteri dan serapan (Fe) yang terlibat dalam promosi pertumbuhan tanaman, biokontrol, dan fitoremediasi ditunjukkan pada warna coklat. Contoh berbagai substrat dimana protein transmembran diperkaya di antara endofit ditunjukkan dalam warna kuning. Regulator transkripsional (TR) juga ditunjukkan (orange). Komunikasi dan interaksi antara sel mikroorganisme yang tinggal di dalam jaringan tanaman dipromosikan oleh faktor pertumbuhan (GF), antibiotik (A) dan molekul autoinducer (Hardoim dkk., 2015).
Terdapat beberapa senyawa yang dimiliki oleh tumbuhan inang yang telah diperoleh melalui kultur fungi endofit diantaranya senyawa taxol dari tumbuhan Taxus brevifolia diisolasi dari fungi endofit Taxomyces andreanae yang berfungsi sebagai anti kanker (Stierle dkk., 1993). Asam Torreyanic (C38H44O12) sebuah dimer kuinon, dihasilkan dari endofit Pestalotiopsis Microsporum terisolasi dari Torreya taxifolia.
Asam Torreyanic merupakan agen sitotoksik kuat dan ditemukan untuk menjadi lebih efisien (5-10 kali) di baris sel yang sensitif terhadap protein kinase C agonis; menyebabkan kematian sel oleh apoptosis (Lee dkk.
1996). Vincristine (C46H56N4O10), alkaloid dengan aktivitas sitotoksik
19
diisolasi dari sterilia miselia endofit yang menghuni Catharanthus roseus (Yang dkk., 2004).
Gambar 3. Struktur senyawa bioaktif dari jamur endofit yang serupa dengan senyawa tanaman inangnya (Ding, 2009; Yang dkk, 2004; Stierle dkk, 1993)
Produksi senyawa bioaktif oleh endofit secara langsung berkaitan dengan evolusi pada mikroorganisme, yang mungkin telah menggabungkan informasi genetik dari tumbuhan tingkat tinggi, yang memungkinkan mereka untuk lebih baik beradaptasi dengan tumbuhan inang. Endofit merupakan synthesizer kimia di dalam tumbuhan atau sebagai sistem pengatur mikroorganisme untuk menghasilkan senyawa
Asam Torreyanic Vincristine
Paclitaxel
bioaktif dengan toksisitas rendah terhadap organisme yang lebih tinggi (Pimentel dkk, 2011).
5. Isolasi dan Kultur Fungi Endofit
Metode yang paling umum digunakan untuk mendeteksi dan mengukur jamur endofit adalah isolasi dari jaringan induk yang disterilkan permukaannya (Stone dkk., 2004). Untuk persediaan keragaman spesies, saat ini merupakan pendekatan yang paling praktis, walaupun ahli biologi jamur mengetahui bahwa kelompok tertentu (misalnya biotrof obligat) mungkin tidak terdeteksi atau kurang terwakili dan isolat yang gagal diobati dalam kultur mungkin perlu dicirikan dengan cara lain . Deteksi organisme dari dasar alami dan identifikasi mereka dipengaruhi oleh prosedur pengambilan sampel, metode isolasi, komposisi media kultur, dan adaptasi fisiologis jamur (Stone dkk., 2004). Dalam beberapa kasus, masalah tersebut dapat diatasi dengan membandingkan kultur yang diperoleh dari isolasi jaringan dengan data dari negara-negara sporulasi pada jaringan inang (Bills & Peláez, 1996). Metode lain untuk identifikasi adalah taksonomi molekuler (Stone dkk., 2004).
Investigasi pola kolonisasi dan struktur komunitas jamur yang didasarkan pada data isolasi ditafsirkan dengan hati-hati. Dimensi unit sampling sangat penting mengingat skala mikroskopis dari distribusi jamur. Untuk analisis dominasi dan keragaman spesies, peneliti harus mengetahui proporsi relatif individu yang ada. Metode isolasi dapat
21
memberikan perkiraan hubungan ini, namun pemeriksaan mikroskopis langsung terhadap infeksi endofit sering menunjukkan bahwa lebih banyak infeksi individual hadir daripada yang dapat dideteksi dengan menggunakan ukuran segmen jaringan yang dapat diatur (Stone, 1987). Demikian pula, diseksi serial dan plating bahan inang hanya memberikan perkiraan informasi tentang pola kolonisasi inang; Mungkin tidak mungkin untuk membedakan antara kolonisasi sistemik jaringan bersebelahan dengan satu infeksi atau beberapa infeksi oleh spesies yang sama dimana domain infeksi sangat kecil sehubungan dengan ukuran unit sampel (Stone, 1987; Carroll, 1995). Mikroskop langsung juga dapat menunjukkan bahwa jaringan inang internal tidak selalu dijajah oleh semua jamur yang diisolasi dari jaringan steril permukaan (Viret & Petrini, 1994). Idealnya, pengamatan dari pemeriksaan langsung jaringan yang terinfeksi harus digunakan untuk mengkonfirmasi pola yang terdeteksi oleh sterilisasi permukaan dan kultur murni (Cabral dkk., 1993).
C. Fermentasi
Fermentasi industri adalah penggunaan disengaja fermentasi oleh mikroorganisme seperti bakteri dan jamur serta sel eukariotik seperti sel serangga dan sel ovarium hamster China (CHO), untuk membuat produk yang berguna bagi manusia. Produk fermentasi memiliki fungsi sebagai makanan serta industri umum. Beberapa bahan kimia komoditas, seperti asam asetat, asam sitrat, dan etanol dibuat melalui proses fermentasi
(Chisti, 1999). Terdapat tiga jenis teknik fermentasi, antara lain (McNeil &
Harvey, 2008) : 1. Kultur batch
Sistem batch merupakan teknik yang paling sederhana dan sering digunakan di laboratorium untuk mendapatkan jumlah besar sel atau produk untuk analisa lebih lanjut. Fermentasi batch adalah sebuah sistem tertutup, di mana semua nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan dan produk pembentukan organisme sudah terkandung dalam wadah pada awal proses fermentasi. Wadah dapat berupa labu terkocok, wadah penggunaan tunggal sekali pakai, atau bioreaktor untuk kontrol parameter yang lebih ketat dari seperti transfer oksigen, pH, agitasi, dll. Secara historis, proses ini akan melibatkan sistem non steril dengan inokulan pilihan atau alami. Namun, hampir saat ini semua proses fermentasi melibatkan inokulasi strain yang dipilih dan khusus yang dibiakkan dari mikroba, tanaman atau sel hewan ke dalam medium steril diadakan dalam sebuah wadah fermentor steril.
Setelah sterilisasi media, organisme diinokulasi ke dalam wadah dan dibiarkan tumbuh. Fermentasi dihentikan ketika satu atau lebih dari berikut ini telah tercapai: (a) pertumbuhan mikroba telah berhenti karena penipisan nutrisi atau membangun senyawa beracun; (b) setelah sampai waktu periode yang telah ditentukan; (c) konsentrasi produk yang diinginkan telah tercapai (McNeil & Harvey, 2008).
23
Gambar 4. Skema fermentasi batch sederhana. Sistem ini tertutup, yang berisi semua nutrisi yang dibutuhkan oleh organisme sebelum inokulasi, kecuali untuk kebutuhan gas, yang terus menerus ditambahkan ke, dan dipindahkan dari, reaktor melalui sterilisasi kelas filter hidrofobik (McNeil & Harvey, 2008).
2. Kultur fed-batch
Kultur fed-batch pada dasarnya mirip dengan kultur batch, dan kebanyakan dimulai hidup dengan fase batch yang sederhana.
Namun, tidak seperti kultur batch, kultur ini tidak beroperasi dengan sistem tertutup. Pada suatu titik tertentu selama proses fed-batch satu atau lebih substrat, nutrisi, dan / atau induser yang diperkenalkan ke bioreaktor (McNeil & Harvey, 2008). Kultur Fed-batch dapat dijalankan dengan cara yang berbeda, misalnya pada volume yang tetap di mana pada titik waktu tertentu, sebagian dari isi fermentor (terdiri dari media yang digunakan, sel, produk, dan nutrisi yang tidak terpakai) ditarik dan digantikan dengan volume yang sama dari media segar dan nutrisi (penarikan dan pengisian), atau pada volume bervariasi mana tidak ada yang dihilangkan dari bioreaktor selama waktu proses,
dengan sel-sel dan produk sisa dalam wadah sampai akhir periode fermentasi, dan penambahan media segar dan nutrisi dimaksudkan untuk meningkatkan volume kultur (Gambar 4). Strategi feeding ini memungkinkan organisme untuk tumbuh di laju pertumbuhan spesifik yang diinginkan, meminimalkan produksi yang tidak diinginkan oleh- produk, dan memungkinkan tercapainya kepadatan sel yang tinggi dan konsentrasi produk (McNeil & Harvey, 2008).
Gambar 4. Skema fermentasi fed-batch sederhana. Feeding dimulai pada titik yang telah ditentukan selama proses berjalan, biasanya pada akhir fase pertumbuhan eksponensial. Feed terdiri dari media proses tipe super-terkonsentrasi yang memungkinkan kontrol dari tingkat pertumbuhan dan karbon fluks melewati sistem ini (McNeil & Harvey, 2008).
3. Kultur kontinyu
Secara historis, teknik kultur kontinyu belum banyak digunakan dalam skala laboratorium, tetapi lebih sering diterapkan dalam industri untuk proses produksi cuka, pengolahan air limbah, produksi etanol dan
25
produksi protein sel tunggal. Di laboratorium, teknik ini telah digunakan untuk mempelajari pertumbuhan dan fisiologi mikroorganisme. Secara khusus, sistem kontinyu telah digunakan untuk mempelajari proteomik, transcriptomik dan analisis fluks, mengetahui peningkatan reproduktifitas dan akurasi data bila dibandingkan dengan penelitian serupa dalam kultur batch.
Gambar 6. Susunan fermentasi kontinyu yang dapat digunakan di laboratorium. Feed dipompa ke dalam reaktor, meningkatkan volume dalam reaktor. Pada saat yang sama, overflow weir memungkinkan adanya kelebihan volume untuk selanjutnya mengalir ke dalam tangki produk. Hal ini memastikan volume dalam reaktor tetap konstan (McNeil & Harvey, 2008)
Kultur kontinyu merupakan metode yang memperpanjang fase eksponensial dari suatu organisme dalam kultur batch, sambil mempertahankan kondisi yang memiliki sedikit fluktuasi nutrisi, jumlah sel atau biomassa. Organisme diberi nutrisi baru dan sel-sel dikeluarkan dari sistem pada tingkat yang sama. Hal ini memastikan
bahwa beberapa faktor tetap konstan sepanjang fermentasi seperti volume kultur, biomassa atau jumlah sel, produk dan konsentrasi substrat, serta parameter fisik dari sistem seperti pH, suhu dan oksigen terlarut (McNeil & Harvey, 2008).
D. Metabolit Sekunder
Metabolit sekunder adalah molekul organik yang dihasilkan oleh mikroorganisme (terutama jamur dan actinobacteria) melalui aksi enzim besar seperti nonribosomal peptide synthetases (NRPS) dan polyketide synthases (PKS) atau oleh enzim seperti dimethylallyl transferase dan prenyl transferase. Metabolit khusus umumnya tidak dibutuhkan untuk pertumbuhan, tetapi diyakini menguntungkan untuk memproduksi organisme dalam kondisi tertentu dan dalam habitat yang berbeda. Dalam jamur, gen yang bertanggung jawab untuk biosintesis metabolit sekunder biasanya diatur dalam cluster (Brakhage, 2012) yang sering ditemukan pada akhir kromosom di daerah subtelomerik (Palmer & Keller, 2010).
Metabolit sekunder mikroba merupakan sumber senyawa dengan struktur kimia yang unik. Berbagai besar senyawa struktural asli diproduksi selama proses fermentasi mikroba. Metabolit sekunder diketahui dapat menunjukkan berbagai aktifitas, tidak hanya antibakteri dan antitumor, tetapi juga antijamur, antivirus, antiparasit, imunosupresif, enzim- penghambat, dan bahkan saraf: mereka dapat memainkan bagian mendasar dalam pengobatan penyakit alzheimer. Struktur asli dari metabolit bioaktif alami memberikan calon yang unik untuk obat-obatan
27
baru. metabolit sekunder dengan aktivitas antibakteri yang banyak digunakan dalam pengobatan penyakit menular (Solecka dkk., 2012).
Metabolit sekunder diyakini melaksanakan mekanisme resistensi untuk mengatasi invasi patogen pada endofit. Penelitian menunjukkan sejumlah besar senyawa antimikroba yang diisolasi dari endofit, memiliki beberapa kelas struktural seperti alkaloid, peptida, steroid, quinine, terpenoid, fenol dan flavonoid. Metabolit antimikroba baru dari endofit sekarang menjadi pilihan alternatif untuk mengatasi semakin terbatasnya jumlah antibiotika yang efektif terhadap spesies bakteri yang beragam, dan beberapa agen antimikroba baru yang masih dalam proses pengembangan (Shukla dkk, 2014).
Metode untuk mendapatkan senyawa bioaktif termasuk ekstraksi dari sumber alami, produksi mikroba melalui fermentasi, atau transformasi mikroba (rekayasa genetika). Pemanfaatan sumber alami menyebabkan beberapa kelemahan seperti tergantung pada musim, iklim, dan ekologi yang mungkin terlibat dalam ekstraksi sehingga membutuhkan pendekatan inovatif untuk mendapatkan senyawa tersebut. Oleh karena itu, teknik bioteknologi dengan menggunakan mikroorganisme merupakan alternatif yang menjanjikan, hemat biaya, dan sumber daya terbarukan (Pimentel dkk, 2011).
Antibiotika merupakan molekul dengan berat molekul rendah, produk organik alami yang dibuat oleh mikroorganisme yang aktif pada
konsentrasi rendah terhadap mikroorganisme yang aktif pada konsentrasi rendah terhadap mikroorganisme lain (Strobel & Daisy, 2003).
Gambar 7. Struktur kimia beberapa senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh mikroba endofit (Nair & Padmavathy, 2014; Puri dkk., 2005)
Geldanamycin Rifamycin B
Brefeldin A Huperzine A
Taxol (Paclitaxel) Camptothecin
29
Antibiotika yang tersedia saat ini dapat diklasifikan sebagai produk alami, produk alami yang dimodifikasi secara kimia (juga disebut antibiotika semisintetik) dan yang dilakukan secara sintesis kimia total.
Sehubungan dengan itu, mikroorganisme tetap menjadi fokus utama pencarian antibiotika baru. Tanah merupakan sumber yang kaya akan kultur mikroba. Bahan lain yang dapat digunakan untuk isolasi mikroorganisme adalah tanaman atau bagian tanaman, air, dan serangga (Masurekar, 2009).
Produk alami dari mikroba telah diamati menghambat atau membunuh berbagai agen penyebab penyakit berbahaya termasuk bakteri patogen, jamur, virus, dan protozoa yang mempengaruhi manusia dan hewan (Strobel & Daisy, 2003). Produksi senyawa bioaktif oleh endofit, terutama yang ekslusif terhadap tanaman inang mereka, tidak hanya penting dari segi perspektif ekologi tetapi juga dari sudut pandang biokimia dan molekuler. Misalnya, menggunakan fermentasi yang terkendali dengan mengubah akses kultur dan parameter proses fermentasi (seperti jenis media dan komposisi, serasi, pO2, pCO2, pH, suhu, agitasi, sampling, dan waktu panen), senyawa yang dihasilkan oleh endofit jamur dapat dioptimalkan (Kusari dkk, 2012).
E. Antimikroba
Salah satu jenis metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit adalah senyawa antimikroba. Antimikroba merupakan substansi yang digunakan untuk memberantas infeksi mikroba pada manusia obat-
obat antimikroba efektif dalam terapi infeksi karena toksisitas selektifnya, yaitu obat-obat ini memiliki kemampuan untuk menghambat atau membunuh mikroorganisme penyebab penyakit tetapi tidak toksik terhadap inangnya. Pengujian potensi antimikroba adalah suatu teknik pengujian potensi suatu antimikroba dengan cara mengukur efek senyawa-senyawa tersebut terhadap pertumbuhan mikroba uji (Djide &
Sartini, 2008).
Sampai saat ini telah ditemukan lebih dari 3000 antibiotika, namun hanya sedikit saja yang diproduksi secar komersil. Beberapa antibiotika telah dapat diproduksi dengan kombinasi sintesis mikroorganisme dan modifikasi kimia, antara lain : golongan penisilin, sefalosporin, klindamisin, tetrasiklin, dan rifampisin. Adapun yang telah dibuat secara kimia seperti kloramfenikol dan pirolnitrin (Suwandi, 1989). Antimikroba dapat digolongkan berdasarkan atas mekanisme kerja dan spektrum aktivitas.
Berdasarkan mekanisme kerjanya antimikroba dibagi kedalam beberapa kelompok, antara lain (Pelczar & Chan, 2005):
1. Gangguan pada sintesis dinding sel
Pada umumnya bakteri memerlukan para amino benzoic acid (PABA) untuk mensintesis purin dan pirimidin (prekursor DNA dan RNA), bila asam folat tidak ada, sel-sel tidak dapat tumbuh atau membelah (Mycek, 2001). Antimikroba dapat menghambat sintesis atau menghambat aktivitas enzim yang dapat merusak dinding sel mikroorganisme. Senyawa antimikroba yang kerjanya dengan cara
31
menghambat sintesis dinding sel bakteri meliputi β-laktam seperti penisilin, sefalosporin, karbapenem, monobaktam, dan glikopeptida meliputi vankomisin dan teicoplanin (Pelczar & Chan, 2008).
2. Menghambat sintesis protein
Antimikroba mempengaruhi fungsi ribosom pada mikroorganisme yang menyebabkan sintesis protein terhambat. Senyawa antimikroba yang kerjanya dengan cara menghambat sintesis protein meliputi makrolida, aminoglikosida, tetrasiklin, kloramfenikol. Makrolida, aminoglikosida, dan tetrasiklin terikat pada subunit 30s ribosom, sedangkan kloramfenikol, eritromisin mengikat subunit 50s (Pelczar &
Chan, 2008).
3. Mengganggu sintesis asam nukleat
Beberapa jenis antimikroba dapat mengganggu metabolisme asam nukleat sehingga mempengaruhi seluruh fase pertumbuhan sel bakteri. Fluoroquinolone memberi efek antimikroba dengan mengganggu sintesis DNA dan menyebabkan terhentinya replikasi untai ganda DNA. Rifampisin menghalangi transkripsi dan menghambat sintesis mRNA (Pelczar & Chan, 2008).
4. Menghambat fungsi membran sel
Antimikroba bekerja secara langsung pada membran sel yang mempengaruhi permeabilitas dan menyebabkan keluarnya senyawa intraselular mikroorganisme. Gangguan terhadap struktur membran bakteri ditimbulkan oleh polimiksin melalui efek penghambatan
terhadap peningkatan permeabilitas membrane bakteri, menyebabkan kebocoran membran. Begitupula pada amfoterisin B yang berinteraksi dengan sterol membrane sitoplasma pada sel mikroorganisme (Pelczar
& Chan, 2008). Berdasarkan spectrum aktivitasnya,antibiotika terdiri atas beberapa golongan antara lain (Pelczar & Chan, 2008):
1. Antibiotika dengan spektrum luas, efektif baik terhadap mikroorganisme gram positif dan gram negatif, antara lain turunan tetrasiklin, tiamfenikol, aminoglikosida, makrolida, rifampisin, penisilin (ampisillin, amoksisilin, bakampisin, karbenisilin, hetasilin, dan lain-lain dan sebagian besar turunan sefalosporin) (Pelczar & Chan, 2008).
2. Antibiotika dengan spectrum sempit (narrow spectrum) yang hanya bekerja pada satu grup mikroorganisme misalnya antibiotika yang aktivitasnya lebih dominan terhadap mikroorganisme gram positif seperti benzilpenisilin, kloksasilin, penisilin G, prokain, dan beberapa turunan sefalosporin sedangkan antibiotika yang aktivitasnya lebih dominan terhadap mikroorganisme gram negatif seperti kolistin, polimiksin B sulfat dan sulfomisin (Pelczar & Chan, 2008).
F. Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan mengekstraksi simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, diluar pengaruh cahaya matahari langsung (Dirjen POM, 1979). Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan dan termasuk biota laut. Zat-zat aktif
33
tersebut berada di dalam sel, namun sel tanaman dan hewan berbeda demikian pula ketebalannya, sehingga diperlukan metode ekstraksi dan pelarut tertentu dalam mengekstraksinya. Umumnya, zat aktif yang terkandung dalam tanaman maupun hewan lebih larut dalan pelarut organik. Proses terekstraksinya zat aktif dalam tanaman adalah pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan terlarut sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan pelarut organik diluar sel. Maka larutan terpekat akan berdifusi ke luar sel, dan proses ini berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi zat aktif di dalam sel dan di luar sel (Dirjen POM, 1979; Dirjen POM, 1986).
Ekstraksi disebut juga penyarian yaitu kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair.
Ekstraksi dapat juga diartikan sebagai penyarian zat-zat aktif atau zat-zat berkhasiat dari bagian tanaman, hewan, dan beberapa jenis biota laut. Zat aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam alkaloida, glikosida, flavonoida, dan lain-lain (Dirjen POM, 1986).
Ekstraksi biasanya dimulai dengan menggunakan pelarut organik secara berurutan dengan kepolaran yang semakin meningkat. Pelarut heksan, eter, petroleum eter, dan kloroform digunakan untuk mengambil senyawa dengan kepolaran rendah. Pelarut yang lebih polar seperti alkohol dan etil asetat dapat digunakan untuk mengambil senyawa yang lebih polar. Pemilihan pelarut berdasarkan like dissolved like yang berarti
