ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA
ANTIBAKTERI DARI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN
MIANA (
Coleus scutellariodes
[L.] Benth
.
)
DWI ENDAH KUSUMAWATI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Miana (Coleus scutellariodes
[L.] Benth.) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Dwi Endah Kusumawati
RINGKASAN
DWI ENDAH KUSUMAWATI. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Miana (Coleus scutellariodes [L.] Benth. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
Coleus scutellariodes [L.] Benth. merupakan tanaman obat yang mengandung senyawa antidiare dan antimikroba. Pengambilan senyawa bioaktif dari tanaman membutuhkan banyak biomassa. Cara efisien untuk memperoleh senyawa bioaktif tersebut adalah menggunakan bakteri endofit. Bakteri endofit merupakan mikroorganisme simbiotik yang hidup di dalam jaringan tanaman dan tidak menimbulkan efek negatif pada tanaman inangnya. Beberapa genus dari bakteri endofit diketahui mampu menghasilkan senyawa metabolit sekunder seperti antibiotik, antikanker, antifungi, antivirus dan antimalaria.
Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri endofit dari tanaman miana (C. scutellariodes [L.] Benth.) serta menganalisis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat bakteri endofit potensial menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). Penelitian ini diawali dengan isolasi bakteri endofit dari tanaman miana. Isolat yang didapatkan kemudian diuji aktivitas antibakterinya terhadap Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Bacillus cereus dan Salmonella enteritidis. Isolat yang mampu menghambat semua bakteri patogen yang diujikan dinamakan isolat potensial. Identifikasi spesies dari isolat potensial dilakukan menggunakan analisis sekuen 16S rRNA. Selanjutnya, analisis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit dilakukan dengan menggunakan GC-MS.
Sebanyak 22 isolat bakteri endofit diperoleh dari C. scutellariodes [L.] Benth. Berdasarkan hasil uji antivitas antibakteri, isolat bakteri endofit DM6 mampu menghambat pertumbuhan semua bakteri patogen. Analisis sekuen 16S rRNA menggunakan BLAST menunjukkan isolat DM6 memiliki presentase kemiripan dengan Brevibacillus brevis strain DZBY11 sebesar 98%. Hasil GC-MS menunjukkan bahwa senyawa aktif yang diduga berperan sebagai antibakteri dari ekstrak kloroform DM6 diantaranya: 1-Octadecene (CAS).alpha
.-Octadecene,Hexanedioic acid, dioctyl ester (CAS) Dioctyl adipate, Phenol, 3,5-bis(1,1-dimethylethyl)- (CAS) 3,5-Di-tert-butylphenol, dan
1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo[4.3.0]nonane.
SUMMARY
DWI ENDAH KUSUMAWATI. Isolation and Characterization of Antibacterial Compounds from Coleus scutellariodes [L.] Benth.’s Endophytic Bacteria. Supervised by MARIA BINTANG and FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
Coleus scutellariodes [L.] Benth. known as medicinal plant which contains antidiarhea and antimicrobial compounds. Utilization of bioactive compound from plant’s extract is not efficient because we need a large of biomass, so one of the appropiate ways is using endophytic bacteria. Endophytic bacteria is a symbiotic microorganism which live inside plant tissues and not harm to their host. Several genera from endophytic bacteria known to produce secondary metabolite compounds like antibiotics, anticancer, antifungal, antiviral and antimalarial.
The objectives of this research are to isolate and characterize endophytic bacteria from C. scutellariodes [L.] Benth.and analysis antibacterial compounds from potential isolate using Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). This research started with isolation of endophytic bacteria from C. scutellariodes
[L.] Benth. The isolate were tested antibacterial activity against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus and Salmonella enteritidis. The isolate which able to inhibit the growth of all pathogenic bacteria called potential isolate. Identification of potential isolate spesies using analysis of 16S rRNA sequence. Analysis of antibacterial compounds which produced by endophytic bacteria are using GC-MS.
A total of 22 isolates of endophytic bacteria were obtained from C. scutellariodes [L.] Benth. Based on antibacterial activity test, endophytic bacteria isolate DM6 from C. scutellariodes [L.] Benth. leaves had the ability to inhibit the growth of all pathogenic bacteria. Analysis of 16S rRNA sequence using BLAST showed that DM6 isolate was related to Brevibacillus brevis strain DZBY11 with 98% identity. The result of GC-MS analysis showed that active compound which estimated as antibacterial from chloroform extract of DM6 are: 1-Octadecene (CAS).alpha.-Octadecene, Hexanedioic acid, dioctyl ester (CAS) Dioctyl adipate, Phenol, 3,5-bis(1,1-dimethylethyl)- (CAS) 3,5-Di-tert-butylphenol, and 1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo [4.3.0]nonane.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA
ANTIBAKTERI DARI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN
MIANA (
Coleus scutellariodes
[L.] Benth
.
)
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2014
Judul Tesis : Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Miana (Coleus scutellariodes [L.] Benth.)
Nama : Dwi Endah Kusumawati NIM : G851130436
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Prof. Dr Drh Maria Bintang, MS Ketua
Prof. Dr Drh Fachriyan H Pasaribu Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Biokimia
Prof. Dr Drh Maria Bintang, MS
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini dilakukan sejak bulan Januari – Agustus 2014, dengan judul “Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Miana (Coleus scutellariodes [L.] Benth.)”
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada segala pihak yang telah membantu selama proses penyusunan tesis ini, khususnya kepada:
1. Prof. Dr Drh Maria Bintang, MS selaku ketua komisi pembimbing yang telah banyak membantu penulis, baik dari segi dana, motivasi, arahan dan semangat dalam menyelesaikan kuliah dan tesis ini.
2. Prof. Dr Drh Fachriyan H. Pasaribu selaku pembimbing yang telah membantu penulis, baik dari segi fasilitas laboratorium, arahan serta motivasi selama penelitian dan penyelesaian tesis.
3. Orang tua, Mba Wulan, A Pudin, dan Athaya atas segala doa, perhatian, dukungan dan semangat untuk menyelesaikan kuliah dan penelitian. 4. Sahabat akselarasi (SINERGI S1-S2) Biokimia angkatan I (Ira, Novi,
Lusi, dan Andin), spesial untuk Ira atas kebersamaan dalam menjalani semua proses akademik sejak masih duduk di bangku S1 hingga saat ini. Mas Adhi dan teman sekamarku (Diana) atas perhatian, semangat, dan motivasinya.
5. Staf Laboratorium (Pak Agus Sumantri, Mba El, Pak Jaka) yang banyak membantu penulis selama penelitian.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2014
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI v
DAFTAR LAMPIRAN vi
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 2
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Hipotesis 2
Manfaat Penelitian 2
2 METODE 3
Waktu dan Tempat Penelitian 3
Bahan 3
Alat 3
Prosedur Penelitian 3
3 HASIL DAN PEMBAHASAN 5
Isolasi Bakteri Endofit 5
Aktivitas Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit terhadap Patogen 6
Analisis sekuen 16S rRNA 7
Fermentasi dan Ekstraksi Senyawa Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit
Potensial 8
Identifikasi Senyawa Antibakteri dengan GC-MS 8
4 KESIMPULAN DAN SARAN 9
Kesimpulan 9
Saran 9
DAFTAR PUSTAKA 10
LAMPIRAN 13
DAFTAR GAMBAR
1 Tanaman miana 5
2 Presentase bakteri endofit yang diisolasi dari miana. 5 3 Zona bening yang dihasilkan isolat bakteri endofit terhadap S. aureus 6 4 Zona bening hasil uji antibakteri ekstrak kloroform DM6 terhadap S.
aureus 8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Bagan alir penelitian 13
2 Data morfologi seluruh isolat bakteri endofit dari tanaman miana 14 3 Diameter zona bening isolat bakteri endofit miana terhadap bakteri
patogen 15
4 Sekuen 16S rRNA isolat DM6 16
5 Sekuen 16S rRNA isolat DM6 hasil pensejajaran 17
6 Hasil BLAST Sekuen 16S rRNA isolat DM6 hasil pensejajaran 18
7 Kondisi operasional alat GC-MS 19
8 Kromatogram hasil identifikasi komponen kimia ekstrak kloroform
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri patogen merupakan salah satu agen penyebab penyakit. Upaya yang sering dilakukan untuk menanggulangi penyakit infeksi akibat bakteri patogen adalah menggunakan antibiotik sintetis. Penggunaan antibiotik dalam dosis kecil dan berkepanjangan ternyata memiliki efek buruk, yaitu menyebabkan resistensi pada bakteri patogen dan dapat mematikan bakteri yang bersifat baik. Perlu adanya inovasi pemanfaatan bahan alami yang memiliki sifat antibakteri, sehingga dapat dijadikan alternatif pengganti antibiotik sintetis. Selain memiliki efek samping yang lebih rendah, penggunaan bahan alami lebih mudah terurai di perairan sehingga dinilai lebih ramah lingkungan (Marpaung 2004).
Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya alam, termasuk tumbuhan obat. Salah satu tumbuhan obat yang belum dimanfaatkan secara optimal adalah miana atau jawer kotok (C. scutellariodes [L.] Benth.).Tidak semua jenis miana berkhasiat sebagai obat. Hanya miana dengan daun berwarna merah kecoklatan atau kehitaman dengan tepian bergerigi yang dapat dimanfaatkan sebagai obat (Rahmawati 2008). Beberapa penelitian melaporkan bahwa miana termasuk ke dalam 64 dari 117 tanaman yang secara tradisional digunakan oleh masyarakat sebagai obat diare karena mengandung zat kimia yang bersifat antidiare dan daunnya mengandung alkaloid, flavonoid serta polifenol yang bersifat antibakteri (Sundari & Winarno 1996).
Menurut Winarto (2007) penggunaan daun miana oleh masyarakat umumnya dalam bentuk segar seperti tumbukan, perasan, seduhan, dan rebusan. Daun miana biasanya digunakan untuk mengobati asma, bronchitis, batuk, melancarkan siklus menstruasi, menetralisir racun, penambah nafsu makan, mempercepat pematangan bisul, diare, dan cacingan. Masyarakat Manado menggunakan daun miana sebagai obat malaria dengan dicampur madu dan buah sirih (Lisdawati 2008), air rebusan daun miana juga digunakan sebagai obat batuk, wasir dan kencing manis (Julianus et al. 2011).
Pengambilan senyawa bioaktif dari tanaman membutuhkan banyak biomassa. Cara efisien untuk memperoleh senyawa bioaktif tersebut adalah menggunakan mikroba endofit. Endofit diketahui mampu menghasilkan sejumlah senyawa bioaktif, sehingga kita tidak harus mengekstrak senyawa bioaktif tersebut dari tanaman inangnya (Simarmata et al. 2007). Bakteri endofit merupakan mikroorganisme simbiotik yang hidup di dalam jaringan tanaman dan tidak menimbulkan efek negatif pada tanaman inangnya (Mano & Morisaki 2008). Umumnya, bakteri endofit masuk ke dalam jaringan tanaman melalui akar, stomata dan lentikula (Mano et al. 2007).
2
NRRL 30562 yang mampu menghasilkan antibiotik seperti munumbisin (Castillo
et al. 2002), dan Taxomyces andreanae yang mampu menghasilkan taxol sebagai senyawa antikanker (Strobel et al. 1993).
Penelusuran dan pemanfaatan senyawa aktif dari bakteri endofit asal tanaman miana terhadap bakteri patogen sejauh ini belum dilaporkan. Besar kemungkinan bakteri endofit yang menetap di tanaman tersebut memiliki kemampuan untuk mensintesis senyawa antibakteri yang sama seperti tanaman inangnya.
Perumusan Masalah
Miana (Coleus scutellariodes [L.] Benth.) khususnya bagian daun diketahui memiliki spektrum antibakteri yang luas, sehingga berpotensi dijadikan sebagai sumber antibiotik alami. Besar kemungkinan senyawa antibakteri tersebut juga dihasilkan oleh bakteri endofit yang hidup di dalam tanaman miana. Hingga saat ini, belum ada pembuktian ilmiah mengenai aktivitas antibakteri dan karakterisasi senyawa antibakteri dari bakteri endofit tanaman miana terhadap bakteri patogen (S. aureus, E. coli, B. cereus, dan S. enteritidis).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri endofit dari tanaman miana (C. scutellariodes [L.] Benth.) serta menganalisis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat bakteri endofit potensial menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS).
Hipotesis
Bakteri endofit dari tanaman miana (Coleus scutellariodes [L.] Benth.) dapat diisolasi dan memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen (S. aureus, E. coli, B. cereus, dan S. enteritidis) serta isolat potensialnya dapat dikarakterisasi secara molekuler menggunakan analisis sekuen 16S rRNA. Selain itu, senyawa aktif dari bakteri endofit miana yang berperan dalam aktivitas antibakteri dapat dianalisis menggunakan GC-MS.
Manfaat Penelitian
3
2
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan selama delapan bulan (Januari-Agustus 2014) dan bertempat di tiga lokasi, yaitu Laboratorium Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan-IPB, Laboratorium Biokimia FMIPA-IPB dan Laboratorium Pengujian Hasil Hutan P3KKPHH Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan antara lain: tanaman miana (C. scutellariodes [L.] Benth.), etanol 70%, media Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB), Na-hipoklorit 5.25%, nistatin, kultur bakteri patogen (S. aureus, E. coli, B. cereus, dan S. enteritidis), primer (27F, 1492R, 518F dan 800R), larutan garam steril,
InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA), Montage PCR Clean up kit (Milipore), Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied BioSystems, USA), kloroform, tetrasiklin dan aseton.
Alat
Alat yang digunakan diantaranya: tabung reaksi, vorteks, Erlenmeyer, cawan Petri, ose, tabung sentrifugasi, mesin sentrifus, corong pisah, mesin
Polymerase Chain Reaction (PCR), Applied Biosystems model 3730XL automated DNA sequencing system (Applied BioSystems, USA) dan mesin GC-MS (Shimadzu Type GCMS-QP2010).
Prosedur Penelitian
Isolasi bakteri endofit (modifikasi Desriani et al. 2013)
Sampel berupa beberapa bagian dari tanaman miana seperti: akar, batang, dan daun dalam kondisi segar. Sampel dicuci dengan air mengalir hingga bersih lalu dipotong dengan ukuran 1-3 cm, kemudian dilakukan proses sterilisasi permukaan. Potongan sampel direndam etanol 70% selama 1 menit. Setelah itu, cairan perendam dibuang dan diganti dengan Na-hipoklorit 5.25% lalu didiamkan selama 5 menit. Cairan perendam dibuang kembali dan sampel dibilas dengan etanol 70% sebanyak tiga kali. Sampel yang telah steril dicacah secara steril lalu ditanam pada media NA yang telah ditambahkan nistatin (0.01 % b/v) dan diinkubasi di ruang gelap pada suhu ruang dan diamati hingga terdapat koloni yang tumbuh. Pemurnian dilakukan dengan memindahkan koloni yang tumbuh ke cawan Petri yang berisi NA. Setelah diperoleh biakan murni, bakteri endofit disimpan dalam agar miring NA.
Aktivitas Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit terhadap Patogen (Simarmata et al. 2007)
4
kultur bakteri patogen ditambahkan ke 80 mL NA cair yang bersuhu ± 40 oC, lalu dikocok dan dituang ke dalam cawan Petri sebanyak ± 20 mL. Isolat bakteri endofit diinokulasikan ke media yang telah mengandung patogen dengan menggunakan ose, lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 1-2 hari. Zona bening yang terbentuk menandakan adanya senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit.
Analisis Sekuen 16S rRNA
Preparasi DNA cetakan dari isolat DM6. Koloni isolat DM6
disuspensikan ke dalam 0.5 mL larutan garam steril pada tabung sentrifugasi yang berukuran 1.5 mL, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Pelet lalu diresuspensi dengan penambahan 0.5 mL InstaGene Matrix
(Bio-Rad, USA). Setelah itu, diinkubasi pada suhu 56 oC selama 30 menit, lalu dipanaskan 100 oC selama 10 menit. Setelah proses pemanasan, supernatan yang berisi DNA cetakan siap untuk digunakan pada proses selanjutnya.
Amplifikasi DNA dan penentuan urutan basa DNA untuk sekuen 16S
rRNA. Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Polymerase
Chain Reaction). Primer yang digunakan pada penelitian ini adalah 27F dan 1492R. Volume DNA cetakan yang ditambahkan adalah 1 μL dari 20 μL total larutan reaksi. Amplifikasi yang dilakukan sebanyak 35 siklus, dengan kondisi PCR sebagai berikut: denaturasi 94 oC selama 45 detik, annealing 55 oC selama 60 detik dan elongasi pada suhu 72 oC selama 60 detik. Selanjutnya dilakukan purifikasi produk PCR menggunakan Montage PCR Clean up kit (Milipore). Hasil PCR kemudian ditentukan urutan basa DNAnya (sequencing) menggunakan dua primer (518F dan 800R) dan Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied BioSystems, USA) kemudian dianalisis menggunakan Applied Biosystems model 3730XL automated DNA sequencing system (Applied BioSystems, USA).
Analisis hasil sequencing. Hasil sequencing berupa urutan DNA kemudian disejajarkan menggunakan program BioEdit Sequence Alignment Editor
versi 7.2.0 lalu dianalisis lebih lanjut menggunakan program BLAST.
Fermentasi dan ekstraksi senyawa antibakteri dari isolat bakteri endofit potensial (modifikasi Melliawati et al. 2006).
Sebanyak satu ose isolat DM6 ditumbuhkan ke dalam 50 mL media NB lalu diinkubasi pada suhu 28-30 ºC dengan kecepatan 150 rpm selama 48 jam. Hasil fermentasi lalu disentrifugasi pada kecepatan 5500 rpm selama 60 menit untuk memisahkan antara media dengan sel bakteri. Supernatan yang dihasilkan selanjutnya diekstraksi dengan kloroform (1:1 v/v) menggunakan corong pisah lalu pelarutnya diuapkan kemudian ditimbang bobot keringnya. Ekstrak kloroform tersebut sebagian dilarutkan dengan Tween 80% untuk diuji daya antibakterinya terhadap bakteri patogen dan sisanya digunakan untuk analisis komponen kimia menggunakan GC-MS.
Identifikasi Senyawa Antibakteri dengan GC-MS
5
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi bakteri endofit
Pemanfaatan bakteri endofit dari tanaman obat merupakan cara baru untuk mendapatkan senyawa antibakteri tanpa harus mengekstraksi secara langsung dari tanaman obat tersebut. Pemilihan tanaman miana dengan daun berwarna merah kecoklatan dan tepian bergerigi sebagai sumber bakteri endofit yang akan diisolasi dikarenakan jenis tanaman ini telah diketahui berkhasiat sebagai obat (Rahmawati 2008), dan mengadung zat antibakteri (Sundari & Winarno 1996) (Gambar 1).
Gambar 1 Tanaman miana
Sebanyak 22 isolat bakteri endofit berhasil diisolasi dari tanaman miana, yaitu: 6 isolat dari akar (AM), 6 isolat dari daun (DM) dan 10 isolat dari batang (BM) dengan sebaran seperti pada Gambar 2. Hal ini sesuai dengan pernyataan Tarabily et al. (2003) yaitu bakteri endofit dapat diisolasi dari akar, batang, daun, permukaan benih, dan biji yang steril. Penggunaan sodium hipoklorit pada proses isolasi bakteri endofit berfungsi untuk sterilisasi permukaan, yaitu mematikan mikroba pada permukaan sampel sehingga dipastikan bahwa bakteri yang tumbuh selama masa inkubasi adalah bakteri endofit (Barac et al. 2004). Selain itu, pada media isolasi juga ditambahkan nistatin yang berfungsi sebagai antifungi (Kumala & Siswanto 2007).
Gambar 2 Presentase bakteri endofit yang diisolasi dari miana
Penelitian kali ini didapatkan jumlah bakteri endofit yang lebih banyak pada batang daripada akar. Secara umum, bakteri endofit banyak terdapat di akar dan semakin menurun jumlahnya pada batang dan daun (Lamb et al. 1996), namun terkadang jumlah bakteri endofit lebih banyak di batang daripada di akar (Koomnok et al. 2007). Hal ini dapat disebabkan oleh adanya aliran produk
27%
46% 27%
Akar
Batang
6
fotosintesis yang berasal dari daun ke seluruh bagian tanaman melalui floem, sehingga dapat dimanfaatkan oleh bakteri endofit sebagai sumber nutrisi (Koomnok et al. 2007).
Keragaman bakteri endofit dapat diketahui dengan melakukan karakterisasi dari bakteri endofit yang telah diisolasi. Karakterisasi awal dari isolat yang diperoleh dari miana dilakukan secara morfologi. Secara kasat mata, koloni isolat endofit memiliki bentuk dan warna yang bervariasi, namun umumnya koloni tunggal hasil pemurnian bakteri endofit berwarna putih susu dan putih kekuningan, tepian rata dan licin dengan elevasi cembung (Lampiran 2).
Aktivitas Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit terhadap Patogen Penapisan isolat bakteri endofit yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen dilakukan menggunakan metode inokulasi titik. Terbentuknya zona bening menandakan bahwa bakteri endofit tersebut memiliki kemampuan untuk memproduksi senyawa ekstraseluler yang bersifat antibakteri (Gambar 3). Sebanyak 15 isolat bakteri endofit mampu menghambat pertumbuhan S. aureus, 13 isolat mampu menghambat E. coli, 10 isolat positif menghambat B. cereus dan 17 isolat mampu menghambat pertumbuhan S. enteritidis. Isolat bakteri endofit yang mampu menghambat keempat jenis patogen tersebut berjumlah lima isolat. Isolat tersebut diantaranya: AM1, AM2, AM3, DM6, dan BM9. Data seluruh isolat bakteri endofit yang mampu menghasilkan zona bening dapat dilihat pada Lampiran 3.
Gambar 3 Zona bening yang dihasilkan isolat bakteri endofit terhadap S. aureus
Hasil tersebut menandakan bahwa kemungkinan besar senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit tersebut memiliki spektrum yang luas, karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan diameter zona bening yang terbentuk kemungkinan disebabkan perbedaan jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan tiap isolat bakteri endofit. Beberapa isolat bakteri endofit tidak menunjukkan aktivitas penghambatan pada kedua bakteri patogen yang diujikan. Bakteri endofit tersebut kemungkinan mampu menghasilkan senyawa antibakteri namun dalam jumlah yang sangat sedikit atau menghasilkan senyawa aktif lain yang belum diketahui (Son & Cheah 2002).
7 ekstrak aseton daun miana dapat menghambat pertumbuhan bakteri S.aureus, Staphylococcus epidermidis, E. coli, dan S. enteritidis, selain itu senyawa antibakteri dari ekstrak aseton daun miana diketahui mengandung derivat asam ftalat sebesar 67.368% (Rahmawati 2008). Penelitian lainnya juga menyatakan bahwa ekstrak etanol daun miana memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. enteritidis (Ariyanti et al. 2007). Selain itu, ekstrak metanol daun miana juga mampu meghambat pertumbuhan S. enteritidis (Poelongan 2009). Ekstrak etanol daun miana pada konsentrasi 10% dan 20% memiliki daya antibakteri terhadap S. aureus, E. coli, Bacillus subtilis, dan Salmonella paratyphosa (Kumala & Desi 2009). Berdasarkan hal tersebut, besar kemungkinan bakteri endofit yang menetap di tanaman miana memiliki kemampuan untuk mensintesis senyawa antibakteri seperti tanaman inangnya, sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut untuk membuktikannya.
Pemilihan isolat potensial dilakukan dengan memilih isolat yang membentuk zona bening paling besar dan jernih pada keempat bakteri patogen yang diujikan. Berdasarkan hasil penelitian, DM6 merupakan isolat potensial untuk dianalisis lebih lanjut.
Analisis sekuen 16S rRNA
Karakterisasi molekuler merupakan tahap penting untuk mengidentifikasi isolat bakteri endofit. Salah satu caranya adalah dengan analisis sekuen 16S rRNA. 16S rRNA adalah subunit kecil penyusun ribosom pada semua organisme prokariot, sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (Madigan et al. 2009). Sekuen 16S rRNA dianggap mampu mewakili seluruh informasi filogenetik dan lebih praktis. Gen 16S rRNA terdapat di semua organisme prokariot yaitu berupa sekuen konservatif dan sekuen variatif yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi bakteri melalui perbedaan dan variasi urutan pasang basanya (Bottger 1996).
Berdasarkan hasil uji sebelumnya, DM6 merupakan isolat potensial untuk dikarakterisasi secara molekuler menggunakan marka 16S rRNA. Identifikasi spesies atau genus dari suatu organisme ditentukan dari presentase kesamaan sekuen 16S rRNA dari sampel yang kita miliki dengan sekuen 16S rRNA yang tersedia dalam GenBank. Hasil sekuensing isolat DM6 yang telah disejajarkan menunjukkan bahwa gen 16S rRNA pada isolat tersebut berukuran 1545pb (Lampiran 5). Berdasarkan hasil analisis sekuen 16S rRNA menggunakan program BLAST, isolat DM6 memiliki presentase kemiripan dengan
Brevibacillus brevis strain DZBY11 sebesar 98% (Lampiran 6).
Bacillus adalah genus bakteri yang banyak terdapat di tanah dan beberapa spesies diketahui mampu memproduksi antibiotik dengan struktur kimia yang berbeda-beda (Wu et al. 2005). Hal ini memberikan keterangan bahwa isolat bakteri endofit DM6 kemungkinan besar berasal dari tanah dan masuk ke dalam tanaman melalui akar. Senyawa antibiotik yang diproduksi oleh Bacillus
umumnya berupa peptida dan kebanyakan dihasilkan oleh Bacillus subtilis dan
8
diproduksi oleh Bacillus umumnya efektif terhadap bakteri Gram positif (Wu et al. 2005).
Fermentasi dan ekstraksi senyawa antibakteri dari isolat bakteri endofit potensial
Isolasi senyawa aktif yang berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen dilakukan dengan menumbuhkan isolat potensial (DM6) ke dalam media NB guna memperbanyak jumlah selnya. Setelah 48 jam, dilakukan sentrifugasi guna memisahkan antara sel bakteri dengan media NB. Senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh DM6 diduga tergolong dalam senyawa ekstraseluler, sehingga supernatan tersebut digunakan untuk analisis lebih lanjut.
Supernatan kemudian diekstraksi dengan pelarut non-polar yaitu kloroform menggunakan corong pisah. Hasil ekstraksi kemudian dirotavapor untuk menghilangkan pelarutnya. Ekstrak kloroform DM6 selanjutnya diujikan kembali terhadap bakteri patogen (S. aureus). Berdasarkan hasil uji terlihat bahwa ekstrak kloroform DM6 memiliki aktivitas antibakteri seperti kontrol positif (tetrasiklin), namun dengan diameter zona bening yang lebih kecil (Gambar 4).
Gambar 4 Zona bening hasil uji antibakteri ekstrak kloroform DM6 terhadap S. aureus. Keterangan: K = Kontrol positif EK = Ekstrak Kloroform
Identifikasi Senyawa Antibakteri dengan GC-MS
Identifikasi komponen kimia yang terkandung di dalam ekstrak kloroform DM6 dilakukan dengan analisis GC-MS. Hasil analisis berupa bobot molekul dan pola fragmentasi yang kemudian dibandingkan dengan basis data untuk mengetahui tingkat kemiripan dengan jenis senyawa terdekat (Silverstein et al. 1991). Hasil analisis GC-MS menunjukkan bahwa di dalam ekstrak kloroform DM6 terdapat berbagai macam senyawa, namun diantara senyawa-senyawa tersebut, terdapat senyawa dengan konsentrasi tinggi yaitu: 1-Octadecene
(CAS).alpha.-Octadecene yang ditunjukkan pada peak dengan waktu retensi 19.096 (12.62%) dan peak dengan waktu retensi 20.443 (9.63%), Hexanedioic acid, dioctyl ester (CAS) Dioctyl adipate (10.83%), 3-Octadecene, (E)- (CAS) (9.67%), Phenol, 3,5-bis(1,1-dimethylethyl)- (CAS) 3,5-Di-tert-butylphenol
(9.31%), 1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo[4.3.0]nonane (6.43%), 1-TRICOSENE yang ditunjukkan pada peak dengan waktu retensi 21.783 (5.97%) dan peak dengan waktu retensi 23.339 (3.95%) (Lampiran 8).
9
acid merupakan golongan senyawa yang juga memiliki aktivitas antibakteri yang efektif menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti S. aureus, Klebsiella pneumonia dan Shigella dysenteriae (Choi & Jiang 2014).
3-Octadecene juga termasuk senyawa yang dihasilkan oleh isolat DM6 dalam konsentrasi yang cukup tinggi, namun belum ada laporan ilmiah terkait perannya sebagai senyawa antibakteri. 3-Octadecene dan senyawa 1-Tricosane
dilaporkan terkandung dalam ekstrak etanol bunga tanaman obat Calotropis gigantea (Dhivya & Manimegalai 2013). Selain itu, senyawa 3-Octadene juga terkandung dalam ekstrak etanol umbi akar tanaman obat Amorphophallus campanulatus (Basu et al. 2013).
Senyawa fenol dan turunannya juga diketahui memiliki aktivitas antimikroba, penelitian terkait senyawa fenol yang dilakukan oleh Vaquero et al. (2007) menunjukkan bahwa senyawa fenol dari minuman anggur memiliki aktivitas antimikroba terhadap E. coli. Senyawa turunan fenol lainnya yaitu
Phenol, 2, 4- 14 22Bis (1, 1-Dimethyl ethyl) yang diisolasi dari biji mangga Malaysia juga memiliki aktivitas antibakteri (Abdullah et al. 2011). Senyawa turunan fenol, asam heksadekanoat, dan 3-benzyl
1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo[4.3.0]nonane dari ekstrak etil asetat bakteri Burkholderia cepacia
memiliki aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen ikan seperti:
Aeromonas hydrophyla, Edwardsiella tarda dan Vibrio ordalli (Gohar et al. 2010). Apabila dibandingkan dengan kemampuan tanaman miana dalam menghasilkan senyawa antibakteri, Rahmawati (2008) telah menyatakan bahwa ekstrak aseton daun miana mampu menghasilkan senyawa asam adipat/hexanedioic acid, bis (2-ethylhexyl) yang diduga memiliki aktivitas antibakteri patogen. Selain itu, Winarto (2007) juga menyatakan bahwa daun miana mengandung fenol. Hal ini mengindikasikan bahwa bakteri endofit yang menetap pada tanaman miana juga mampu mensintesis senyawa antibakteri yang sama dengan yang dihasilkan oleh tanaman inangnya.
4
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Bakteri endofit dapat diisolasi dari tanaman miana (C. scutellariodes [L.] Benth.). DM6 merupakan isolat bakteri endofit potensial yang mampu menghambat pertumbuhan keempat jenis bakteri patogen yang diujikan. Berdasarkan analisis sekuen 16S rRNA, isolat DM6 memiliki presentase kemiripan dengan Brevibacillus brevis strain DZBY11 sebesar 98%. Hasil GC-MS menunjukkan bahwa senyawa aktif yang diduga berperan sebagai antibakteri dari ekstrak kloroform DM6 diantaranya: 1-Octadecene (CAS).alpha.-Octadecene, Hexanedioic acid, dioctyl ester (CAS) Dioctyl adipate, Phenol,
3,5-bis(1,1-dimethylethyl)- (CAS) 3,5-Di-tert-butylphenol, dan 1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo
[4.3.0] nonane.
Saran
10
DAFTAR PUSTAKA
Abdullah ASH, Mirghani MES, Jamal P. 2011. Antibacterial activity of Malaysian mango kernel. African Journal of Biotechnology 10(81):18739-18748.
Ariyanti T, Fazrina RI, Darmono. 2007. Pengaruh ekstrak etanol daun iler (Coleus atropurpureus L. Benth.) terhadap infeksi Salmonella enteritidis pada mencit (Mus musculus). Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner.799-806.
Barac T, Taghavi S, Borremans B, Provoost A, Oeyen L, Colpaert JV, Vangronsveld J, Ledie VD. 2004. Engineered endophytic bacteria improve phytoremediation of water-soluble, volatile, organic pollutants. Nat Biotechnol. 22:583–588.
Basu S, Choudhury UR, Das M, Datta G. 2013. Identification of bioactive components in ethanolic and aqueous extracts of Amorphophallus campanulatus tuber by GC-MS analysis. International Journal of Phytomedicine 5:243-251.
Bottger EC. 1996. Approachs for identification of microorganisms. ASM News 62: 227-250.
Choi WH, Jiang M. 2014. Evaluation of antibacterial activity of hexanedioic acid isolated from Hermentia illucenc larvae. Journal of Applied Biomedicine
12(3):179-189.
Castillo et al. 2002. Munumbicins, wide-spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans.
Microbiology 148:2675–2685.
Desriani et al. 2013.Potential endophytic bacteria for increasing paddy var rojolele productivity. IJASEIT 3(1):76-78.
Dhivya R, Manimegalai K. 2013. Preliminary phytochemical screening and GC-MS profiling of ethanolic flower extract of Calotropis gigantean Linn. (Apocyanaceae). Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2(3):28-32.
Gohar YM, El-Naggar MMA, Soliman MK, Barakat KM. 2010. Characterization of marine Burkholderia cepacia antibacterial agents. I Journal of Natural Products 3:86-94.
Julianus et al. 2011. Tumbuhan Obat Tradisional di Sulawesi Utara. Ed ke-2. Manado: Balai Penelitian Kehutanan Manado.
Kleinkauf H, von Dӧhren H. 1990. Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics. Euro. J. Biochem. 192(1):1-15.
Koomnok C, Teaumroong N, Rerkasem B, Lumyong S. 2007. Diazotroph endophytic bacteria in cultivated and wild rice in Thailand. Science Asia
33: 429-435.
Kumala S, Desi. 2009. Aktivitas antibakteri ekstrak daun iler (Coleus atropurpureus Benth.) terhadap beberapa bakteri Gram (+) dan bakteri Gram (-). Jurnal Bahan Alam Indonesia. 7(1):12-14.
11 Lamb TG, Tonkyn DW, Kluepfel DA. 1996. Movement of Pseudomonas aureofaciens from the rhizosphere to aerial plant tissue. Can. J.Microbiol. 42:1112–1120.
Lisdawati Vivi. 2008. Karakterisasi daun miana (Plectranthus scuntellaroides L. R.Bth) dan buah sirih (Piper betle L.) secara fisiko kimia dari ramuan lokal antimalaria daerah Sulawesi Utara. Media Litbang Kesehatan, Badan Litbangkes.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, & Clark DP. 2009. Microbiology of Microorganism. USA: Pearson Benjamin Cummings.
Mano H, Tanaka F, Nakamura C, Kaga H, Morisaki H. 2007. Culturable endophytic bacterial flora of the maturing leaves and roots of rice plants (Oryza sativa) cultivated in a paddy field. Microbes and Environments 22: 175-185.
Mano H, H Morisaki. 2008. Minireview: Endophytic bacteria in the rice plant.
Microbes and Environments 23: 109-117.
Marpaung EL. 2004. Flavonoid dari buah Sonneratia caseolaris Engl. dan kegunaannya sebagai antibakterial: Studi laboratorium infeksi Vibrio harveyi pada udang windu, Penaeus monodon Fab. [Tesis]. Bogor: FPIK, IPB.
Miller CM, Miller RV, Garton-Kenny D, Redgrave B, Sears J, Condron MM, Teplow DB, Strobel GA. 1998. Ecomycins, unique antimycotics from
Pseudomonas viridiflava. J Appl Microbiol 84: 937–944.
Mishra PM, Sree A. 2007. Antibacterial activity and GCMS analysis of the extract of leaves of Finlaysonia obovata (a mangrove plant). Asian Journal of Plant Sciences 6:168-172.
Poelongan M. 2009. Uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol daun miana (Coleus scutellariodes [L.] Benth.) terhadap bakteri Salmonella enteritidis dan
Staphylococcus aureus. Jurnal Biotika. 7(2):61-68.
Rahmawati F. 2008. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri Ekstrak Daun Miana (Coleus scutellariodes L. Benth.) [Tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling DN. 2008. Minireview: Bacterial endophytes: recent development and application. FEMS Microbiol Lett 278: 1-9.
Silverstein RM, Bassler GC, Mossil TC. 1991. Spectrometric Identification of Organic Compound. New York (US): John Wiley & Sons.
Simarmata R, Lekatompessy S, Sukiman H. 2007. Isolasi mikroba endofitik dati tanaman obat sambung nyawa (Gymura procumbens) dan analisis potensinya sebagai antimikroba. Berk Penel Hayati 13 : 85-90.
Son R, Cheah YK. 2002. Preliminary screening of endophytic fungi from medical plants in Malaysia for antimicrobial and antitumor activity. Malaysian Journal of Medical Sciences 9(2): 23–33.
Strobel GA, Stierle A, Stierle D, Hess WM. 1993. Taxomyces andreanae a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew. Mycotaxon. 47:71–78.
12
Tarabily K, Nassar AH, Sivasithamparam K. 2003. Promotion of plant growth by an auxin-producing isolate of the yeast Williopsis saturnus endophytic in maize roots. The Sixth UAE Universty Research Conference: 60-69.
Vaquero MJR, Alberto MR, de Nadra MCM. 2007. Antibacterial effect of phenolic compounds from different wines. Food Control 18(2):93-101. Winarto WP. 2007. Tanaman Obat Indonesia untuk Pengobatan Herba. Ed ke-1.
Jakarta: Karyasari Herba Media.
Wu S, Jia S, Sun D, Chen M, Chen X, Zhong J, Huan L. 2005. Purification and characterization of tow novel antimicrobial peptides Subpeptin JM4-A and Subpeptin JM4-B produced by Bacillus subtilis JM4. Curr. Microbiol. 51(5):292-296.
13 Lampiran 1 Bagan Alir Penelitian
Tanaman miana
Isolasi bakteri endofit
Isolat bakteri endofit Isolat bakteri patogen
Regenerasi bakteri patogen dan bakteri
endofit
Uji aktivitas antibakteri bakteri endofit terhadap bakteri patogen
Isolat Potensial
Fermentasi
Sentrifugasi
Pelet
Uji antibakteri terhadap bakteri patogen
Analisis GC-MS Analisis sekuen16S
rRNA
Ekstraksi dengan kloroform (1:1 v/v) Spesies bakteri
endofit
Supernatan
Ekstrak Kloroform
Uji antibakteri terhadap bakteri patogen
Ekstrak air
14
Lampiran 2 Data morfologi seluruh isolat bakteri endofit dari tanaman miana
Kode Isolat
Ciri morfologi
Warna Konsistensi Tepian Elevasi Kecepatan
15 Lampiran 3 Diameter zona bening isolat bakteri endofit miana terhadap bakteri
patogen
No Kode Isolat Diameter zona bening (mm)
16
Lampiran 4 Sekuen 16S rRNA isolat DM6 >dm6_518F
GGGGTTGCGTTGGTCGGATTATTGGGCGTAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTGAGTCTGGTGTTAAA GCCCGGAGCTCAACTCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTA TTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGG TCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGTTTCAATACCCTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAA GCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG CGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGCTGA CCGCTCTGGAGACAGAGCTTCCCTTCGGGGCAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTC GTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTGCCAGCATTCA GTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCA TGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGGGATGCTACCTCGCGAG GGGACGCCAATCTCTGAAAACCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTC GGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGA AGGTGGGGTAGATGACTGGGGTGAATCGTAACAGGGGGTAACCGTAAATGGGCCTTTTAAAAACAC AAAGCC
>dm6_800R
17
Lampiran 5 Sekuen 16S rRNA isolat DM6 hasil pensejajaran >dm6_Consensus (1545 pb)
18
19 Lampiran 7 Kondisi operasional alat GC-MS
Merk : Shimadzu Type GCMS-QP2010
Gas : Helium
Detektor : MS (Mass Spectrometer)
Kolom : Capiler Type Phase Rtx-5MS ; 60 m ; 0.25 mmID Suhu kolom : 50 oC
Inlet Press : 0.85 kPa
Column Flow : 0.85 mL/menit
Split Ratio : 112.3 SPL Temperature : 280 oC MS Interface : 280 oC
Ion Source : 200 oC
20
21
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 5 Februari 1991 dari pasangan Tukimin dan Kasini. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMAN 3 Depok dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Juli 2013 penulis mendapat kesempatan menjadi pemakalah pada Seminar
Nasional X bertema “Biologi, Sains, Lingkungan dan Pembelajarannya” di Universitas Sebelas Maret dengan judul makalah “Deteksi Enzim Cellobiose Dehydrogenase (CDH) dari fungi Trametes versicolor”. Agustus 2013 penulis menyelesaikan program S1 di IPB Departemen Biokimia dengan judul skripsi
“Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit dari Tanaman Padi Varietas Rojolele yang Berpotensi sebagai Biokontrol”. Tahun yang sama, penulis diterima di Sekolah Pascasarjana IPB melalui program akselarasi (SINERGI S1-S2) di Departemen Biokimia-FMIPA IPB.
November 2013 penulis mendapat kesempatan menjadi pemakalah di Seminar Nasional Himpunan Kimia Indonesia di Universitas Mulawarman Kalimantan Timur dengan judul makalah “Pupuk Hayati Berbasis Bakteri Endofit” dan Seminar Internasional “Brawijaya International Agriculture” 2013 di Universitas Brawijaya Malang dengan judul makalah “Potential of Biofertilizer Industry Based on Endophytic Bacteria to Increase Plant Health”. Tahun 2014 penulis berkesempatan kembali menjadi pemakalah pada beberapa Seminar Internasional, diantaranya: ISFAS 2014 di Tokyo-Jepang dengan judul makalah
““Future Development of Endophytic Bacteria from Coleus scutellariodes [L.] Benth. to Produce Antimicrobial Compounds”. AEBS 2014 di Phuket-Thailand
dengan judul makalah “Analysis of 16S rRNA Sequence of Endophytic Bacteria Isolate DM6 from Coleus scutellariodes [L.] Benth. Leaves”dan GIPI II UGM di Yogyakarta-Indonesia dengan judul makalah “Antimicrobial Activity of
Endophytic Bacteria from Coleus scutellariodes [L.] Benth. Against Pathogenic
