19 BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Bahan Penelitian 4.1.1 Bahan Sintesis (1) Asam 5-klorosalisilat (2) Asetil Klorida
(3) Aseton
(4) Tetrahydrofuran (5) Es Batu
4.1.2 Bahan Uji Kromatografi (1) Methanol
(2) Aseton (3) Kloroform (4) Ethanol 70%
(5) Air Suling
4.1.3 Bahan Identifikasi Struktur
(1) Senyawa hasil modifikasi struktur Asam O-(asetil)-5-klorosalisilat (2) Dimethyl sulfoxide-D6 untuk spektroskopi NMR
(3) Methanol
(4) KBr p.a untuk Inframerah 4.1.4 Bahan Uji Aktivitas
(1) Senyawa hasil modifikasi struktur Asam O-(asetil)-5-klorosalisilat (2) Asetosal
(3) Metil Selulosa Natrium 0,5 % (4) Asam asetat glacial 0,6 % (5) Aqua pro injection
(6) Alkohol swab (7) Water pro injection
4.1.5 Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan yaitu mencit karena ukuran dan kemudahan penanganannya. Oleh karena itu digunakan mencit putih (Mus musculus), jantan, dewasa, berumur 2-3 bulan, berat badan 20-30 gram, sehat tidak kelainan yang tampak pada bagian tubuh, dan apabila digunakan mencit betina sebaiknya tidak dalam keadaan hamil. Sebelum percobaan, mencit tidak diberi makan selama semalam tetapi masih diberi minum. Pengamatan dilakukan setiap hari, terutama pada hari-hari awal penelitian.
Mencit dibagi menjadi beberapa kelompok, yaitu :
(1) Kelompok mencit dengan senyawa uji asam O-(asetil)-5-klorosalisilat dengan dosis 100 mg/kgBB, sebanyak 6 ekor
(2) Kelompok mencit dengan senyawa uji asam O-(asetil)-5-klorosalisilat dengan dosis 50 mg/kgBB, sebanyak 6 ekor
(3) Kelompok mencit dengan senyawa uji asam O-(asetil)-5-klorosalisilat dengan dosis 25 mg/kgBB, sebanyak 6 ekor
(4) Kelompok mencit dengan senyawa pembanding Asetosal dengan dosis 100 mg/kgBB, sebanyak 6 ekor
(5) Kelompok mencit dengan senyawa pembanding Asetosal dengan dosis 50 mg/kgBB, sebanyak 6 ekor
(6) Kelompok mencit dengan senyawa pembanding Asetosal dengan dosis 25 mg/kgBB, sebanyak 6 ekor
(7) Kelompok mencit dengan kontrol (tanpa obat) CMC Na 0,5% sebanyak 6 ekor
4.2 Alat Penelitian 4.2.1 Alat-alat Sintesis (1) Corong pisah (2) Hotplate
(3) Magnetic Stirrer (4) Gelas Ukur (5) Beaker Glass (6) Labu Alas Bulat (7) Vacuum Buchner
(8) Rotavapor
(9) Timbangan elektrik (10) Kertas saring Whatmann (11) Termometer
(12) Pipet Tetes (13) Corong Gelas (14) Alumunium foil
(15) Seperangkat alat Destilasi Uap 4.2.2 Alat Uji Kemurnian
(1) Bejana Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (2) Pipa kapiler
(3) TLC silica Gel 60 F254
(4) Lampu UV 254 nm
(5) Alat penentu jarak lebur (Melting-point Stuart) 4.2.3 Alat Identifikasi Struktur
(1) Spektrofotometer UV-Vis (2) Spektrofotometer IR
(3) Spektrometer resonansi magnet inti (1H-NMR) 4.2.4 Alat Uji Aktivitas
(1) Labu Ukur (2) Neraca analitik (3) Timbangan mencit
(4) Jarum suntik dan Injection Disposable syringe (5) Stopwatch
(6) Mortir dan Stamper
(7) Wadah mencit beserta tutupnya
4.3 Waktu dan Tempat Penelitian
Dalam pengerjaan penelitian ini waktu yang dibutuhkan adalah dalam kurun waktu 4 bulan. Selain itu untuk melaksanakan penelitian senyawa hasil sintesis dan juga identifikasi struktur senyawa dilakukan pada tempat berikut ini:
(1) Laboratorium Kimia Terpadu II Universitas Muhammadiyah Malang
(2) Laboratorium Formulasi Sediaan Farmasi Universitas Muhammadiyah Malang
(3) Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang (4) Laboratorium Kimia Medisinal Universitas Airlangga
(5) Laboratorium Kimia Analisis Universitas Airlangga 4.4 Prosedur Penelitian
Kerangka Prosedur Penelitian dapat dilihat pada gambar 4.1 dibawah ini :
Gambar 4.1 Kerangka Operasional Penelitian Asam 5-klorosalisilat + Asetil klorida
Uji aktivitas analgesik senyawa hasil sintesis dibandingkan dengan asetosal dengan menggunakan metode Writhing Test
Asam O-(asetil)-5-klorosalisilat
Uji Kemurnian Senyawa hasil Sintesis 1. KLT
2. Jarak Lebur
Identifikasi Struktur Senyawa hasil Sintesis
1. Spektrofotometer UV-Vis
2. Spektrofotometer Inframerah 3. Spektrofotometer
1H-NMR Uji Organoleptis
1. Bau 2. Warna 3. Rasa
4.4.1 Prosedur Sintesis Senyawa Asam O-(asetil)-5-klorosalisilat
Gambar 4.2 Bagan Prosedur Sintesis Senyawa Asam O-(asetil)-5-klorosalisilat Dilakukan sintesis senyawa Asam O-(asetil)-5-klorosalisilat dengan mereaksikan Asam 5-klorosalisilat sebanyak 0,350 g yang dilarutkan dalam aseton 20 ml dalam labu alas bulat, lalu ditambahkan dengan 2 ml triethylamin (TEA) dan diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 10 menit. Diukur Asetil Klorida 3 ml
Asetil klorida 3 ml Asam 5-klorosalisilat 0,350 g
Aseton 20 ml + TEA 2 ml
+ Aseton 10 ml Dimasukkan kedalam labu alas bulat,
aduk (magnetic stirrer)
Dimasukkan kedalam corong pisah +
Larutan asetil klorida diteteskan tetes demi tetes secara konstan
Di refluk larutan suhu 60-70˚C hingga 8 jam
Larutan di uji KLT tiap jam hingga didapatkan satu noda
Campuran di rotavapor hingga diperoleh cairan kental
Masukkan kedalam beaker glass yang berisi air es sampai terbentuk Kristal
Saring menggunakan corong Buchner
Dilakukan KLT untuk memastikan hanya ada satu noda, namun jika masih terdapat pengotor dapat dicuci menggunakan aquadest panas
Didiamkan dalam suhu ± 1 jam
Reaksi dijaga pada suhu 0-5˚C dengan cara menambahkan es batu pada dinding labu alas bulat
dan dilarutkan dalam 10 ml aseton, kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah.
Larutan Asetil Klorida diteteskan secara konstan sampai habis ke dalam larutan Asam 5-klorosalisilat selama ± 1-2 jam. Didalam penetesan dilakukan pengadukan dan penjagaan suhu 0-5°C dengan cara menambahkan es batu pada dinding luar dari labu alas bulat.
Kemudian larutan didiamkan selama ± 30 menit pada suhu kamar dan dilanjutkan dengan merefluks larutan pada suhu 70-80°C selama 7-8 jam. Larutan diperiksa menggunakan KLT tiap jam hingga didapatkan noda dengan nilai Rf yang berbeda dari noda senyawa induk yaitu Asam 5-klorosalisilat pada plat KLT. Lalu sisa pelarut dihilangkan dari larutan menggunakan rotavapor sampai terbentuk cairan kental. Hasil dari sintesis yang berupa Kristal kemudian dicuci dengan cara meneteskan aquadest dingin sambil disaring menggunakan corong Buchner.
Noda diperiksa dengan KLT sampai noda yang terbentuk tidak berubah. Tiap pencucian diperiksa noda dengan KLT dan pencucian hanya diulang apabila masih belum terbentuk 1 noda. Untuk mendapatkan Kristal berwarna kuning keputihan dilakukan pencucian dengan cara melarutkan pada aquadest panas selama 30 menit, lalu disaring menggunakan corong pisah dan dikeringkan menggunakan corong Buchner.
4.4.2 Prosedur Uji Kemurnian (1) Uji Organoleptis
Pemeriksaan organoleptis senyawa hasil sintesis yaitu Asam O-(asetil)-5- klorosalisilat yang akan dilakukan secara visual yaitu meliputi bentuk, warna dan bau. Pemeriksaan yang dilakukan dibandingkan antara hasil senyawa yang didapat dengan senyawa pembandingnya.
(2) Uji Penentuan Jarak Lebur
Penentuan Jarak Lebur dilakukan menggunakan alat Melting point stuart.
Caranya yaitu zat digerus sampai halus kemudian dimasukkan ke dalam pipa kapiler tempat senyawa, yang salah satu ujungnya tertutup. Kemudian pipa kapiler dimasukkan pada alat Melting point stuart. Alat dihubungkan dengan sumber listrik dan saklar dalam posisi hidup. Alat diatur suhunya pada suhu 10°C dibawah titik lebur Asam 5-metilsalisilat. Dilakukan pemeriksaan sebanyak 3 kali dengan menurunkan suhu pada alat, kemudian dilakukan pengulangan. Jarak lebur yang
muncul dicatat pada 3 kali percobaan juga dipastikan zat mulai meleleh sampai zat meleleh semua. Titik lebur merupakan perubahan materi dari pada menjadi ke cair.
Senyawa murni memiliki jarak lebur tidak lebih dari 2°C (O Bryan, 2009).
(3) Uji Kemurnian dengan Kromatografi Lapis
Pemeriksaan kualitatif dengan kromatografi lapis tipis bertujuan untuk mengetahui adanya pengotor dari hasil samping reaksi sintesis. Uji KLT dilakukan dengan menggunakan fase diam lempeng silika gel 60 GF254 dan fase gerak beberapa campuran pelarut serta penampak noda lampu UV 254 nm.
Eluen yang digunakan sebagai fase gerak adalah : 1. Aseton : Etanol (7 : 3)
2. Etanol : Kloroform (9 : 1) 3. Aseton : Metanol (6 : 4)
Caranya pertama kali yaitu bejana KLT diisi eluen, lalu didiamkan hingga jenuh. Sejumlah zat hasil preparasi dan zat pembanding dilarutkan ke dalam aseton kemudian ditotolkan pada lempeng KLT yang telah diberi batas atas 0,5 cm dan batas bawah 2,5 cm, kemudian lempeng dimasukkan ke dalam bejana KLT yang telah jenuh dengan pelarut. Eluasi dilakukan hingga pelarut mencapai batas atas pada lempeng KLT, kemudian lempeng KLT diangkat dan dikeringkan. Noda diamati dengan lampu UV dan ditentukan harga Rf sebagai pembanding asam 5- klorosalisilat.
4.4.3 Prosedur Identifikasi Struktur Senyawa Hasil Sintesis
1. Prosedur Identifikasi Senyawa dengan Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum ultraviolet dan sinar tampak terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan sinar monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang 200- 800nm (Gandjar dan Rohman, 2018).
2. Prosedur Identifikasi Senyawa dengan Spektrofotometer Inframerah
Penggunaan spektrofotometer IR berdasarkan pada perbedaan molekul dalam menyerap radiasi inframerah yang diinterpretasikan dalam kenaikan amplitudo getaran pada atom-atom yang terikat atau dalam keadaan vibrasi tereksitasi sehingga suatu senyawa akan membentuk sidik jari yang unik pada daerah sidik jari yaitu pada 1500 cm-1 sampai 400 cm-1. Dengan mempelajari absorbsi yang terjadi
terhadap gugus fungsi tertentu, maka kemungkinan akan didapatkan informasi tentang struktur senyawa dari spektra IR (McMurry, 2015).
Sampel sebanyak 5 mg dicampur dengan serbuk KBr kering sekitar 100 mg.
Digerus di dalam mortir supaya merata secara efisien. Kemudian campuran dipres untuk mendapatkan pellet yang transparan. Menyiapkan kloroform lalu memasukkan campuran ke dalam cetakan. Meminimalkan adanya air menggunakan pompa vacuum, dengan cara menghubungkan cetakan dengan pompa vacuum, membutuhkan waktu selama 5 menit, lalu letakkan cetakan pada pompa hidrolik dan diberikan tekanan sampai angka 80. Kemudian pompa vacuum dimatikan apabila telah selesai dan letakkan pellet KBr yang telah terbentuk pada tablet holder dan dilakukan pengukuran menggunakan alat spektrofotometer IR (Ifada et al, 2013).
3. Prosedur Identifikasi Senyawa dengan Spektrofotometer 1H-NMR
Senyawa hasil modifikasi struktur ditimbang sebanyak 5-10 mg dilarutkan dengan 0,5 mL CDCl3. Kemudian di masukkan ke dalam tabung NMR dengan diameter 5 mm dan tabung diletakkan antara 2 magnet utara dan selatan pada alat FT-NMR. Kemudian dibuat spektrum resonansi proton senyawa pada daerah geseran kimia 0-14 ppm. Diidentifikasi integrasi relatif dan posisi puncak-puncak proton (atom H) spektra resonansi magnet inti yang terjadi (Silverstein et al, 2005).
4.4.4 Prosedur Uji Aktvitas Analgesik
(1) Persiapan Hewan Coba
Mencit yang memiliki bobot 20-30 gram dibagi menjadi 3 kelompok yaitu kelompok uji Asam 5-klorosalisilat dengan perlakuan dosis 25 mg/kgBB, 50 mg/kgBB dan 100 mg/kgBB masing-masing sebanyak 6 ekor. Kelompok pembanding Asetosal dengan perlakuan dosis 25 mg/kgBB, 50 mg/kgBB dan 100 mg/kgBB masing-masing 6 ekor. Sebelum dilakukan percobaan, mencit dipuasakan semalam tetapi tetap diberi minum. Mencit pada kelompok uji diberikan senyawa Asam O-(asetil)-5-klorosalisilat, kelompok pembanding diberi Asetosal, dan kelompok kontrol hanya diberikan musilago CMC-Na.
(2) Pembuatan Larutan Asam Asetat 0,6%
Dipipet asam asetat glasial 0,6 ml dimasukkan ke dalam labu ukur, diencerkan dengan aqua pro injeksi dan tambahkan lagi aqua pro injeksi hingga diperoleh volume 100 ml.
(3) Pembuatan suspensi CMC-Na 0,5 %
Sebanyak 500 mg CMC Na ditimbang untuk pembuatan suspensi 100 ml.
Kemudian ditaburkan diatas aquadest panas sebanyak 30 ml dan dibiarkan hingga mengembang selama sekitar 5 menit, kemudian digerus dan diencerkan dengan aquadest hingga diperoleh volume 100 ml (Diyah dkk, 2002).
(4) Perhitungan Dosis
Dosis yang digunakan dalam uji adalah 25, 50, dan 100 mg/kgBB sedangkan bobot mencit yang digunakan ialah 20-30 gram, apabila yang digunakan adalah bobot mencit sebesar 30 gram, maka perhitungan dosisnya adalah sebagai berikut:
a. 100 mg/kgBB x 0,03 kg (BB mencit) = 3 mg (dilarutkan dalam 0,5 ml) b. 50 mg/kgBB x 0,03 kg (BB mencit) = 1,5 mg (dilarutkan dalam 0,5 ml) c. 25 mg/kgBB x 0,03 kg (BB mencit) = 0,75 mg (dilarutkan dalam 0,5 ml)
Untuk pembuatan sediaan sebanyak 10 ml, maka dilakukan penimbangan sediaan untuk dosis 25, 50, dan 100 mg sebesar 15, 30, dan 60 mg.
(5) Pembuatan Senyawa Uji dan Senyawa Pembanding
Sediaan senyawa uji yang akan dibuat yaitu suspensi Asam O-(asetil)-5- klorosalisilat dan suspensi senyawa pembandingnya yaitu Asetosal. Suspensi sediaan harus segera dibuat sebelum melakukan uji aktivitas dan tidak boleh disimpan dalam jangka waktu yang lama.
Untuk dosis 25, 50, dan 100 mg/kgBB, dibutuhkan hasil senyawa sintesis dan asetosal masing-masing yaitu sebanyak 7,5 mg untuk dosis 25 mg/kgBB, 15 mg untuk dosis 50 mg/kgBB, dan 30 mg untuk dosis 100 mg/kgBB lalu digerus dan dicampur secara merata dan musilago CMC-Na 0,5 % sampai homogen, kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur dan ditambah dengan larutan musilago CMC-Na 0,5 % hingga diperoleh volume 10,0 ml.
(6) Pemberian Sediaan Senyawa Uji pada Mencit
Mencit pada kelompok uji dan kelompok pembanding akan diberikan suspense sejumlah volume yang telah ditentukan sehingga jumlah obat yang akan
diberikan sesuai dengan masing-masing dosis. Mencit dengan berat badan 30 gram, senyawa uji yang diinjeksikan yaitu 0,05 ml. Apabila mencit yang berat badannya kurang dari 30 gram, maka volume yang harus diinjeksikan yaitu :
Jumlah sediaan yang diberikan= 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑏𝑎𝑑𝑎𝑛 𝑚𝑒𝑛𝑐𝑖𝑡 (𝑔𝑟𝑎𝑚)
30 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑥 0,5 𝑚𝑙 Misal, berat badan mencit 20 gram = 20 𝑔𝑟𝑎𝑚
30 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑥 0,5 𝑚𝑙 = 0,33 𝑚𝑙 (7) Pelaksanaan Uji Aktivitas
a. Hewan coba yang digunakan diberikan tanda masing-masing, setelah itu, masing-masing mencit pada kelompok uji diberikan larutan uji sesuai dengan bobotnya, mencit yang berasal darikelompok kontrol hanya diinjeksikan larutan CMC Na 0,5% (plasebo), sedangkan mencit dari kelompok kontrol positif diberikan larutan pembanding yakni asam asetil salisilat atau aspirin dan diberikan secara intraperitoneal.
b. Setelah pemberian larutan obat ataupun placebo dalam waktu kurang lebih 20 menit, mencit diinjeksikan dengan larutan penginduksi yakni asam asetat 0,6% secara intraperitoneal.
c. Setelah mencit diinjeksikan larutan asam asetat 0,6%, tunggu selama 5 menit, kemudian lakukan pengamatan respon nyeri selama 30 menit. Respon nyeri yang diamati adalah frekuensi terjadinya geliat pada mencit dari kelompok uji dan kelompok kontrol.
Gambar 4.3 Bagan Prosedur Uji Aktivitas Hewan coba mencit
(Mus musculus)
Kelompok Pembanding Kelompok Kontrol
a. Dosis 25 mg/kgBB (6 mencit)
b. Dosis 50 mg/kgBB (6 mencit)
c. Dosis 100 mg/kgBB (6 mencit)
a. Dosis 25 mg/kgBB (6 mencit)
b. Dosis 50 mg/kgBB (6 mencit)
c. Dosis 100 mg/kgBB (6 mencit)
Pemberian larutan CMC Na 05% secara
intraperitoneal Pemberian senyawa
Asam O-(asetil)-5- klorosalisilat secara
intraperitoneal
Pemberian senyawa asetosal secara intraperitoneal
Injeksi asam setat 0,6% (Induksi nyeri)
Respon frekuensi geliat (30 menit)
% Hambatan nyeri – ED50
6 mencit Semalam tidak diberi
makan, tapi diberi minum
20 menit
5 menit Kelompok Uji
4.5 Analisis Data 4.5.1 Analisis Sintesis
Senyawa hasil yang diperoleh adalah senyawa dari sintesis antara asam 5- klorosalisilat dengan asetil klorida. Hasil sintesis dihitung berdasarkan mol dari senyawa. Mol yang dibutuhkan untuk asam 5-klorosasalilat adalah 0,01 mol sedangkan asetil klorida 0,015 mol.
Asam 5-klorosalisilat Asetil klorida Asam O-(asetil)-5-klorosalisilat 4.5.2 Analisis Uji Kemurnian
1. Analisis Pemeriksaan Organoleptis
Pemeriksaan organoleptis senyawa hasil sintesis yang akan dilakukan secara visual meliputi bentuk, warna dan bau.
2. Analisis Penentuan Titik Lebur
Pemeriksaan titik lebur yang meliputi senyawa hasil sintesis yang kemudian dibandingkan dengan senyawa induk yaitu asam 5-klorosalisilat. Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan alat Melting Point Stuart. Pemeriksaan dilakukan sebanyak 3 kali percobaan selanjutnya dicatat rentang titik lebur senyawa.
3. Analaisis Pemeriksaan dengan Kromatografi Lapis Tipis
Pemeriksaan dengan Kromatografi lapis tipis dilakukan dengan membandingkan senyawa hasil sintesis dengan senyawa induk yang ditotolkan pada satu plat KLT.
4.5.3 Analisis Data Identifikasi Struktur
1. Analisis Identifikasi Senyawa dengan Spektrofotometer Uv-Vis
Data hasil identifikasi struktur dengan spektrofotometer UV-Vis berupa panjang gelombang dimana yang dianalisis adalah senyawa pembanding dengan senyawa hasil sintesis.
2. Analisis Identifikasi Senyawa dengan Spektrofotometer Inframerah
Data hasil identifikasi senyawa dengan spektrofotometer inframerah didapatkan dari identifikasi pita absorbsi gugus fungsi pada senyawa hasil yang dibandingkan dengan senyawa induk yaitu asam 5-klorosalisilat.
3. Analisis Identifikasi Senyawa Spektrometer Resonansi Magnet Inti (1H- NMR)
Data hasil identifikasi struktur dengan spektrometer didapatkan dari integrasi relatif dan posisi puncak-puncak proton (atom H) spektra resonansi magnet inti yang terjadi. Didapatkan data berupa geseran kimia, multiplitas, jumlah atom H, dan dugaan atam H pada gugus.
4.5.4 Analisis Data Uji Aktivitas Analgesik 1. Penentuan Frekuensi Respon Nyeri
Masing-masing kelompok uji dilihat respon geliatnya, kemudian dicatat frekuensi geliatnya. Agar terlihat adanya perbedaan antara respon nyeri yang ditandai dengan adanya geliat pada mencit dari kelompok uji dan kelompok pembanding maka dilakukan uji ANOVA (one way anova) dengan nilai α adalah 0,05. Uji ANOVA (one way anova) yang dihubungkan dengan data uji aktivitas frekuensi geliat pada mencit, maka didapatkan hipotesis :
1. Ho = tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara frekuensi geliat mencit pada kelompok uji, kelompok pembanding dan kelompok kontrol.
2. Ha = terdapat perbedaan bermakna antara frekuensi geliat mencit pada kelompok uji, kelompok pembanding dan kelompok kontrol.
Setelah data diperoleh, maka data tersebut akan diolah secara statistik. Agar dapat menghasilkan sebuah kesimpulan adanya perbedaan yang bermakna pada kelompok uji, pembanding, dan kontrol maka kesimpulan tersebut akan ditarik berdasarkan harga p atau probabilitas pada α = 0,05, jika nilai p menunjukkan >
0,05 maka Ho dapat diterima dan Ha harus ditolak, sedangkan jika nilai p< 0,05 maka Ho harus ditolak dan Ha yang diterima.
3. Analisis Penentuan % Hambatan Nyeri
Frekuensi geliat pada mencit dari kelompok dosis dan kelompok kontrol dapat dijadikan data untuk mengitung % hambatan nyeri, rumusnya adalah sebagai berikut :
%Hambat nyeri = 𝑓𝑘−𝑓𝑡
𝑓𝑘 𝑥 100 Keterangan :
Fk : frekuensi geliat rata-rata mencit pada kelompok dosis atau uji Ft : frekuensi geliat rata-rata mencit pada kelompok kontrol 4. Analisis Penentuan ED50
Aktivitas analgesik dinyatakan dengan ED50. Definisi dari ED50 ialah dosis yang dapat menghasilkan hambatan nyeri setengahnya atau sebesar 50%. Dimana persentase hambatan nyeri dihubungkan dengan suatu kurva antara dosis dan%
proteksi. Cara untuk memperoleh kurva tersebut, ialah dosis di Log kan terlebih dahulu, sebagai sumbu x dan sumbu y dinyatakan dengan % hambatan nyeri.
Y = bx + a Keterangan:
Y = % hambatan nyeri x = dosis senyawa uji (mg)
Perhitungan ED50 dapat diperoleh menggunakan rumus : ED50 =
𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔 (𝑌−𝑏) 𝑀
