1
PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM LAKASE T. asperellum LBKURCC1 PADA BEBERAPA VARIASI pH dan SUHU
MENGGUNAKAN MICROPLATE READER λ 405 nm
Afmeritha Cheline*, Andi Dahliaty2
1Mahasiswa Program S1 Kimia
2Dosen Bidang Biokimia Jurusan Kimia
1,2Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia
*afmeritha.cheline4086@student.unri.ac.id ABSTRACT
Laccase (EC 1.10.3.2, p-diphenol:dioxygen oxidoreductase) is a copper- containing polyphenol oxidase. The laccase enzyme can be produced by fungi.
One of the fungi is Trichoderma asperellum. T. asperellum LBKURCC1 is one of the fungi that isolated from the cocoa plantations. The activity of the laccase enzyme is influenced by several factors, including pH and temperature. The purpose of this research was to determine the activity of the laccase enzyme at various pH and temperature using a microplate reader λ 405 nm. In this research, laccase was partially purified by the precipitation method of ammonium sulfate 20-80% and dialysis using ultrafiltration centrifugation (UF) with a membrane of 30,000 Dalton Molecular Weight Cut Of (MWCO) and the activity of the laccase enzyme was tested using the Microplate reader method. Based on this research, the highest activity of the laccase enzyme T. asperellum LBKURCC1 on ABTS was found to be at optimum pH (5.5 and 4.0) and an optimum temperature of 45oC, giving a laccase activity of (65.16 ± 14.26 and 59.83 ± 5.25) and (224.66 ± 17.39) U/L respectively.
Keyword: activity, enzyme, laccase, trichoderma ABSTRAK
Lakase (EC 1.10.3.2, p-difenol: dioksigen oksidoreduktase) adalah polifenol oksidase yang mengandung tembaga. Enzim lakase dapat dihasilkan oleh jamur. Salah satu jamur yang dapat menghasilkan enzim lakase adalah jamur T. asperellum. T. asperellum LBKURCC1 ini merupakan salah satu jamur yang diisolasi dari perkebunan kakao. Aktivitas enzim lakase dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya yaitu pH dan suhu. Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan aktivitas enzim lakase pada beberapa variasi pH dan suhu menggunakan microplate reader λ 405 nm. Pada penelitian ini, lakase dimurnikan sebagian dengan metode pengendapan garam ammonium sulfat 20-80% dan didialisis menggunakan sentrifugasi ultrafiltrasi (UF) dengan
2 membran 30.000 Dalton Molecular Weight Cut Of (MWCO) dan aktivitas enzim lakase di uji menggunakan Microplate Reader. Aktivitas tertinggi enzim lakase T. asperellum LBKURCC1 terhadap ABTS diperoleh pada pH (5,5 dan 4,0) dan suhu 45oC dengan nilai aktivitas masing-masing sebesar (65,16 ± 14,26 dan 59,83 ± 5,25) U/L dan 242,66 ± 29,79 U/L.
Kata kunci: aktivitas, enzim, lakase, trichoderma
PENDAHULUAN
Lakase (EC 1.10.3.2, p-difenol:
dioksigen oksidoreduktase) adalah polifenol oksidase yang mengandung tembaga. Lakase tersebar luas pada tanaman dan mikroorganisme (Baldrian, 2016). Salah satu jamur yang dapat menghasilkan enzim lakase adalah jamur T. asperellum.
Jamur ini mudah ditemui dilahan pertanian dan perkebunan. Enzim lakase memiliki potensi besar dibidang bioteknologi dan banyak diaplikasikan dalam bidang industri seperti degradasi warna limbah, delignifikasi pulp, dan bioremediasi (Iwara et al., 2021).
Aplikasi enzim lakase pada berbagai bidang industri memerlukan produksi yang besar dengan biaya yang rendah. Pengurangan biaya produksi enzim lakase dapat dilakukan dengan pemilihan mikroorgnisme yang tepat, optimisasi medium fermentasi, penambahan inducer, optimisasi kondisi proses seperti pH dan suhu.
Aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah satunya pH dan suhu. Setiap enzim memiliki suhu dan pH tertentu untuk dapat melakukan aktivitasnya secara maksimal (Gustina et al., 2018). pH
optimum enzim lakase berkisar antara 3,0-7,0 dan suhu optimum enzim lakase berkisar antara 35-60 oC (Husna et al., 2017).
Pada penelitian ini menggunakan ekstrak kasar enzim lakase dari T. asperellum LBKURCC1(Laboratorium Biokimia Universitas Riau Culture Collection I) yang merupakan isolat yang disimpan di Laboratorium Riset Enzim, Fermentasi dan Biomelekuler, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau. T. asperellum LBKURCC1 di isolasi dari rizosfer perkebunan cokelat di Kecamatan Rumbai, Kota Pekanbaru, Provinsi Riau (Nugroho et al., 2020).
Ekstrak kasar enzim lakase dari T. asperellum LBKURCC1 dilakukan pemurnian dengan pengendapan garam ammonium sulfat pada konsentrasi 20-80%.
Dilanjutkan dengan pemisahan menggunakan membran ultrafiltrasi 30.000 Dalton Moleculer Weight Cut Off (MWCO) dan dilakukan penentuan ativitas enzim lakase pada beberapa variasi pH dan temperatur. Uji aktivitas enzim dapat dilakukan menggunakan microplate
3 reader dan spektrofotometri
UV-Vis. Pengukuran aktivitas enzim lakase menggunakan spektrofotometri UV-Vis telah dilakukan oleh Nadyani (2022), yang merupakan salah satu anggota tim penelitian dalam penentuan aktivitas optimum enzim lakase pada variasi pH dan suhu.
Telah dilaporkan oleh Sudarson (2014) bahwa microplate reader dapat digunakan untuk mengukur aktivitas enzim. Alat ini banyak digunakan dalam ilmu biologi, tetapi penggunaannya dalam lingkungan kimia di Laboratorium Riset Enzim, Fermentasi dan Biomelekuler, Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Riau, masih terbatas.
Microplate reader atau yang disebut sebagai Enzyme- linked Immunosorbent Assay (Elisa) reader merupakan alat yang digunakan untuk mengukur nilai absorbansi suatu sampel, salah satu sampel yang digunakan adalah protein (Santoso et al., 2021). Penentuan aktivitas enzim pada beberapa variasi pH dan temperatur menggunakan microplate reader belum pernah diuji di Laboratorium Riset Enzim, Fermentasi dan Biomolekuler, Jurusan Kimia, Universitas Riau.
Keuntungan dari menggunakan microplate reader ini dapat melakukan analisis dengan volume sampel yang sedikit sehingga lebih praktis dan ekonomis, jumlah variasi sampel yang banyak sehingga lebih menghemat waktu dalam proses analisis,
throughput sampel yang tinggi dan kemudahan penggunaannya (Durand et al., 2012).
Oleh karena itu, pada penelitian ini menggunakan metode microplate reader untuk menentukan aktivitas enzim lakase pada beberapa variasi pH dan temperatur. Dengan digunakannya metode ini dapat mempercepat proses analisis dalam penelitian yang biasanya jika menggunakan spektrofotometri membutuhkan waktu analisis sampel 1-2 jam, sedangkan dengan menggunakan metode microplate reader hanya membutuhkan waktu 15-20 menit untuk analisis sampel, lebih praktis dan ekonomis. Sehingga lebih efesien dan mempermudah peneliti dalam melakukan pengukuran suatu sampel selama melakukan penelitian.
METODOLOGI PENELITIAN a. Alat dan bahan
Alat yang digunakan untuk melakukan penelitian ini adalah pipet mikro (Socorex Acura 825, pH meter (HORIBA Scientific), timbangan analitik, waterbath (Sibata waterbath WK-24), membran ultrafiltrasi 30.000 Dalton MWCO (Moleculer Weight Cut off), pipet Multi Channel, Microplate Reader (Berthold TriStar 1941) λ 405 nm, microwell plate dan alat-alat gelas laboratorium lainnya yang digunakan sesuai prosedur kerja.
4 Bahan-bahan yang digunakan
dalam penelitian ini adalah enzim lakase yang berasal dari isolat jamur Trichoderma asperelloides LBKURCC1 koleksi Laboratorium Riset Enzim, Fermentasi, dan Biologi molekuler, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau, garam ammonium sulfat ((NH4)2SO4) (SIGMA Aldrich A 4418-5006), asam asetat glasial (CH3COOH), natrium asetat (CH3COONa), disodium phosfat (Na2HPO4), monosodium phospat (NaH2PO4), ABTS (2,2-Azinobis 3- ethyl benzothiazoline 6- sulfonic acid) (SIGMA A1888) dan aqua DM.
b. Fraksinasi menggunakan garam ammonium sulfat
Ekstrak kasar enzim lakase dari jamur T. asperellum LBKURCC1 sebanyak 100 mL ditambahkan garam ammonium sulfat dengan kejenuhan 20-80%. Diaduk menggunakan magnetic stirrer pada suhu dingin selama 1 jam (larut). Larutan dimasukkan kedalam tabung sentrifugasi.
Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit, sehingga diperoleh endapan dan supernatan kemudian dipisahkan. Sehingga diperoleh endapan berwarna kuning kecoklatan.
c. Pemurnian menggunakan membran ultrafiltrasi
Endapan yang telah didapatkan dari hasil fraksinasi dengan garam ammoniun sulfat dilarutkan dengan 150 mL bufer Asetat 0,05 M pH 5,5 dan didialisis dengan membran ultrafiltrasi yang memiliki 30.000 Dalton (30 kDa) Molecular Weight Cut Of (MWCO), disentrifugasi dengan kecepatan 9.000 rpm selama 10 menit pada suhu dingin dan di cuci beberapa kali dengan bufer Asetat 0,05 M pH 5,5 hingga didapatkan enzim berwarna bening kekuningan.
d. Uji aktivitas enzim terhadap variasi pH
Penentuan aktivitas enzim lakase dilakukan pada suhu ruang 30C dengan variasi pH (buffer asetat 4,0; 4,5; 5,0; 5,5) dan (buffer fosfat 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0) menggunakan substrat 2,2’- azinobis-3- etilbenzothiazoline- 6- asam sulfonate (ABTS) yang diukur menggunakan microplate reader (Berthold TriStar 1941) pada panjang gelombang 405 nm dengan interval waktu 0 dan 5 menit. 180 µL buffer asetat pH 4,0 dan 10 µL enzim lakase dimasukkan kedalam 96-sumur (microwell plate) 180 µL buffer asetat pH 4,0 dan 10 µL enzim lakase dimasukkan kedalam 96-sumur (microwell plate). Sebagai kontrol digunakan enzim terdenaturasi. Hal yang sama dilakukan sebanyak 5 kali pengulangan dengan variasi pH 4,0;
4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0.
5 e. Uji aktivitas enzim terhadap
variasi suhu
Penentuan aktivitas enzim lakase dilakukan pada variasi suhu 30; 35;
40; 45; 50; 55; dan 60oC menggunakan larutan buffer dengan pH optimum yang telah diperoleh dari uji sebelumnya dan ABTS sebagai substrat. Larutan sampel dan kontrol terdiri dari buffer 180 µL dan 10 µL ABTS dimasukkan kedalam eppendorf dan diinkubasi menggunakan water bath selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 10 µL enzim lakase kedalam larutan sampel dan 10 µL enzim terdenaturasi kedalam larutan kontrol. Larutan dimasukkan kedalam 96-sumur (microwell plate) menggunakan micropipet multi channel dan diukur absorbansinya menggunakan microplate reader (Berthold TriStar 1941) pada panjang gelombang 405 nm untuk waktu 0 menit. Hal yang sama juga dilakukan untuk waktu 5 menit. Kemudian dilakukan sebanyak 5 kali pengulangan pada suhu yang akan ditentukan.
f. Analisis data
Data aktivitas enzim pada variasi pH dan suhu dianalisis secara statistic menggunakan tes Anova dan dilanjutkan dengan tes Duncan jarak berganda dengan taraf 5 % menggunakan program SPSS dan disajikan dalam bentuk tabel dan grafik.
HASIL DAN PEMBAHASAN a. Pengaruh pH terhadap aktivitas
enzim lakase
Penentuan aktivitas enzim lakase dilakukan pada beberapa variasi pH, yaitu pH (buffer asetat 4,0-5,5 dan buffer fosfat 6,0-8,0) pada interval pH 0,5 pada suhu kamar (30oC).
Hasil yang diperoleh ditunjukkan pada Gambar 1. dan Tabel 1.
Aktivitas enzim tertinggi berada pada pH 5,5 dan 4,0 (tidak berbeda nyata) dengan nilai aktivitas sebesar (65,16 dan 59,83) U/L. Menurut Barizi et al., (2020) hal ini membuktikan bahwa ada nya dua enzim yang berbeda yang terdapat pada T. asperellum. Dua gen enzim ini dapat berkativitas dengan baik pada dua pH dari hasil uji yang telah dilakukan. Terjadi penurunan aktivitas pada pH 6 dan 6,5 dan pada pH 7,0 -8,0 enzim sudah tidak beraktivitas. Menurut Husna et al.
(2017), pH optimum enzim lakase bekisar antara 3,0 – 7,0.
Peningkatan aktivitas dari pH 4,0 dan mengalami penurunan pada pH 4,5. Hingga mencapai pH optmum pada pH 5,5 dan terus menurun seiring peningkatan nilai pH buffer.
Penurunan pH yang terjadi pada pH 6,0-8,0 disebabkan karena meningkatnya konsentrasi [OH-] yang menyebabkan aktivator yang dapat mempengaruhi aktivitas katalitik sisi aktif enzim. Perubahan pH berpengaruh terhadap perubahan ionisasi rantai samping asam amino
8 sehingga menyebabkan terjadinya
penurunan kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim tersebut (Kusumaningrum et al., 2019).
Pada penelitian ini aktivitas enzim lakase tertinggi diperoleh pada suhu 45oC yang berbeda secara signifikan dengan variasi suhu lainnya. Menurut Firliani et al., (2015) enzim yang mampu beraktivitas pada suhu 45-88oC tergolong enzim termofiik. Enzim termofilik mengandung protein tahan panas dan tahan denaturasi sehingga mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang bersuhu ekstrim.
Enzim termofilik biasanya dapat digunakan dalam dunia industri.
KESIMPULAN
Aktivitas tertinggi enzim lakase pada uji variasi pH diperoleh pada pH 5,5 dan 4,0 yang tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan jarak bergenda (Duncan’s Multiple Range Test) pada taraf 5% (p 0,05) dengan nilai sebesar (65,16 ± 14,28) dan (59,83 ± 5,25) U/L. Aktivitas tertinggi enzim lakase pada uji variasi suhu diperoleh pada temperatur 45oC dengan nilai aktivitas sebesar 224,66 ± 17,39 U/L
DAFTAR PUSTAKA
Baldrian P., Wiesche, C., Gabriel, J., Nerud, F., & Zadrazil F.
2000. Influence of cadmium and mercury on activities of ligninolytic enzymes and degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Pleurotus ostreatus in soil.
Appl Environ Microbiol. 66:
2471- 2478.
Barizi, A., Iti'anah, D., dan Utami, U.
2020. Karakterisasi enzim amilase dari bakteri bacillus megaterium pada variasi suhu, pH dan konsentrasi substrat. Jurnal Riset Biologi dan Aplikasinya. 2(1): 11-17.
Durand, A., Chase, Z., Remenyi, T.,
& Queroue, F. 2012.
Microplate-reader method for the rapid analysis of copper in natural waters with chemiluminescence detection.
Frontiers in Microbiology.
3(1): 437.
Gustina, Helianty, S., & Dahliaty, A.
2018. Produksi Enzim Lakase Oleh Jamur Trichoderma asperellum LBKURCC1 Dalam Bioreactor Tray Menggunakan Variasi Ukuran Substrat Jerami Padi Dan Induser CuSO4 Pada Fermentasi Kultur Padat. Jom FTEKNIK. 5(2): 1.
Husna, N. R., Hasri., & Sudding.
2017. Pengaruh ph terhadap degradasi pewarnadirect blue menggunakan jamur pelapuk kayu (pleurotus flabellatus).
Jurnal Kimia Riset. 2(2):
140-146
Igem, U. 2019. proof of concept protocol upsala igem.
Availablefrom:https://static.ig em.org/mediwiki/2019/d/d7T Uppsala_Universitetenzymep rotocols.pdf. Accesed 24 march 2019.
Iwara, B. S., Helianty, S., Dahliaty, A., Program, M., Kimia, S. T.
2021. Produksi enzim lakase oleh jamur Trichoderma
9 asperelloides LBKURCC2
menggunakan substrat jerami padi secara fermentasi kultur padat dengan variasi waktu fermentasi dan laju aerasi 1,5 L/M 1). Jom FTEKNIK. 8(1):
1-6.
Kusumaningrum, A., Gunan, I. bagus wayan, & Wijaya, M.
mahaputra. 2019. Optimasi suhu dan ph terhadap
aktivitas enzim
endoglukanase menggunakan
response surface
methodology ( RSM ). Jurnal Rekayasa Dan Manajemen Agroindustri. 7(2): 243–253.
Nadyani, K. 2022. Optimasi pH dan Suhu Pada Reaksi Enzimatis Lakase Trichoderma asperellum LBKURCC1 Hasil Fraksinasi 20-80 Ammonium Sulfat. Skripsi.
Pekanbaru: Universitas Riau.
Nelson, D. L., dan Cox, M. M. 2008.
Lehninger Principles of Biochemistry. W. H.
Freeman.
Nugroho, T. T., Sellyna, N., Miranti., Nurulita, Y., Saputra, E., dan Utama, P. S. 2020.
Optimasilisasi waktu fermentasi, kadar air dan konsentrasi Cu2+ pada produksi lakase Trichoderma asperellum LBKURCC1
secara fermentasi padat batang padi dalam reaktor labu. 1(8): 7-16.
Firliani, W., Agustin, A., dan Febria, F. A. 2015. Karakteriasi bakteri termofilik penghasil enzim protase netral. Jurnal Biologi Universitas Andalas.
4(1): 9-14.
Santoso, K., Herowati, U. K., Rotinsulu, D. A., Murtini, S., Ridwan, M. Y., Hikman, D.
W., Zahid, A., Wicaksono, A., Nugraha, A. B., Afiff, U., Wijaya, A., Arif, R., Tarigan, R., & Sukmawinata, E. 2021.
Comparison of colorimetric- based rabies postvaccination antibody titer detection using elisa reader and mobile phone camera. Jurnal Veteriner.
22(1): 79–85.
Sudarson, J., Ramalingam, S., Kishorekumar, P., &
Venkatesan, K. 2014.
Expeditious Quantification of Lignocellulolytic Enzymes from Indigenous Wood Rot and Litter Degrading Fungi from Tropical Dry Evergreen Forests of Tamil Nadu.
Biotechnology Research International.
