PEMBUATAN DNA REKOMBINAN

PEMBUATAN DNA

2

Nama enzim restriksi

o  Berdasarkan nama organisme dari mana enzim

diisolasi, mis.:

n  Eco dari Escherichia coli

n  Hin dari Haemophilus influenzae n  Hae dari Haemophilus aegyptius

o  Diikuti oleh nama strain (bila perlu)

o  Diikuti oleh angka Romawi

n  Menunjukkan ada lebih dari satu macam enzim

Cara kerja enzim restriksi

o 

Mengkatalisis hidrolisis ikatan fosfodiester dari

4

Pemotongan DNA oleh enzim

restriksi

o 

Memotong DNA pada

n  urutan spesifik = urutan pengenalan

(recognition sequence)

n  lokasi spesifik = sisi restriksi (restriction site) o 

Hasil pemotongan

n  Simetris: urutan pengenalan palindrom

n  Tidak simetris: urutan pengenalan panjang dan

Hasil pemotongan enzim restriksi

o  Simetris

n  Ujung lancip

n  Ujung tumpul

n  Ujung lancip

o  Tidak simetris

6

Contoh beberapa macam enzim

restriksi tipe II

o  HindII

o  HindIII

o  PstI

o  MboI (frekuensi tinggi)

o  SmaI

o  Xma I

o  PspAI

n  Py =T atau C; Pu = A atau G)

n  Isoskizomer = Dua enzim restriksi yang dapat mengenali

urutan DNA yang sama yang berasal dari organisme berbeda → sisi restriksi bisa sama atau berbeda

o  GTPy PuAC

o  A AGCTT o  CTGCA G o  N GATCN o  CCC GGG o  C CCGGG o  C CCGGG

Pemotongan dan penyambungan

kembali DNA

o  Pemotongan DNA: 5’- NNNGAATTCNNN -3’

3’- NNNCTTAAGNNN -5’

EcoRI

5’- NNNG AATTCNNN -3’

3’- NNNCTTAA GNNN -5’

o  Penyambungan 5’- NNNG _{OH P}AATTCNNN -3’

kembali 3’- NNNCTTAA_{P OH}GNNN -5’

8

Menyambung DNA

o  Ligase

Berasal dari

Ligasi ujung tumpul

o  Ujung tumpul dapat diligasi dengan ujung tumpul

o  Ujung lancip dapat dijadikan ujung tumpul:

n  Ujung 5’ yang ssDNA: dengan DNA polimerase I dan dNTP n  Melepaskan bagian yang ssDNA dengan T4 DNA

polimerase

p Mempunyai aktivitas DNA polimerase 5’ → 3’ p Mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’

n  Hasil ligasi tidak dapat dipotong lagi pada sisi yang sama

10

Ligasi ujung lancip

o  Ujung ssDNA sama/komplementer, DNA dapat

diligasi

n  BamHI 5’ -...G ↓ GATCC...-3’

n  BclI 5’ -...A ↓ GATCT...-3’

n  Sau3AI 5’ -... ↓ GATC ...-3’

n  BstYI 5’ -...R ↓ GATCY ...-3’

o  Bila DNA hasil pemotongan BamHI diligasi dengan

DNA hasil pemotongan BclI, hasil ligasinya dapat dipotong dengan enzim apa?

VEKTOR KLONING

(1)

o 

M

olekul DNA yang

:

n  dapat bereplikasi sendiri di dalam sel

n  dimana DNA asing dapat dimasukkan

n  Ada marker:

p untuk mendeteksi adanya vektor

p untuk mendeteksi adanya DNA asing

o 

Macam-macam marker

n  gen resistensi antibiotik

n  gen lacZ (β-galaktosidase)

12

VEKTOR KLONING

(2)

o 

P

lasmid

o 

V

irus

n  Bakteriofag lambda n  Bakteriofag M13

o 

K

ombinasi dari

plasmid dan virus

n  Kosmid n  Phagemid

Dasar p

emilihan vektor

n  Ukuran DNA asing yang akan dimasukkan ke

dalam sel

n  Galur sel inang yang akan digunakan

n  Eksperimen yang akan dilakukan setelah

kloning

p Apakah gen akan diekspresi?

p Apakah diperlukan modifikasi pasca translasi pada

14

Plasmid

o  dsDNA

o  berbentuk lingkaran tertutup

o  1 – 200 kb

o  Jumlah plasmid di dalam sel: 1 – 700 (tergantung

macam plasmidnya)

o  Vektor kloning

n  Sisi pemotongan enzim restriksi yang unik n  Marker seleksi kehadiran plasmid (resistensi

antibiotik)

n  Marker seleksi kehadiran DNA sisipan (lacZ) n  pBR322, pUC10

o  Shuttle vector

n  Dapat bereplikasi di dalam > 1 spesies n  YEp24 dapat bereplikasi di E. coli & ragi

Plasmid pBR322

o  Marker seleksi: gen

resistensi tetrasiklin dan ampisilin

o  Ori = origin of replication,

sekuens yang

memungkinkan plasmid dapat menggandakan diri dalam bakteri

o  DNA disisipkan ke dalam sisi

kloning:

n  BamHI: sensitif tetrasiklin

n  PstI: sensitif ampisilin

p BR3 2 2

a m p r tet r o ri Ec o RI Hin d III Ba m HI Sa lI PstI Ava I 4,36  kb

16

Plasmid pUC18/pUC19

o  Sisi kloning

dalam gen lacZ

o  Ada IPTG & Xgal

n  lacZ aktif

n  Xgal berubah

menjadi biru

o  Seleksi biru-putih

p UC 18 /p UC 1 9 a m p r lac_Z o ri Eco Sac Kpn Sma Xma RI I I I I Bam Xbo Sal Acc Hin Pst Sph Hin III HI I I I cII I I d 2,69  kb la cI MC S

18

20

Vektor kloning khusus

o 

Vektor ekspresi

n  Gen asing diekspresi & produksi protein tinggi

n  Promoter

n  Sisi pengikatan ribosom (SD)

n  Kodon start dekat sisi kloning

n  Signal terminasi transkripsi

o 

Vektor untuk mempelajari daerah regulator

pada DNA

Vector ekspresi pKK233-2

Marker seleksi Promoter tac

RBS

Sisi pengenalan enzim restriksi yang unik

Txn = terminator Tidak ditunjukkan: ori replikasi DNA

22

Ekspresi gen dari promoter

yang kuat dan dapat diregulasi

o 

Transkripsi merupakan titik kontrol yang paling

penting

n 

Dikontrol oleh promoter dari gen

o 

Dua sifat penting dari promoter

n 

Kuat

p  Afinitas tinggi terhadap RNA polimerase p  Ikatan kuat - sering ditranskripsi

p  Ikatan lemah - RNA polimerase lepas

tidak ada transkripsi

n 

Dapat diregulasi

p  Kapan gen diekspresi dapat dikontrol p  gunakan induser / ko-represor

Promoter yang penting dalam

vektor ekspresi

E. coli

o 

lac (atau lacUV5)

o 

trp

o 

tac (atau trc)

o 

p

L

dari fag

_λ

24

tac (trc) promoter

o 

Hibrid dari promoter

lac

dan

trp

daerah -35 dari

trp

daerah -10 dari

lac

n 

terpisah 16 pb = promoter

tac

n 

terpisah 17 bp = promoter

trc

o 

3x lebih kuat dari

trp

o 

10x lebih kuat dari

lac

Promoter

_λ

p

L

o 

promoter pL diregulasi oleh represor

_λ

o 

represor

_λ

dikode gen cI

o 

Digunakan gen cI mutan

n 

Mutasi kondisional

n 

Mutan sensitif suhu

p  28-30°C = suhu permisif

n  fenotipe normal

n  Tidak ada ekspresi gen yang dikontrol represor cI p  42°C = suhu restriktif

26

Regulasi oleh promoter p

L

pcI _{cI o}L _pL

protein cI aktif

mRNA

A) 30°C

Regulasi oleh promoter p

L

protein cI aktif

mRNA

B) 42°C

protein cI

tidak aktif

28

Promoter gen 10 fag T7

o 

Semua promoter fag T7 (termasuk gen

10) memerlukan RNA Polimerase T7

untuk ekspresinya

n  Letakkan gen RNA Pol T7 di bawah kontrol

promoter lac dalam sel E.coli

n  Letakkan Gen target di bawah kontrol

Promoter gen 10 fag T7

pro

lac

Gen RNA Pol

T7

pro g10

Gen target

Protein

target

Induser _{RNA Pol T7}

30

Promoter gen 10 fag T7

o 

Ekspresi gen RNA polimerase T7

dikontrol oleh induser operon lac

n  Laktosa (allolaktosa) ATAU

n  IPTG (iso-propil thio galaktosida)

p 

Tidak dimetabolisasi seperti laktosa

Transformasi

o 

Transformasi

n  Memasukkan DNA ke dalam sel

n  Sel ditransformasi,

sedangkan

DNA mentransformasi sel

o 

Transforman

n  Sel yang telah ditransformasi

Transformasi dengan metode CaCl

₂

o 

Bakteri

n  ditumbuhkan sampai <108 sel/ml

(pertengahan fase logaritmik)

n  Diberi perlakuan dengan CaCl₂ dingin

n  Diberi kejutan panas yang singkat.

o 

Perlakuan ini menyebabkan sel bakteri

menjadi kompeten untuk sementara,

sehingga dapat menerima DNA dari luar

sel

Setelah transformasi sel bakteri

o 

Bakteri ditumbuhkan

o 

Seleksi sel bakteri yang berhasil ditransformasi

plasmid

n  Medium diberi antibiotik

n  Bakteri perlu diberi kesempatan untuk mengekspresi

gen resistensi antibiotik yang ada di plasmid sebelum antibiotik ditambahkan pada medium pertumbuhan bakteri