BIOTEKNOLOGI MACAM KULTUR JARINGAN

(1)

BIOTEKNOLOGI

MACAM

▸ Baca selengkapnya: contoh soal kultur jaringan

(2)

BAB 7

MACAM TEKNIK KULTUR JARINGAN

TEKNIK

KULJAR

ORGAN

KALUS

PROTOPL

ASMA

HAPLOID

(3)

BAB 6

1. KULTUR ORGAN

Kultur sel

Kultur Akar dan Meristem

Kultur Pucuk

(4)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL

• Adalah pembudidayaan /pemeliharaan sel tunggal maupun gabungan beberapa sel, dalam lingkungan buatan (medium buatan) yang steril

• Kultur sel terdiri atas populasi sel dengan laju pertumbuhan yang cepat karena seluruh

permukaan sel dapat kontak langsung dengan medium nutrisi

• Kultur sel mempunyai metabolisme yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan kultur kalus

• Salah satu bagian yang sering dijadikan sumber eksplan dalam kultur sel adalah daun.

• Daun yang dipilih adalah daun yang sudah membuka sempurna, tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda, dan diperkirakan masih sebagai source

(5)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL

• Potongan daun Chenopodium rubrum yang mengambang pada media MS, sel mesofilnya membelah dengan cepat. Setelah 4 hari, potongan daun terpisah sempurna dan membebaskan sel dalam jumlah yang besar

Penanaman

dalam

media cair

• Mengupas jaringan epidermis (dapat pula dengan cara di blender), kemudian jaringan yang tanpa epidermis disikat. Dimasukan larutan osmotikum (manitol, sorbitol, Mg Cl₂, Ca Cl₂) dengan pH 3

Secara

Mekanis

• Menggunakan enzim pektinase atau poligalacturonase, yang dapat melarutkan senyawa pektat sehingga lamella tengah melunak dan akhirnya sel sel terpisah

Secara

Enzimatis

(6)

(7)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL –

KEGUNAAN KULTUR SEL

• Produksi metabolit sekunder, obat-obatan, senyawa flavor/pewangi, pewarna. Metabolit sekunder biasanya diekstrak dari akar

tanaman, polong, buah dll • Mempelajari metabolisme sel

• Menguji pengaruh berbagai senyawa terhadap sel

• Mendapatkan biomasa sel untuk kutur protoplas

Kelebihan kultur sel :

- Tanaman yang dihasilkan bebas dari hama penyakit serta faktor lingkungan lainnya - Dapat dilakukan secara terus menerus

(8)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL – LANGKAH

(9)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL – LANGKAH

(10)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL

(11)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL – STUDI

KASUS PADA TEH

Penggunaan kultur sel untuk pembentukan bibit teh :

1. Induksi kalus

2. Pembuatan suspensi sel

3. Agregat sel untuk induksi embrio 4. Pendewasaan embrio

5. Perkecambahan embrio dan seleksi bibit

1. Induksi Kalus :

• Tahap awal dari kultur sel adalah induksi kalus sebagai sumber suspensi sel

• Bahan tanaman (eksplan dikulturkan pada medium padat buatan dengan perlakuan sesuai untuk induksi kalus selama 6-8 hari

(12)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL – STUDI

KASUS PADA TEH

1. Induksi kalus

2. Pembuatan suspensi sel :

• Kalus yang terbentuk dipotong kecil-kecil (lembut) kemudian dimasukkan ke dalam tabung

erlenmeyer yang berisi media cair dengan atau tanpa penambahan enzim untuk memisahkan agregat sel menjadi sel tunggal

• Tabung kemudian aduk dengan orbital shaker berkecepatan sekitar 80 rpm (putaran per menit) selama seminggu.

• Selanjutnya, media disaring dengan kain

Marycloth yang mempunyai ukuran lubang atau mesh 100-200 mđm,sehingga sel-sel yang

terpisah atau berbentuk tunggal akan lolos dari saringan dan diperoleh suspensi sel murni. • Suspensi sel ditumbuhkan pada medium baru,

digojog secara orbital selama 6-8 hr sampai terbentuk agregat sel kompak

(13)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL – STUDI

KASUS PADA TEH

1. Induksi kalus

3. Agregat sel untuk induksi embrio:

• Agregat sel dikulturkan dalam botol jam yang berisi medium padat untuk induksi embrio somatik

• Botol dikulturkan dalam ruang terang cahaya baur selama 6-8 hr. Mulai umur 4-5 hr, akan terlihat bulatan bulatan kuning keputihan yang

sebenarnya adalah proses inisiasi pertumbuhan embrio

• Setelah berumur lebih dari 6 hr, bentuk dan ukuran embrio makin jelas dan membesar sehingga bisa dipindah atau disubkultur ke medium untuk pendewasaan embrio somatik.

(14)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL – STUDI

KASUS PADA TEH

1. Induksi kalus

4. Pendewasaan embrio :

• Pada tahap ini, digunakan botol jam sebagai tempat media padat dan kultur pro-embrio atau embrio muda

• Botol kemudian ditempatkan dalam ruang terang cahaya baur

• Pro-embrio atau embrio stadium muda (fase globular) dipindah atau disubkultur pada media padat untuk pendewasaan embrio sampai bentuk kotiledon dan siap dikecambahkan

(15)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR SEL – STUDI

KASUS PADA TEH

1. Induksi kalus

5. Perkecambahan embrio dan seleksi bibit:

• Pada tahap ini, kecambah ditanam pada media padat dengan perlakuan untuk pembesaran kecambah (planlet muda).

• Kemudian ditempatkan pada ruang terang cahaya langsung dari lampu TL 40 W dengan lama

penyinaran 12-14 jam/hari.

• Pada umur 4-6 hr, bibit sudah membesar dengan daun dan akar yang makin banyak.

• Pada umur 8 hr atau lebih, perakaran makin baik sehingga bibit siap diseleksi untuk diaklimatisasi di rumah kaca pada media tumbuh berupa tanah, pasir dan bahan organik.

• Tempat kultur berupa plastik polibag warna hitam. Setelah bibit membesar dengan tunas, daun, dan perakaran yang makin kuat, bibit

dipindahkan ke persemaian sampai siap ditanam di lapang atau kebun.

(16)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR AKAR

Kultur akar adalah proses diferensiasi dan fungsi dari jaringan-jaringan khusus yang dieksplorasi dalam kultur in vitro

Kultur akar yang sudah diisolasi :

- Sifat morfologi sama seperti akar tanaman - Pola penyebaran pembuluh spesifik dari

spesies (quiscent center)

- Cabang-cabang lateral terbentuk (dapat diatur dengan pemberian hara tertentu dan penyinaran

Teknik kultur akar :

• Ditumbuhkan dlm media cair dg pengocokan perlahan2

 Garam makro & mikro  ion jodium (White)  Besi

 Sukrosa (utk bbrp jenis graminae, glukosa lebih baik)

 Kombinasi vitamin : thiamine, pyridoxine, nicotinic acid, glicyne (Pengganti fungsi ekstrak ragi)

• Auksin & sitokinin tdk selalu dibutuhkan. Auksin dibutuhkan akar pinus & bbrp

(17)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR AKAR

• Giberelin merangsang akar dr kultivar kerdil, tdk berpengaruh pd

kultivar norma

• pH 5.0 – 5.5 (perpanj akar) ; 6.0 – 6.5 (inisiasi akar lateral)

• Cahaya rendah merangsang pertumb akar pd bbrp species

• Temperatur : 25 – 27oC

• Sumber eksplan : akar kecambah aseptik, akar adventif dlm kalus

(18)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR MERISTEM

 Kul-jar tanaman dg eksplan jaringan2 meristematik

• Meristem pucuk terminal / tunas aksilar • Untuk mendapatkan tnm sempurna,

memperbanyak tanaman

 Penerapan :

• Perbanyakan tanaman, terutama hortikultura

• Eliminasi virus dari bahan tanaman • Penyimpanan plasma nutfah dg

cryopreservation

 Tanaman yg dihasilkan berkembang dr

jaringan vegetatif, planlet hasil merupakan klon (mericlone)

(19)

BAB 7

KULTUR MERISTEM – STUDI KASUS PADA KALUS ANGGREK CYMBIDIUM

(Morel, 1960 dalam Dodds dan Robert, 1982)

• Membentuk kalus  protocorm  massa protocorm

• Dipisah2, ditumbuhkan di media serupa  massa protocorm baru

• Dipindahkan pd media lain unt proses

pendewasaan dan pengakaran  tnm baru yg sempurna, siap pindah lapang

Media Murashige

• Kultur meristem & kultur pucuk teknik perbanyakan tnm hortikultura

• 10 thn mengemb teknik2 standard unt beberapa jenis tanaman (tnm hias sampai buah2 an)

• Penggunaan auksin dan sitokinin, perlu dlm kultur yg dikembangkan

(20)

BAB 7

KULTUR MERISTEM – STUDI KASUS PADA KALUS ANGGREK CYMBIDIUM

(Morel, 1960 dalam Dodds dan Robert, 1982)

• Membentuk kalus  protocorm  massa protocorm

• Dipisah2, ditumbuhkan di media serupa  massa protocorm baru

• Dipindahkan pd media lain unt proses

pendewasaan dan pengakaran  tnm baru yg sempurna, siap pindah lapang

Media Murashige

• Kultur meristem & kultur pucuk teknik perbanyakan tnm hortikultura

• 10 thn mengemb teknik2 standard unt beberapa jenis tanaman (tnm hias sampai buah2 an)

• Penggunaan auksin dan sitokinin, perlu dlm kultur yg dikembangkan

(21)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR PUCUK

• Pucuk (berisi meristem & jaringan2 di bawahnya), lebih mudah diisolasi

• Ukuran bahan awal : 0.3 – 1.0 cm

• Tujuan praktis : perbanyakan vegetatif tanaman

• Pucuk awal, dlm media tepat membentuk pucuk baru dg jumlah tergantung jenis (4 – 20an). Stl diinduksi pembentukan akar,

terbentuk tnm sempurna fotocopy induknya • Merupakan dasar dr kegiatan perbanyakan

dalam lab komersial

• Pertumbuhan pucuk : perlu zpt dlm media Auksin : IAA, NAA, IBA (2,4-D dihindarkan) Sitokinin : BAP, 2iP, kinetin (konsentrasi sitokinin > auksin)

Teknik subkultur berulang tunas kentang :

• Eksplan awal : tunas kentang bebas virus • Satu tunas pucuk/tunas ketiak ditumbuhkan

dalam media perbanyakan

• Tumbuh buku-buku dg masing2 satu tunas ketiak

• Setiap 4 mgg tunas dipanen dan dipotong2 mjd buku2 tunggal atau bbrp buku (3-4 buku) • Dikulturkan lagi dlm media baru

• Demikian seterusnya setiap 4 minggu dilakukan kultur berulang

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR EMBRIO

• Isolasi secara steril embrio matang ataupun belum matang, dengan tujuan memperoleh tanaman yang viabel

• macam kultur embrio:

1. kultur embrio yg belum matang, utk mencegah keguguran : embryo rescue 2. Kultur embrio matang, utk merangsang

perkecambahan : embryo culture

• Tujuan : membantu perkecambahan embrio mjd tanaman lengkap

• Diperlukan dlm embrio yg memp masalah :

 Menunjukkan masa dormansi yang panjang  Embrio hibrida hasil penyilangan interspesifik

yg tidak kompatibel dg endospermnya  Embrio dg endosperm yg rusak spt kelapa

kopyor

 Embrio tanpa endosperm spt pd anggrek • Penting dlm ilmu fisiologi, dlm hal perkembangan

embrio

 Pengertian ttg kebutuhan nutrisi embrio pd berbagai tahap perkembangan (Percobaan media perlakuan )

 Kemampuan regenerasi dr potongan2 embrio

(27)

BAB 7

KULTUR EMBRIO –CONTOH DAN FAKTOR YANG

MEMPENGARUHI KEBERHASILAN

1. Memecahkan dormansi

- Pd Musa balbisiana, tdk mungkin memperoleh perkecambahan secara normal - Cherry, hazel, acer : tanaman yg memiliki dormansi panjang

2. Mencegah gugurnya embrio pd persilangan interspesifik

- Persilangan ini sering menghasilkan biji dengan endosperm yg tdk sempurna, atau embrio yg lemah, kecil. Contoh: Kacang, Kapas, Tomat, Padi.

3. Hibridisasi utk produksi triploid (buah tanpa biji) - Jeruk triploid Citrus sinensis

Diploid citrus X tetraploid citrus = jeruk tanpa biji - Pisang triploid

(28)

BAB 7

KULTUR EMBRIO –CONTOH DAN FAKTOR YANG

MEMPENGARUHI KEBERHASILAN

Faktor yang mempengaruhi Genotip Genotip mennetukan mudah tidaknya embrio

diisolasi dan ditumbuhkan

Tahap embrio diisolasi

Prinsipnya embrio yang lebih besar akan lebih

baik

Tanaman inang

Sebaiknya ditumbuhkan di rumah kaca / kondisi

terkontrol

Media kultur embrio

- Hara makro dan mikro - pH 5,0 – 6,0

- Sukrosa sbg sumber energi, embrio belum matang perlu 8-12%, embrio matang perlu 3%

- Auksin dan sitokinin tidak diperlukan. GA untuk memecah dormansi - Vitamin - Senyawa organik Lingkungan

- Oksigen (perlu oksigen tinggi)

- Cahaya : kadang embrio perlu ditumbuhkan dalam gelap selama 14 hari. Kemudian ditransfer

ke cahaya untuk merangsang sintesa

protein

- Suhu : kadang perlu perlakuan dingin untuk

(29)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR EMBRIO

Embrio rescue pada anggrek :

• Biji mrpkan sumber eksplan yg bagus • 1 kapsul anggrek berisi 1500 – 3 juta biji • Biji sangat kecil, hampir tdk memiliki

cadangan makanan, shg benih sulit

berkecambah di tanah. Mudah terancam kekeringan dan serangan hama penyakit • Perbanyakan in vitro memberi alternatif

lingkungan terproteksi, nutrisi yg cukup, dan bebas serangan bakteri atau jamur

(30)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR EMBRIO

Proses Perkecambahan :

• Benih menyerap air melalui testa

• Embrio mengalami imbibisi, membengkak, pembelahan sel dimulai, dan embrio

menembus kulit biji

• Protocorm terbentuk dari massa embrio • Diferensiasi organ dimulai dg pembentukan

meristem tunas & rhizoid

• Jk ada chy, daun terbentuk, diikuti oleh akar sejati. Rhizoid & protocorm tdk berfungsi lagi dan terdegenerasi

(31)

(32)

BAB 7

1. KULTUR ORGAN – KULTUR EMBRIO

Teknik kultur embrio anggrek :

1. Sterilisasi kapsul/benih anggrek:

- Lebih baik menggunakan kapsul (buah anggrek) yg belum terbuka, karena sterilisasi lebih mudah

- Sterilisasi kapsul yg belum terbuka dg cara merendam dlm 95% alkohol dan ‘flaming’

- Di dalam laminer, buka kapsul dg menggunakan skalpel steril. Biji dlm kapsul biasanya steril.

- Jk kapsul sdh terbuka, benih perlu disterilisasi. Rendam dlm 2% NaOCl

2. Cara penanaman benih anggrek

- Benih ditaburkan pd permukaan media padat dlm wadah dg permukaan luas, misal. Botol jam atau botol saus yang diletakkan mendatar.

- Jangan terlalu banyak benih yg ditanam, supaya setelah benih berkecambah tidak terlalu rapat - Perlu subkultur 2 -3 kali sebelum ditransfer ke

(33)

BAB 7

2. KULTUR KALUS

Pengertian kalus :

• Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang

membelah diri secara terus menerus • Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel

parenkhim yang mempunyai ikatan yang renggang antar sel satu dg sel lain

(34)

BAB 7

2. KULTUR KALUS

Aplikasi kultur kalus :

• Dalam beberapa hal, perlu fase

pertumbuhan kalus sebelum regenerasi via somatik embryogenesis atau organogenesis • Untuk menghasilkan varian somaklonal

(genetik atau epigenetik)

• Sebagai bahan awal kultur protoplast dan kultur suspensi

• Untuk produksi metabolit sekunder • Digunakan untuk seleksi in vitro

Pengertian kultur kalus :

• Kultur kalus bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan

ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali • Kalus diharapkan memperbanyak diri (massa

selnya) secara terus menerus.

• Kalus dihasilkan dari kultur organ, dengan media diberi auksin atau sitokinin, kecuali untuk eksplan yang mengandung kambium dapat membentuk kalus tanpa diberi ZPT

(35)

(36)

(37)

BAB 7

2. KULTUR KALUS

Perbedaan kebutuhan ZPT untuk pembentukan kalus :

• Jaringan yang membutuhkan auksin, gula, dan garam mineral. Misal umbi artichoke • Jaringan yang membutuhkan auksin,

sitokinin, gula dan garam mineral. Misal empulur tembakau

• Jaringan yang hanya membutuhkan gula dan garam mineral, tanpaZPT. Misal jaringan

kambium

• Jaringan yang membutuhkan sitokinin, gula dan garam mineral. Misal parenkhim xylem akar Turnip

Kemampuan pembentukan kalus dari jaringan dipengaruhi :

• Umur fisiologis jaringan

• Musim saat bahan tanaman diisolasi

• Bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan

• Jenis tanaman

Jenis tanaman yangmenghasilkan kalsu : • Dikotil berdaun lebar, monokotil,

(38)

BAB 7

2. KULTUR KALUS

Induksi kalus :

• Kalus dapat diinduksi dengan pemberian ZPT auksin dan sitokinin, namun kebutuhannya berbeda-beda tgt macam jaringan tanaman • Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua

bagian tanaman, tetapi dari organ yang berbeda kecepatan pembelahan selnya berbeda pula

• Bagian tanaman yang mudah dediferensiasi dan menghasilkan kalus: embrio muda,

hipokotil, kotiledon, dan batang muda

Optimasi pertumbuhan kalus :

• Media yang digunakan dapat menggunakan media padat maupun cair

• Pada media cair, keuntungannya dapat digunakan untuk produksi massal, dan terbentuk embrio somatik yang terpisah

sehingga lebih mudah di subkulturkan untuk inisiasi pertumbuhan plantlet

• Lingkungan diatur dengan ketersediaan

oksigen tinggi, ketersediaan hara dan cahaya yang cukup

(39)

BAB 7

2. KULTUR KALUS

Aspek anatomis kalus :

Pada jaringan yang membentuk kalus,

pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel eksplan, hanya di lapisan periphery yang membelah terus menerus, shg terbentuk lapisan:

• Lapisan luar dengan sel – sel yang pecah • Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel

dorman

• Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1 - 6 lapis sel

• Lapisan tengah (core) yang selnya tidak membelah

Sel –sel heterogen pada kalus :

• Eksplan batang, akar, daun menghasilkan kalus dg sel yang heterogen

• Setelah disubkultur berkali-kali dapat mengakibatkan :

- Aberasi kromosom - Mutasi gen

- Endoreduplikasi yg menghasilkan poliploidi

- Transposisi urutan DNA

- Amplifikasi gen: jmlh gen utk suatu sifat tertentu per genom haploid bertambah - Hilangnya suatu gen (deletion)

(40)

BAB 7

3. KULTUR PROTOPLASMA

Apa itu protoplasma :

• Sel tanpa dinding sel

• Dapat digunakan sebagai eksplan • Digunakan untuk membuat hibrid

interspesifik

• Fusi sel untuk menghasilkan hibrida somatik • Mendapatkan sifat tanaman lebih baik

melalui variasi somaklonal

• Digunakan untuk rekayasa genetika

Produksi hibrid melalui protoplas :

Empat tahap untuk produksi hibrid : • Isolasi Protoplas

• FusiProtoplas • Seleksi Hibrid

(41)

BAB 7

3. KULTUR PROTOPLASMA

Sumber protoplasma :

• Dari organ tanaman spt daun, apex pucuk, buah, akar, bintil akar legum, koleoptil, lapisan aleuron pada serealia, atau dari kultur suspensi sel

• Daun yang paling mudah dari jaringan mesofil, biasanya menggunakan pucuk plantlet yang muda dan steril.

(42)

BAB 7

3. KULTUR PROTOPLASMA

Asolasi protoplas secara enzimatik :

• Daun: lapisan epidermis dibuang • Letakkan daun dalam larutan (diberi

osmotikum)

- sotonik sampai larutan yang hipertonik ringan

- Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol 500600 mM/L

• Tambahkan enzim

- Selulase, hemiselulase, pektinase - Terjadi degradasi dinding sel

• Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi • Inkubasi untuk memisahkan protoplasma

(43)

BAB 7

3. KULTUR PROTOPLASMA

Media kultur protoplas :

• Umumnya menggunakan media MS atau B5 dan modifikasinya

• Diberi larutan osmotikum: manitol atau sorbitol 500-600 mM/L

• Penambahan 1 mM/L CaCl2meningkatkan pembelahan sel

• ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi • Auksin yg digunakan: 2,4 D atau NAA • Sitokinin yg digunakan: BAP, Kinetin, 2i-P

Mengapa menggunakan fusi protoplas :

• Karena dapat dilakukan

• Dimungkinkan untuk persilangan secara luas • Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit

dan kualitas

• Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini

• Protoplasma digunakan untuk rekayasa genetika tanaman

(44)

(45)

BAB 7

3. KULTUR PROTOPLASMA

Fusi protoplas :

• Tidak terjadi secara spontan

• Tambah promotor fusi (PEG / Elektrik / Virus)

• Kemudian diinkubasi

• Tiga kemungkinan produk hasil fusi : - SelA = SelA

- SelB = SelB - SelA = SelB

(46)

(47)

BAB 7

3. KULTUR PROTOPLASMA

Regenerasi protoplas menjadi planlet :

• Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media kultur

• Dalam seminggu-10 hari, protoplasma viable telah meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri

• Tekanan osmose media perlahan-lahan diubah dg cara meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol

• Tekanan osmose media apbl tdk diubah, maka tekanan osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel

(48)

(49)

BAB 7

4. KULTUR HAPLOID

Pembentukan tanaman haploid :

• Kultur Anther (androgenesis)

- produksi tanaman haploid dengan eksplan anther

- Kurang lebih 250 spesies berhasil dikulturkan

- Jenis tanaman Solanaceae, Cruciferae, Gramineae, Ranunculaceae

• Kultur Ovule (gynogenesis)

- produksi tanaman haploid dengan eksplan sel telur yang belum dibuahi

Kultur Haploid :

• Tan haploid sangat penting bagi pemulia tanaman, yaitu untuk memperpendek masa pemuliaan tanaman

• Karena hanya ada 1 set kromosom, maka mudah digunakan untuk mengidentifikasi mutasi resesif

• Dapat menghasilkan homozygote double

haploid (diploid) atau poliploid dengan diberi colchicin – untuk inbreeding dengan hasil hibrida unggul (super)

• Anther untuk eksplan kultur disebut kultur anther

(50)

BAB 7

4. KULTUR HAPLOID

Kultur anther /Pollen :

• Metode untuk memproduksi tanaman haploid

• Sering terjadi secara spontan

• Dapat diinduksi dengan perlakuan fisik atau kimia

• Utk eliminasi kromosom yang digunakan untuk hibridisasi interspesifik

(51)

BAB 7

4. KULTUR HAPLOID

Faktor yang mempengaruhi kultur anther :

1. Genotip

2. Kondisi tanaman donor

a) Umur, kondisi fisiologis : pilih yang sehat dan kuat

b) Gunakan “bud” yang baru muncul 3. Tahapan perkembangnan mikrospora

a) Anther umumnya responsif pd tahap uninucleate

b) Saat menyiapkan protokol/prosedur, catat ukuran, warna, bentuk bunga, lalu disesuaikan dg tahap mikrospora yg tepat. Sehingga dikemudian hari,

memudahkan pengambilan eksplan yg tepat

(52)

BAB 7

4. KULTUR HAPLOID

Faktor yang mempengaruhi kultur anther :

4. Perlakuan awal dan inkubasi awal

a) Pd tembakau, kuncup diinkubasi pd 7-8o_{C selama 12 hr sebelum dikulturkan}

b) Pada B. campestris, 35o_{C selama 1-3 hr}

5. Media

a) Yg umum : media MS (Murashige & Skoog, 1962) dan N6 (Chu, 1978) b) Kadang perlu ekstrak kentang, air

kelapa, casein hydrolisate, sukrosa c) Media padat atau cair

Problem dalam kultur anther :

• Hasil rendah

• Ketidakstabilan genetik

• Pada serealia, tan haploid selalu albino • Perlu memodifikasi media, tahap

perkembangan mikrospora dan faktor lain • Double haploid tidak selalu homosigot

(53)

BAB 7

4. KULTUR HAPLOID

Prosedur umum kultur anther :

• Koleksi kuncup bunga

- Keseluruhan inflorescence atau kuncup bunga dipanen dan dijaga kelembabannya sampai siap dikulturkan

- Jika kuncup perlu pre-treatment, bungkus dg kertas tisu yg sdh diperciki air, lalu

masukkan ke dlm plastik

• Desinfestation, excision & culture

- Sterilisasi umum dg 5% NaOCl, 5-10’ - Anther lalu diambil, hati2 jgn sampai

terluka. Hilangkan filamen

(54)

BAB 7

4. KULTUR HAPLOID

Prosedur umum kultur anther :

• Penentuan tahap mikrospora

- Ditentukan dg cara memencet anter dlm acetocarmine atau propiocarmine dan diamati di bwh mikroskop

(55)

BAB 7

4. KULTUR HAPLOID

Penanganan planlet haploid :

• Plantlet kecil akan muncul 4 – 8 mg setelah dikulturkan

• Pisah2kan dan disubkultur ke media akar • Lalu dipindah ke pot kecil

• Perlakuan colchicine untuk menghasilkan tan ‘double haploid’