PERAN ENZIM LIPASE DAN PENGARUH KO FAKTO

(1)

Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI

170

Peran Apoteker dalam Menjamin Mutu, Efektifitas, Keamanan pada Obat, Makanan dan

Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia

PERAN ENZIM LIPASE DAN PENGARUH KOFAKTOR ION LOGAM TERHADAP PRODUKSI PIGMEN KAROTENOID OLEH Neurospora intermedia N-1

Seno Aulia Ardiansyah1, Marlia Singgih Wibowo2, Sophi Damayanti2

1

Program Studi Farmasi, Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia, Bandung 2

Institut Teknologi Bandung, Jl. Ganesha No. 10 Bandung Corresponding author email: seno.ardiansyah@gmail.com

ABSTRAK

Salah satu sumber penghasil zat pewarna alami (pigmen) karotenoid adalah kapang Neurospora intermedia. Karotenoid yang dihasilkan oleh kapang Neurospora intermedia merupakan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan selama fermentasi. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkaji pengaruh enzim lipase dari Neurospora intermedia N-1 serta mengkaji karotenogenosis dengan penambahan beberapa kofaktor ion logam yaitu Mg2+_{, Fe}2+ _{dan Cu}2+ dengan berbagai konsentrasi terhadap produktivitas pigmen karotenoid dari Neurospora intermedia N-1. Produksi karotenoid pigmen dilakukan dalam fermentasi cair dengan penambahan berbagai konsentrasi ion logam (Mg2+_{, Fe}2+ _{dan Cu}2+_{). Pengujian aktivitas enzim} lipase dilakukan dengan metode volumetri. Tahap akhir dilakukan analisis KCKT PDA untuk identifikasi β-karoten yang dihasilkan. Aktivitas enzim lipase terbesar terjadi pada fermentasi hari ke-5 yaitu sebesar 3,33 µmol/menit. Pada fermentasi hari ke-5 menghasilkan kadar total karotenoid terbesar yaitu 1,403 mg/g spora. Penambahan kofaktor ion logam memberikan pengaruh positif terhadap produktivitas karotenoid dari Neurospora intermedia N-1. Kadar karotenoid pada penambahan kofaktor Cu2+ berupa CuSO4.5H2O pada konsentrasi 12 mM meningkatkan % kadar total karotenoid terbanyak yaitu sebesar 140,68%, sedangkan kadar karotenoid pada penambahan kofaktor Mg2+ _{berupa MgSO}

4.7H2O pada konsentrasi 16 mM meningkatkan % kadar total karotenoid sebesar 138,14%.

Kata kunci: Neurospora intermedia, karotenoid, enzim lipase, kofaktor ion logam,

KCKT PDA

ABSTRACT

One of natural carotenoid dyes (pigments) source is Neurospora intermedia fungus. Carotenoids produced by Neurospora intermedia are secondary metabolites which are produced during the fermentation. The objectives of this study were measuring the lipase activity of Neurospora intermedia N-1 and reviewing carotenogenosis to evaluate the effect of various types of metal ion cofactor such Mg 2+_{, Fe}2 + _{and Cu}2+_{with various concentrations} those are required in the liquid fermentation. The production of pigments carried out in liquid fermentation with the addition of various concentrations of metal ions (Mg2+_{, Fe} 2+_{and Cu}2+_). The activity of lipase enzyme was performed by volumetric method. The last step was analysis using HPLC with PDA detector for the identification of produced β-carotene. The greatest lipase activity occurred on the 5th day of fermentation, 3.33 μmol/minute. The 5th _{day of} fermentation produced the greatest levels of total carotenoids, 1.403 mg /g of spores. The addition of metal ion cofactor had a positive effect on the productivity of carotenoids from Neurospora intermedia N-1. The levels (%) of carotenoids in addition of Cu2+_{cofactor as 12} mM CuSO4.5H2O produced the highest levels of total carotenoids increased up to 140.68%. Whereas levels (%) of carotenoids in the addition of a Mg2+_{cofactor as 16 mM MgSO4.7H2O} generated total carotenoid increased up to 138.14%.

(2)

171

Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia PENDAHULUAN

Kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi telah mendorong perkembangan industri pangan. Penggunaan berbagai bahan baku dan bahan tambahan pangan menjadi suatu fenomena yang umum dan sering dilakukan. Diantaranya adalah penggunaan zat warna yang dikenal sebagai bahan pewarna makanan dalam bentuk tunggal maupun dalam bentuk campuran.

Penambahan pewarna ke dalam makanan dimaksudkan untuk meningkatkan daya tarik dan penerimaan terhadap rasa dari produk, untuk memperoleh keseragaman warna dari produk yang dihasilkan (Aurand, 1987; Jablonski, 1951).

Salah satu sumber penghasil zat pewarna alami (pigmen) karotenoid adalah kapang. Karotenoid yang dihasilkan kapang merupakan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan selama fermentasi. Salah satu diantara kapang penghasil pigmen adalah kapang oncom merah atau roti merah, yang terdiri dari Neurospora sitophilia dan Neurospora intermedia (Saono, dkk, 1986). Neurospora sitophilia dan Neurospora intermedia merupakan kapang yang mempunyai bagian penting dalam fermentasi oncom (Jay, 2000). Neurospora intermedia termasuk kelas Ascomycetes, kelompok heterothalitic dengan ciri mempunyai 8 askus spora, terlihat konidia dengan bentuk mikro dan makro, miselia dan konidia mempunyai rentang warna kuning sampai orange kemerahan (Perkins et al, 1988).

Pemanfaatan mikroba untuk memperoleh pigmen karotenoid sangat menguntungkan. Hal ini berkaitan dengan produksi yang bisa dikondisikan dan tidak terpengaruh oleh iklim, sehingga waktu produksi bisa cepat. Selain itu, substrat yang digunakan untuk produksi mudah diperoleh.

Prediksi pengaruh adanya efek dari salah satu ion logam adalah stimulasi dari ion Mg2+ _{yang tidak bisa diberikan oleh ion lain} yaitu Mn2+ pada proses pembentukan phytoen. Diprediksi keberadaan Mg2+ dengan konsentrasi diatas 10 mM dapat meningkatkan produksi phytoen (Mitzka, Schnabel, 1985). Phytoen ini kemudian mengalami desaturasi untuk membentuk likopen; likopen merupakan prekursor karotenoid siklik.

Dengan demikian, jumlah Mg2+ terlarut dalam substrat sangat penting untuk ditambahkan dan diketahui konsentrasinya sehingga produksi karotenoid dapat optimal. Ion logam lain seperti Fe2+ dan Cu2+ pada media pertumbuhan juga telah dilaporkan menunjukan peningkatkan karotenoid pada kapang Blakeslea trispora (Bhosale, 2004). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkaji peran enzim lipase dari Neurospora intermedia N-1 serta mengkaji karotenogenosis dengan penambahan beberapa kofaktor ion logam yaitu Mg2+, Fe2+ dan Cu2+ dengan berbagai konsentrasi terhadap produktivitas pigmen karotenoid dari Neurospora intermedia N-1.

METODOLOGI

Alat

Neraca analitik (Mettler Toledo ME-224088), Sonicator Virsonic Call Disluptor (B. Braun Biothech Instrumen Company), Magnetic Stirrer Rexim RSD-1D (AS-ONE), Vortex Maxi Mix II Type 37600 (Barnstead Thermolyne), toples media, tabung reaksi, gelas piala, corong, labu Erlenmeyer, batang pengaduk, pipet tetes, pipet ukur, autoklaf, inkubator, cawan petri, alat pembakar Bunsen, spatula, jarum ose, penangas air, Micro Pipet 20-200 µL, Mikro pipet 200–1000 µL, Spektrofotometer UV-Vis (Beckman DU6500i), KCKT detektor PDA (Photodiode Array), kolom Nucleosil C-18 3 µm

Bahan

Yeast Extract 0,5% (Conda Pronadisa) , Pepton 0,5% (Difco), Minyak Zaitun 2% (Pietro Coricelli), bufer Na-Fosfat pH 5.5, K2HPO4 0,1%; NaCl 0,05%; MgSO4.7H20 0,05%; FeSO4.7H2O 0,001%; CuSO4.5H2O 0,0001%; ZnSO4.7H2O 0,0001%, MnSO4.H2O 0,0001%, potato dextrose agar (Oxoid), Ko-faktor Mg2+_yang berasal dari MgSO4.7H20 (4, 8, 12, 16, 20 mM), Ko-faktor Fe2+ yang berasal dari FeSO4.7H20 (4, 8, 12, 16, 20 mM), Ko-faktor Cu2+_{yang berasal dari CuSO}

(3)

172

Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia indikator fenolftalein, alumunium foil, pelarut

aseton, pelarut asetonitril: metanol: 2-propanol (85:10:5), larutan standar β-karoten (Sigma)

Mikroorganisme Uji

Kapang Neurospora intermedia N-1 diperoleh dari isolasi oncom Bandung, diperoleh dari bidang Kimia Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Bandung.

Ekstraksi Karotenoid Dari Spora N.

intermedia N-1

Sampel spora N. intermedia N-1 ditimbang + 1,0 gram (duplo) dan dilarutkan dengan 10 mL Aseton, diaduk hingga homogen disonikasi dengan menggunakan sonikator, 2 menit pertama sonikator dinyalakan dan 2 menit kemudian sonikator dimatikan dilakukan sebanyak 5 kali (sampel yang disonikasi harus disimpan pada bongkahan es, karena alat sonikator menghasilkan bunyi ultrasonic yang menimbulkan panas). Sampel dikocok dengan menggunakan magnetic stirrer selama 5 menit, sampel yang telah dikocok lalu disaring dan diambil filtratnya. Analisis total karotenoid dilakukan pada serapan panjang gelombang 450 nm.

Pengujian Aktivitas Enzim Lipase

Hasil ekstraksi dari spora N. intermedia N-1 disentrifuga pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada 4oC dan supernatan digunakan sebagai sumber enzim. Kemudian proses uji aktivitas enzim lipase dilakukan dengan cara : minyak zaitun sebanyak 1,0 mL dimasukkan dalam Erlenmeyer 100 mL, lalu ditambahkan berturut-turut 0,5 mL CaCl2 0,1 M dan 4,5 mL bufer asetat 0,1 M (pH 5,5). Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 40oC selama 10 menit kemudian ditambahkan enzim lipase dari N. intermedia N-1 sebanyak 10% (v/v) dan diinkubasi kembali pada suhu 40oC dengan digoyang pada kecepatan 160 rpm selama 30 menit. Selanjutnya campuran reaksi ditambah 20 mL etanol dan 3 tetes indikator fenolftalein serta dititrasi dengan NaOH 0,05 M sampai terjadi perubahan warna menjadi merah muda. Satu unit aktivitas enzim lipase setara dengan

1 µmol asam lemak bebas yang dihasilkan dari hidrolisis substrat yang dikatalisis oleh enzim lipase selama 30 menit.

Fermentasi dengan penambahan kofaktor Ion Logam (Mg2+, Fe2+, Cu2+)

Percobaan fermentasi dimulai dengan menumbuhkan suspensi 4% pada media dasar. Kemudian pada media tersebut dilakukan penambahan kofaktor ion logam. Konsentrasi yang ditambahkan pada masing-masing media dasar ialah 0, 4, 8, 12, 16 , 20 mM. Analisis total karotenoid yang dilakukan pada serapan panjang gelombang 450 nm.

Analisis dan Identifikasi Pigmen Karotenoid N. intermedia N-1

Identifikasi pigmen karotenoid dilakukan menggunakan metode KCKT PDA (Photodiode Array) berdasarkan Steiger dkk. (1999) dan Sandmann dkk. (2008) yang dimodifikasi. Ekstrak kasar karotenoid dari Neurospora dipisahkan lemaknya melalui ekstraksi 5 g sampel spora dengan 30 ml aseton pa. Suspensi spora selanjutnya disonikasi selama 10 menit dan dikocok selama 10 menit, kemudian didinginkan dalam frezer selama 2-3 jam. Ekstrak disaring menggunakan kertas saring kemudian ekstrak didinginkan dalam frezer selama 2-3 jam. Kandungan lemak yang membeku disaring dalam kondisi dingin menggunakan syringe filter (Nylon, 0,4 µm), kemudian filtrat yang diperoleh diuapkan dengan mengaliri gas nitrogen.

(4)

173

Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi karotenoid dari spora N.

intermedia N-1

Proses ekstraksi dilakukan mengikuti metode prosedur Priatni (2008). Sampel spora Neurospora intermedia N-1 ditimbang + 1,0 gram (duplo) dan dilarutkan dengan 10 mL Aseton, diaduk hingga homogen disonikasi dengan menggunakan sonikator, 2 menit pertama sonikator dinyalakan dan 2 menit kemudian sonikator dimatikan dilakukan sebanyak 5 kali (sampel yang disonikasi harus disimpan pada bongkahan es, karena alat sonikator menghasilkan bunyi ultrasonic yang menimbulkan panas).

Sampel dikocok dengan menggunakan magnetic stirrer selama 5 menit, sampel yang telah dikocok lalu disaring dan diambil filtratnya. Analisis total karotenoid dilakukan pada serapan panjang gelombang 450 nm.

Tabel 1 Hasil analisis total karotenoid selama proses fermentasi

Waktu inkubasi

(Sampel hari ke-)

Kadar rata-rata karotenoid (mg/g spora)

1 Belum terbentuk spora

2 0,585 + 0,007

3 0,804 + 0,033

4 1,081 + 0,017

5 1,403 + 0.011

6 0,865 + 0,013

Hasil Pengujian Aktivitas Enzim Lipase Dari N. intermedia N-1

Pengujian aktivitas enzim lipase dilakukan dengan metode titrasi (Handayani dan Sulistyo, 2005), yaitu minyak zaitun sebanyak 1,0 mL dimasukkan dalam Erlenmeyer 100 mL, lalu ditambahkan berturut-turut 0,5 mL CaCl2 0,1 M dan 4,5 mL bufer asetat 0,1 M (pH 5,5). Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 40oC selama 10 menit kemudian ditambahkan enzim lipase dari N. intermedia

N-1 sebanyak 10% (v/v) dan diinkubasi kembali pada suhu 40oC dengan digoyang pada kecepatan 160 rpm selama 30 menit. Selanjutnya campuran reaksi ditambah 20 mL etanol dan 3 tetes indikator fenolptalin serta dititrasi dengan NaOH 0,05 M sampai terjadi perubahan warna menjadi merah muda. Satu unit aktivitas enzim lipase setara dengan 1 µmol asam lemak bebas yang dihasilkan dari hidrolisis substrat yang dikatalisis oleh enzim lipase selama 30 menit.

Gambar 1 Hubungan waktu fermentasi N. intermedia N-1 terhadap aktivitas enzim lipase yang dihasilkan.

Berdasarkan Gambar 1 terlihat aktivitas enzim lipase terbesar yaitu pada fermentasi hari ke-5 yaitu sebesar 3,33 µmol/menit, dimana peningkatan aktivitas enzim lipase sebanding dengan peningkatan kadar total karotenoid. Penambahan minyak zaitun dimaksudkan untuk menstimulasi enzim lipase.

Kapang Neurospora dapat mengeluarkan enzim lipase dan protease yang aktif selama proses fermentasi dan memegang peranan penting dalam penguraian pati menjadi gula, penguraian bahan-bahan dinding sel kacang, dan penguraian lemak, serta pembentukan sedikit alkohol dan berbagai ester yang berbau sedap dan harum (Tanuwidjaja dan Gunawan, 1978).

Fermentasi Dengan Penambahan Beberapa ko Faktor Ion Logam (Mg2+ , Fe2+ dan Cu2+)

(5)

174

Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia sistem batch dengan tujuan substrat pada

media tercampur secara homogen.

Spora yang dihasilkan diekstraksi dan diukur kandungan karotenoid totalnya secara Spektrofotometri UV-Vis.

Tabel 2 Kadar karotenoid dengan penambahan kofaktor Mg2+ berbagai

konsentrasi

Konsentrasi MgSO4.7H2O

(mM)

Kontrol 0,354 + 0,000

4 0,387 + 0,003

8 0,430 + 0,007

12 0,496 + 0,007

16 0,843 + 0.030

20 0,419 + 0,035

Tabel 3 Kadar karotenoid dengan penambahan kofaktor Fe2+ berbagai

konsentrasi

Konsentrasi FeSO4.7H2O

(mM)

Kontrol 0,354 + 0,000

4 0,261 + 0,030

8 0,318 + 0,007

12 0,334 + 0,002

16 0,230 + 0.002

20 0,206 + 0,007

Tabel 4 Kadar karotenoid dengan penambahan kofaktor Fe2+ berbagai

konsentrasi

Konsentrasi CuSO4.7H2O

(mM)

Kontrol 0,354 + 0,000

4 0,485 + 0,021

8 0,564 + 0,021

12 0,852 + 0,018

16 0,736 + 0.007

20 0,558 + 0,063

Dari data di atas kadar karotenoid total terbesar yaitu dengan penambahan CuSO4.5H2O pada konsentrasi 12 mM menghasilkan total karotenoid sebesar 0,852 + 0,018 mg/g spora atau mengalami peningkatan (%) kadar karotenoid total sebesar 140,68%, sedangkan penambahan MgSO4.7H2O 16 mM menghasilkan total karotenoid sebesar 0,843 + 0,030 mg/g spora atau mengalami peningkatan (%) kadar karotenoid total sebesar 138,14%.

Ion logam merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap mikroba baik merupakan bagian dalam sel ataupun bagian elemen transisi yang berhubungan dengan ligan pembawa. Beberapa studi menunjukan peranan ion logam dalam produksi karotenoid bersifat spesifik terhadap suatu jenis mikroba atau strain tertentu.

Analisis Pigmen Karotenoid dengan Metode KCKT-PDA

(6)

175

Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia Gambar 2 Kromatogram KCKT-PDA ekstrak

karotenoid Neurospora intermedia N-1 (peak 10 = tR 41,49; peak 15 = tR 50,24; peak 18 = tR 57,65; peak 24 = tR 80.50)

Hasil kromatogram KCKT menunjukkan pigmen karotenoid pada Neurospora intermedia N-1 yang telah cukup terpisah dengan resolusi pemisahaan yang cukup baik. Terlihat adanya puncak-puncak yang signifikan pada waktu tambat (tR) : 41,49 ; 50,24 ; 57,65 dan 80,50 menit. Jenis senyawa karotenoid yang muncul selanjutnya diidentifikasi melalui pola spektrum dari puncak-puncak yang muncul dalam kromatogram dan panjang gelombang yang terdeteksi oleh detektor PDA.

SIMPULAN

Penambahan kofaktor ion logam memberikan pengaruh positif terhadap produktivitas karotenoid dari Neurospora intermedia N-1. Kadar karotenoid pada penambahan kofaktor Cu2+ _{berupa CuSO}

4.5H2O pada konsentrasi 12 mM meningkatkan (%) kadar karotenoid total tertinggi yaitu sebesar 140,68%, sedangkan kadar karotenoid pada penambahan kofaktor Mg2+ berupa MgSO4.7H2O pada konsentrasi 16 mM meningkatkan (%) kadar total karotenoid sebesar 138,14%.

DAFTAR PUSTAKA

Amaya, D.B.R. (2001) : A Guide to Carotenoids Analysis in Foods, Departmento de Ciencia de Alimentos Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas , SP., Brazil.

Anna Poedjiadi. (1994) : Dasar-Dasar Biokimia, UI- Press, Jakarta, 143, 145.

Aurand, L.W., A.E. Woods, dan M.R Weells. (1987) : Food Composition and

Analysis, Van Nostrand Reinhold, New York, 453-492.

Bhosale, P. (2004) : Environmental and Cultural Stimulants in The Production of Carotenoids From Microorganisms. Microbiol Biotechnol, 63, 351-361.

Britton (1995) : Structure and Properties of Carotenoids in Relation to Function, The FASEB Journal, 9.

Chen B.H dan Tang Y.C (1998) : Processing and Stability of Carotenoid Powder From Carrot Pulp Waste, Fu Jen University Republic of China.

Cowan, S.T. (1981). Manual for Identification of Medical Bacteria. 6th_{ed. Cambridge:} Cambridge University Press.

Davies, B.H (1985) : Carotene Biosynthesis in the Fungi, Univesity College of Wales, Abersystwyth.

deMan, John M (1999) : Principles of Food Chemistry, Third Edition, Aspen Publisher Inc, Maryland.

Desai, HG dan Modi VV (1977) ; Stimulation of carotenogenosis by Penicilin in Blakeslea trispora, Phytochemistry. 16, 1373-1376.

Dufose, L. (2006) : Microbial Production of Food Grade Pigments, Food Technol Biothechnol, 44, 3, 313-321.

Gregory and Hearst J (1996) ; Genetic and Molecular Biology of Carotenoid Pigment Biosynthesis, FASEB J. 10, 228-237.

(7)

176

Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia Engineering Handbook. Noyes

Publicatin, USA.

Jablonski, C.F., 1951: Coloring Mattersin Food, in The Chemistry and Technology of Food and Food Products, V0l. I, Morris B. Jacobs, Editor , Interscience Publishers, Inc., New York, 349-381.

Jay, (2000) : Modern Food Microbiology, Aspen Publisher Inc, Maryland.

Mitzka, U dan Schanabel, (1985) : Carotenogenic Enzymes from Neurospora, Pure and Appl Chem, 57, 667-669.

Nuraida, L, Sihombing S., Fardiaz S (1996) : Produksi Karotenoid Pada Limbah Cair Tahu, Air Kelapa dan Ongkok oleh Kapang Neurospora Sp., Fateta IPB.

Pelczar, Michael, E.C.S. Chan. (1986) : Elements of Microbiology, 1st Edition, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Jilid I, Ratna Siti Hadioetomo dkk, UI Press, Jakarta, 149-150.

Perkins, D dan Turner B.C (1988) : Neuopora From Natural Population, Experimental mycology, 12, 19-131.

Priatni S., Singgih M., Kardono LBS., Gusdinar T. (2008). Produksi pigmen karotenoid dari kapang oncom merah (Neurospora sp.) melalui pemanfaatan sisa produksi, Prosiding seminar nasional pigmen, Salatiga, 5 September, ISBN 979-1098-16-4.

Rini Handayani, Joko Sulistyo. (2005). Transesterifikasi Ester Asam Lemak Melalui Pemanfaatan Teknologi Lipase. Biodiversitas, 164-167.

Sulistyo, J., Y.S Soeka, dan R. Handayani. (2001). Transesterifikasi enzimatik asam lemak dari substrat minyak sawit dan santan kelapa. Berkala Penelitian Hayati 7 (1): 19-23.