PENENTUAN URUTAN BASA DNA DALAM SEGMEN M

(1)

PENENTUAN URUTAN BASA DNA DALAM SEGMEN MOLEKUL DNA

(DNA SEQUENCING)

(Tugas ini disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah BIOKIM II)

Disusun Oleh : Nindy Fadhilah Rina Febrina

M. Hatta

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH

SUKABUMI PROGRAM STUDI KIMIA

(2)

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah. Puji syukur kita panjatkan kehadirat Allah SWT, karena atas berkat rahmat serta karunia-Nyalah sehingga penyusun dapat menyelesaikan makalah yang berjudul PENENTUAN URUTAN BASA DNA DALAM SEGMEN MOLEKUL DNA (DNA SEQUENCING). Dalam penulisan ilmiah ini penulis sangat menyadari bahwa terwujudnya penulisan ini berkat dukungan dan motivasi dari berbagai pihak baik yang bersifat moril maupun material, maka sudah sepantasnya penulis mengucapkan ucapan terima kasih sebesar-besarnya kepada pihak-pihak yang telah turut membantu dalam penulisan ilmiah ini.

(3)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pada mulanya, sekuensing DNA dilakukan dengan mentranskripsikannya ke dalam bentuk RNA terlebih dahulu karena metode sekuensing RNA telah ditemukan sebelumnya. Kemajuan teknik biologi molekular dalam mengungkap sekuens biologis dari protein (sejak awal 1950-an) dan asam nukleat (sejak 1960-an) mengawali perkembangan basis data dan teknik analisis sekuens biologis. Basis data sekuens protein mulai dikembangkan pada tahun 1960-an di Amerika Serikat, Pada tahun 1965, Robert Holley dan timnya dari Cornell University di New York, Amerika Serikat, mempublikasikan sekuens tRNA alanin dari khamir yang terdiri atas 77 nukleotida. Sekuensing tRNA tersebut membutuhkan waktu 7 tahun dan hasilnya merupakan sekuens molekul asam nukleat yang pertama kali dipublikasikan Sekuens DNA yang pertama kali dipublikasikan adalah DNA sepanjang 12 nukleotida dari suatu virus, yaitu bakteriofag lambda, pada tahun 1971, yang ditentukan dengan cara serupa oleh Ray Wu dan Ellen Taylor, keduanya juga dari Cornell University.

Basis data sekuens DNA dikembangkan pada akhir 1970-an di Amerika Serikat dan Jerman (pada European Molecular Biology Laboratory, Laboratorium Biologi Molekular Eropa). Penemuan teknik sekuensing DNA yang lebih cepat pada pertengahan 1970-an menjadi landasan terjadinya ledakan jumlah sekuens DNA yang berhasil diungkapkan pada 1980-an dan 1990-an, menjadi salah satu pembuka jalan bagi proyek-proyek pengungkapan genom, meningkatkan kebutuhan akan pengelolaan dan analisis sekuens, dan pada akhirnya menyebabkan lahirnya bioinformatika. Pada tahun 1975, Frederick Sanger dan Alan Coulson dari laboratorium biologi molekular Medical Research.

Council Inggris di Cambridge mempublikasikan metode sekuensing DNA secara langsung yang disebut teknik plus–minus. Dengan teknik tersebut, tim mereka berhasil melakukan sekuensing DNA sebagian besar genom bakteriofag ΦX174 sepanjang 5.375 nukleotida yang dipublikasikan pada Februari 1977. Pada bulan yang sama, metode sekuensing DNA yang dicetuskan Allan Maxam dan Walter Gilbert dari Harvard University di Cambridge, Massachusetts, Amerika Serikat, dipublikasikan.

(4)

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Sequencing

Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek . Pengurutan ( sequencing ) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetic dari molekul DNA.

2.2 Prinsip Dasar DNA Sequencing

DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi (perbanyakan) menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Gambar.1. Proses Cycle Sequencing Yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

1. Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti PCR

2. ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.

(5)

Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5′-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester.

Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa.

2.3 Metode Sekuensing

Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA. Metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger. Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul DNA yang diperiksa. Tekhnik yang digunakan adalah gel-gel poliakrilamid pendenaturasi (denaturing polyacrylamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang satu basa. Gel-gel pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi beruntai tunggal dan tetap dalam keadaan seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel pendenaturasi mengandung urea dan dijalankan dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal tersebut mendorong terjadinya pemisahan kedua untai molekul DNA.

1. Metode Maxam-Gilbert

Metode Maxam-Gilbert merupakan metode yang didasarkan atas pemotongan DNA didaerah spesifik oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini sekarang jarang digunakan .

2. Metode Sanger.

(6)

dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP. Jenis Pelabelan Metode Sanger :

a. Dye Primers dengan Label Berbeda

Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur saja, digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle sequencing. Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda.

b. Dye-Terminators Sequencing

Para ilmuwan menemukan cara yang lebih simple untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan diputar pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.

Dalam metode Sanger, sintesis DNA secara enzimatik terjadi melalui pembentukan secara berurut ikatan fosfodiester antara gugus fosfat ujung 5’ bebas dari nukleotida baru dengan gugus OH dari ujung 3’ rantai yang sedang memanjang . proses ini berlangsung sepanjang molekul DNA. Dideoksinukleotida tidak mempunyai gugus OH pada ujung 3’nya, melainkan gugus H. adanya dideoksinukleotida menyebabkan sintesis DNA terhenti, karena ikatan difosfat tidak terbentuk. Pemanjangan rantai kan terhenti pada titik ini dan basa terakhir diujung 3’ rantainya dalah sebuah terminator dideoksi. Modifikasi dari metode sanger ini disebut dideoxy termination sequencing Dalam metode pengurutan Sanger, digunakan empat campuran reaksi dalam pengurutan fragmen DNA. Tiap campuran reaksi mengandung molekul DNA cetakan yang akan diurutkan, primer yang telah diberi label dengan radioaktif, keempat macam deoksinukleotida. DNA polymerase dan empat terminator dideoksi (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP). Jika salah satu dari terminator ini digunakan pada untai DNA yang baru terbentuk, maka sintesis untai baru ini akan terhenti; hasilnya adalah semua untai dengan panjang yang bervariasi pada campuran reaksi akan berakhir dengan basa yang sama. Produk-produk radioaktif tersebut akan dipisahkan dengan elektroforesis dan divisualisasikan melalui autoradiografi. Hasil autoradiografi dibaca dari bawah gel (fragmen terpendek yang berhenti paling dekat dengan ujung 5’) kearah atas untuk mengetahui sekuens basa komplementer dari untai cetakan.

Primer bersama-sama dengan DNA polimerase dan nukleotida ditambahkan ke sampel. Melanjutkan langkah-langkah yang sama ke Proses PCR ke fase ekstensi

Sampel dibagi menjadi empat kelompok.

The novalty dari metode ini melibatkan molekul yang disebut

(7)

dan masing-masing sesuai ddGTP ke T, A, C, dan G. Tidak adanya atom oksigen berakhir ekstensi primer reaksi ketika nukleotida normal digantikan oleh ddNTP. Selain itu, masing-masing ddNTP neon memancarkan sinyal yang berbeda untuk mengidentifikasi T, A, C, G basa.

2.4 Proses DNA Sequencing

1. Penyiapan Yaitu penyiapan salah satu untai fragmen DNA yang dibagi dalam 4 bagian, kemudian setiap bagian diinkubasi dengan semua bahan yang diperlukan untuk sintesis untas komplementer (primer, DNA polimerase, dan keempat deoksiribonukleotida triphospat)

2. Sintesis untai DNA baru

Dimulai pada primer dan berlanjut hingga dideoksiribonukleotida dimasukkan yang mencegah sintesis lebih lanjut. Dideoksiribonukleotida diselipkan begitu sering secara random sebagai ganti ekuivalensi normalnya. Pada akhirnya dihasilkan serangkaian untai radioaktif yang mempunyai panjang yang berbeda-beda

3. Elektroforesis Gel

(8)

BAB III

PENUTUP

3.1Kesimpulan

(9)

PENENTUAN URUTAN BASA DNA DALAM SEGMEN M