LAPORAN HASIL MINI RISET ENZIMOLOGI
ISOLASI DAN AKTIVITAS ENZIM LIPASE HASIL ISOLASI DARI DEDAK PADI
Diusulkan oleh:
FATCHUN NA’IM (4411412051/2012)
IKA RESTU A. (4411412044/2012)
LITAYANI DAFROSA (4411412016/2012)
ASNI PURAEDAH (4411413001/2013)
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Indonesia merupakan penghasil padi terbesar ketiga di dunia setelah Cina dan India. Pada tahun 2011, produksi padi Indonesia mencapai 67,3 juta ton (BPS 2011). Bila dedak padi yang dihasilkan sebagai hasil samping penggilingan padi dapat mencapai 8-10%, maka dedak yang dihasilkan mencapai 6,73 juta ton. Dedak padi mengandung 17-23% minyak yang dapat diubah menjadi asam lemak. Proses hidrolisis minyak menjadi asam lemak dan gliserol yang telah dilakukan adalah melalui proses Colgate-Emery. Proses tersebut dilakukan pada tekanan 0-60 bar dan suhu 240-260°C. Metode ini dinilai konvensional dari segi teknologi, karena memiliki beberapa kelemahan proses antara lain: konsumsi energi tinggi, material peralatan proses spesifik, sistem pengendalian proses dan keselamatan kerja sangat kompleks, serta dapat terjadi polimerisasi asam lemak tak jenuh.
Metode lain yang digunakan adalah dengan menghidrolisis minyak nabati secara enzimatik dengan enzim lipase. Akan tetapi, proses enzimatis memiliki kelemahan, yakni tingginya harga enzim komersial dan enzim tidak dapat digunakan berulang. Malekian dkk (2000) menyatakan bahwa dedak padi mengandung beberapa tipe lipase, seperti phospolipase, glikolipase dan esterase. Malekian dkk (2000) juga menyebutkan bahwa lipase dedak padi bekerja optimal pada pH 7,5-8 dan suhu 37°C. Phospholipase termasuk phospholipase A1, A2 dan B, yang masing masing bereaksi pada bagian ester asam lemak, serta phospholipase C dan D yang bereaksi pada bagian phosphate.
membutuhkan energi tinggi, bersifat spesifik, dan tidak beracun (Aunstrup, 1979).
Produksi enzim untuk jumlah besar dan mempunyai aktivitas yang tinggi perlu diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi pertumbuhan, cara isolasi, serta jenis substrat yang digunakan. Kondisi pertumbuhan yang menunjang produksi enzim secara maksimal adalah pH, suhu inkubasi, waktu inkubasi, dan komposisi media pertumbuhan harus mengandung sumber energi, sumber karbon, sumber nitrogen dan mineral (Wang, 1979).
Penggunaan enzim dalam bioteknologi modern semakin berkembang secara cepat. Banyak industriindustri yang telah memanfaatkan kerja enzim, meliputi industri pangan dan non pangan. Salah Satu jenis enzim yang mempunyai peran penting dan tidak ada bandingan dalam pertumbuhan bioteknologi adalah enzim lipase (Sumarsih, 2004). Enzim lipase sangat berperan dalam pemisahan asam lemak dan pelarutan noda minyak pada alat industri agar minyak dapat dilarutkan dalam air (Dosanjh, 2002).
Indonesia berpotensi sebagai penghasil asam lemak dari dedak padi yang jumlahnya melimpah. Dedak padi mengandung enzim lipase yang dapat mengkatalisis proses hidrolisis trigliserida pada dedak padi menjadi asam lemak. Penelitian ini bertujuan mengisolasi enzim lipase serta menentukan aktivitas lipase pada dedak padi.
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah disampaikan, permasalahan yang dapat diajukan yaitu:
1. Bagaimana cara isolasi enzim lipase dari dedak padi? 2. Bagaiman Aktivitas enzim lipase dari dedak padi? C. Tujuan
Tujuan penelitian ini adalah :
D. Manfaat
Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini adalah :
1. Memberikan informasi ilmiah kepada mahasiswa cara isolasi enzim lipase dari dedak padi.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Bekatul
Bekatul adalah bagian terluar dari bagian bulir yang terbungkus oleh sekam. Bulir adalah buah sekaligus biji berbagai tumbuhan serealia sejati, seperti padi, gandum dan jelai. Istilah bekatul terutama digunakan pada padi.
Asal-usul bekatul secara anatomi adalah lapisan aleuron dan sebagian perikarp yang terikut. Aleuron adalah lapisan sel terluar yang kaya gizi dari endospermium, sementara perikarp adalah bagian terdalam dari sekam. Bekatul padi dapat dilihat pada beras yang diperoleh dari penumbukan. Proses pemisahan bekatul dari bagian beras lainnya dikenal sebagai penyosohan (polishing) untuk memperpanjang masa penyimpanan beras, sekaligus memutihkannya.
Kandungan gizi bekatul dikenal luas sejak ditemukannya vitamin B1 (tiamin) dari beras yang belum disosoh, yang bila dikonsumsi terbukti menekan frekuensi penyakit beri-beri oleh Dr. Eijkman. Kandungan gizi lainnya adalah serat pangan, pati, protein, lemak/minyak serta mineral.
Gambar 1. Skema morfologi gabah kering (Champagne, 1994 dalam Swastika, 2009)
Minyak Bekatul
Walaupun bekatul tersedia melimpah di Indonesia - data BPS (2010) menyebutkan sebanyak 6,59 ton bekatul- namun pemanfaatannya untuk konsumsi manusia sebagai sumber pangan dan gizi masih terbatas. Sampai saat ini pemanfaatannya terbatas pada pakan ternak. Salah satu bentuk produk bekatul yang populer saat ini terutama di luar negeri adalah rice bran oil (RBO).
RBO dapat diperoleh dari bekatul awet sebanyak 15 - 25 persen- jika dikalkulasikan daari angka 6,59 juta ton dapat dihasilkan 0,98-1,65 juta ton RBO. Jumlah bahan baku yang sangat besar jumlahnya, sehingga RBO sangat potensial dikembangkan di Indonesia sebagai bahan baku ingredien pangan atau non pangan. Beberapa laporan penelitian menyebutkan bahwa RBO mengandung komponen bioaktif pangan yang bermanfaat bagi kesehatan baik uji pada hewan ataupun manusia.
Permasalahan utama pengolahan bekatul menjadi RBO karena timbulnya aroma tengik dan rasa yang pahit setelah dilakukan penyimpanan. Kedua faktor tersebut sangat mempengaruhi kualitas RBO yang dihasilkan. Aroma tengik bekatul ditimbulkan oleh senyawa degradasi lipida seperti aldehida dan keton. Sedangkan rasa pahit ditimbulkan oleh senyawa peptida hidrofobik dangan berat molekul rendah hasil hidrolisis protein oleh enzim protease.
Hampir 74,3 % kandungan asam lemak tidak jenuh minyak RBO terdiri dari mono dan poly (MUFA dan PUFA). Sementara itu sisanya terdiri dari asam lemak jenuh atau saturated fatty acid (SFA). Tingginya kandungan asam lemak tidak jenuh pada RBO akan memberikan efek positif bila kita mengkonsumsinya.
Salah satu hasil pemanfaatan bekatul adalah minyak bekatul. Produksi bekatul di dunia mencapai 535 juta ton dan minyak bekatulnya 4 juta ton. Indonesia termasuk negara urutan ketiga penghasil bekatul dan minyak bekatul setelah China dan India. Amerika Serikat menggunakan minyak bekatul dalam produksi makanan, sedangkan Jepang menggunakan minyak bekatul sebagai minyak goreng (Oilseeds International, Ltd. 2002). Lain halnya dengan Indonesia yang masih kurang baik dalam memanfaatkan minyak bekatul.
Di dalam minyak bekatul terkandung komponen-komponen yang bermanfaat bagi kesehatan seperti tokoferol, oryzanol dan tokotnenol. Oryzanol yang terkandung dalam minyak bekatul dapat menurunkan kolesterol jahat (LDL) tanpa mengurangi kolesterol baik (HDL). Tokotrienol dan tokoferol adalah sumber vitamin E yang sangat baik dan memberikan efek anti kanker. Dibandingkan dengan jenis minyak lain, kandungan tokoferol dalam minyak bekatul cukup tinggi.
Stabilisasi Bekatul
Menurut Ketaren (1986) ketengikan adalah kerusakan atau perubahan bau atau cita rasa dalam minyak atau bahan pangan berlemak tinggi ataupun rendah. Reaksi ketengikan diakibatkan oleh hidrolisis enzimatik lipase dan ketengikan oksidatif. Pada bekatul, ketengikan terjadi akibat lipase yang menghidrolisis lemak menjadi asam lemak dan gliserol. Asam lemak bebas dioksidasi oleh enzim lipoksigenase menjadi bentuk peroksida, keton dan aldehid, sehingga bekatul menjadi tengik. Menurut Champagne (1994) dalam Swastika, 2009), kandungan lemak bekatul yang tinggi (15-19,7%) menjadi subyek kerusakan hidrolitik dan oksidatif. Kerusakan hidrolitik terjadi karena adanya air dalam bahan yang bereaksi dengan lemak bekatul.
bebas. Lipase berada dalam testa-cross layer biji padi sementara minyak dalam lapisan aleuron dan subaleuron dalam lembaga. Lipase mempunyai berat molekul 40.000 Da dan titik isoelektrik (pI) 8,56. pH optimum adalah 7.5-8.0, dan suhu optimum 37o C. Lipase pada bekatul menghidrolisis asam lemak pada posisi 1 dan 3 pada molekul trigliserida. Lipoksigenase dihubungkan dengan oksidasi polyunsaturated fatty acids (PUFA) yang mempunyai struktur cis-pentadiene. Produk karbonil dari degradasi khususnya heksanal menunjukkan flavor rusak (Orthoefer, 2005).
B. Enzim Lipase
Lipase yang berasal dari bakteri pada umumnya adalah protein yang memiliki sifat asam. Dan mempunyai berat molekul dari 20.000 sampai 60.000. Memiliki aktivitasspesifik protein murni yang berubah-ubah dari 500 sampai 10.000 unit lipase per mg protein.
Gambar 2. Lipid (Triasilgliserol)
Enzim lipase atau lengkapnya triasilgliserol lipase adalah enzim yang menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai substrat alami berupa trigliserida dari asam lemak yang mana reaksinya memerlukan air, dan lipase ekstraseluler berhasil diisolasi dari Pseudomonas aeruginosa pada tahun 1986. Enzim lipase memiliki sub unit berupa glikoprotein dan lipoprotein. Sub unit tersebut dapat sebagai monomer, dimer, oligomer atau polimer. Enzim lipase stabil pada suhu optimumnya yaitu 30o C, walaupun masih aktif pada 51o C. Dan menurut penelitian Abigor dkk (2002) wijen digunakan sebagai katalis enzim lipase dan dapat bekerja dengan baik dan bertahan hidup pada pH 7-7,5.
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Lokasi dan Waktu Penelitian
Lokasi penelitian di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Biologi Molekuler Jurusan Biologi Unnes. Penelitian dilaksanakan Hari Sabtu 15 November 2014.
B. Populasi dan Sampel
Populasi dalam penelitian ini adalahDedak Padi.Sampel yang digunakan adalah 60 gram Dedak Padi yang didapatkan dari pasar Ungaran semarang. C. Alat dan Bahan Penelitian
D. Prosedur Penelitian
Ekstraksi dan Uji Aktivitas Lipase dari Dedak Padi
Dedak padi sebanyak 10 gram ditambah kedalam 50 ml dietileter, aduk-aduk dan gojog untuk melarutkan lemak, kemudian Saring dengan kertas saring, filtratnya berisi lemak dan turunannya yang larut dalam dietil eter. Ampas yang diperoleh ditambah dengan 40 ml 50 mM bufer phosphat pH 7 atau 40 ml 10 mM Tris HCL Bufer pH 7,5, Campuran tersebut dimagnetik stirer selama 30 menit. Selanjutnya saring dengan kain saring dua lapis. Filtratnya disentrifugasi, supernatan merupakan ekstrak enzim kasar yang terlarut dalam buffer.
Substrat (susu sapi segar) dipanaskan suhu 80oC selama 10 menit. Sebanyak 8 ml substrat (susu sapi pasteurisasi) dimasukkan dalam labu Erlenmeyer 100 ml dan seimbangkan suhunya dalam penangas air 370C. Tambahkan 2 ml ekstrak enzim lipase kasar. Inkubasikan selama 10 menit, 370C. Setelah inkubasi tambahkan 40 ml alkohol. Sebagai blanko adalah susu sebanyak 8 ml ditambah 2 ml larutan pengekstrak enzim (Larutan NaCl atau Buffer phosphat) dan 40 ml alkohol tanpa dilakukan inkubasi.
Aktivitas Lipase dari Dedak Padi diukur dengan menggunakan metode titrasi dengan NaOH 0,1 M yang kemudian dihitung dengan menggunakan
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Malekian dkk (2000) menyatakan bahwa dedak padi mengandung beberapa tipe lipase, seperti phospolipase, glikolipase dan esterase. Malekian dkk (2000) juga menyebutkan bahwa lipase dedak padi bekerja optimal pada pH 7,5-8 dan suhu 37°C. Phospholipase termasuk phospholipase A1, A2 dan B, yang masing masing bereaksi pada bagian ester asam lemak, serta phospholipase C dan D yang bereaksi pada bagian phosphate. Tahapan proses dekomposisi lemak dedak padi oleh enzim lipase mengikuti mekanisme berikut: phosphotidylcholine, yang merupakan komponen utama dari membran spherosome terdekomposisi menjadi asam phosphatidic oleh phospholipase. Hal tersebutn akan mengakibatkan spherosome terdisintegrasi. Setelah membran spherosome terpecah, trigliserid yang ada di dalamnya akan berkontak dengan enzim lipase dan proses dekomposisi akan menghasilkan asam lemak bebas. Lipase memecah ikatan ester asam lemak pada posisi 1 dan 3 dari molekul trigliserid. Enzim lipase mengkatalisis reaksi hidrolisis di interface antara fasa substrat dan fasa aqueous, seperti dilukiskan pada Gambar 1 (Sharma dkk, 2009).
semakin turunnya pH reaksi selama proses hidrolisis, aktivitas enzim lipase akan menurun. Guna menghindari hal tersebut, salah satu usaha yang dilakukan adalah dengan menambahkan buffer ke dalam sistem reaksi sehingga pH sistem tetap. Mengingat dedak padi mengandung lipase yang dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis minyak dedak menjadi asam lemak, maka penelitian ini dilakukan untuk mengkaji proses hidrolisis minyak dedak menjadi asam lemak dengan memanfaatkan lipase yang terdapat dalam dedak padi kemudian mengukur aktivitas enzim lipase nya.
Penelitian ini menguji aktivitas enzim lipase dari dedak padi dengan titrasi fenol berdasarkan perubahan warna pink yang menunjukkan penambahan NaOH menetralkan sifat asam yang dibentuk asam lemak dalam sampel. Pengukuran aktifitasnya didasarkan kepada jumlah asam lemak yang dibebaskan lalu dititrasi oleh NaOH 0.1 M secera titrimetri. Pada metoda titrimetri, banyaknya asam lemak yang dilepaskan akan dititrasi oleh NaOH sehingga volume NaOH sama dengan volume asam lemak yang dihasilkan oleh aktivitas enzim lipase. Untuk mengetahui aktivitas lipase dari dedak padi menggunakan rumus uji aktivitas enzim adalah sebagai berikut:
Aktivitas enzim dinyatakan dalam mol / menit ml enzim atau Unit/ml
Satuan aktivitas lipase = μmol/ ml enzim menit Dengan :
ts = titrasi sample tb = titrasi blanko
waktu inkubasi = 10 menit M NaOH = Molaritas NaOH
1000 berasal dari konversi mmol = 1000 μmol
masing sampel dan blanko ditambahkan 40 ml alkohol untuk menginaktivasi kerja enzim. Dalam penelitian ini digunakan juga beberapa reasgen yang memiliki fungsi antara lain:
Fungsi Reagen:
1. Dietil eter untuk melarutkan lemak yang terkandung dalam dedak padi agar enzim lipase yang dibentuk tidak mengandung lemak.
2. Buffer fosfat untuk melarutkan enzim yang bersifat polar sehingga terpisah dengan komponen lain yang nonpolar serta untuk menjaga kestabilan pH enzim lipase.
3. Alcohol untuk menginaktivasi enzim lipase sebelum dititrasi. 4. PP indicator perubahan warna.
5. NaOH sebagai pentitrasi pada uji enzim lipase karena dapat menetralkan suasana asam pada sampel akibat terbentuknya asam lemak.
Dari hasil penelitian kami didapatkan bahwa:
NO Sampel Volume NaOH yang volume NaOH sebesar 5,5 ml sama dengan volume asam lemak yang dihasilkan oleh aktivitas enzim lipase yaitu 5,5 ml juga.Untuk aktivitas lipase nya dihasilkan 12,5 unit/ ml enzim yang menunjukan bahwa Satu unit didefinisikan sebagai banyaknya mL enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1 µmol asam lemak tiap menit dengan susu sapi segar sebagai substrat.sehingga dari pernyataan tersebut dapat disimpulkan bahwa dibutuhkan 2 ml enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 12,5 µmol asam lemak tiap menit dengan susu sapi segar sebagai substratnya. Sedangkan untuk sampel 2 dibutuhkan 2 ml enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 7,5 µmol asam lemak tiap menit dengan susu sapi segar sebagai substratnya.
BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
1. Enzim lipase bekerja optimum pada suhu 37 o C dan pH berkisar 7-8 2. Aktivitas lipase dapat dihitung dengan metode titrasi
3. Aktivitas lipase pada suhu 37 o C pada sampel 1 adalah 12,5 unit/ ml enzim sedangkan sampel 2 adalah 7,5 unit/ ml enzim
B. Saran
DAFTAR PUSTAKA
Ardiansyah, Y.T., 2009, Isolasi dan Karakterisasi Enzim Xilanase dari Bacillus subtilis pada Media Nutrien Broth dengan Penambahan Xilan Hasil Isolasi Jerami Padi, Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Diponegoro Semarang
Dali, S. & Pirman. 2005. Eksplorasi dan Isolasi Enzim Lipase dari Fungi Inperfekti (genus Aspergillus dan Penicillium) Indigenus. Lembaga Penelitian UNHAS. Grist. DH. 1965. Rice. 4-th Edition. Lowe and Brydine. Ltd. London.
Ketaren. 1986.Pengantar Teknologi Minyak Dan Lemak pangan.Jakarta:UI Press. Nurhasanah, (2008), Pemurnian Enzim Lipase dari Bakteri Lokal dan Aplikasinya
dalam Reaksi Esterifikasi, Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknologi-II, Universitas Lampung
Orthoefer F T. 2005. Rice Bran Oil. Di dalam : Shahidi, F, editor. Bailey’s Industrial Oil and Fat Products, Edible oil and Fat Products: Edible oils. Ed ke-6. Canada : A John Wiley & Sons, Inc. Vol 2. hlm 465-487.
Putranto, A.R., Santoso, D., Tri-Panji, Suharyanto & Budiani, A. 2006. Karakterisasi Gen Penyandi Lipase dari Kapang Rhizopus oryzae dan Absidia corymbifera. Menara Perkebunan 74(1): 23-32.
Soemardi. 1975. Pendayagunaan Dedak. Seminar Teknologi Pangan II BPK, Bogor. Swastika, N. D.2009. Stabilisasi Tepung Bekatul melalui Metode Pengukusan dan
LAMPIRAN
Menimbang dedak padi
Menambah dietil eter Mencampur Dedak padi dan dietil eter
Menyaring larutan
Menambah bufer phospat
Menyaring larutan Memagnetik stirer Menyaring larutan
Memiondah larutan pada tube
Menyentrifuge Supernatant dan pellet hasil sentrifuge
Memindah supernatant pada tube baru
Memanaskan susu Mencampur susu dan enzim
Menginkubasi sampel Menambah ethanol pada sampel
