LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA II PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM LIPASE
OLEH :
I GEDE ARKA LINGGA BUMI 1908511002
KELAS A
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA
2021
PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM LIPASE I. Tujuan
1. Menentukan aktivitas enzim lipase
2. Mengetahui pengaruh penambahan emulsi minyak terhadap aktivitas enzim lipase 3. Memahami pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim lipase
4. Mengetahui hubungan antara aktivitas enzim lipase terhadap waktu inkubasi 5. Mengetahui fungsi dari pemanasan dan pengaruhnya terhadap enzim lipase
II. Dasar Teori
Ilmu yang mempelajari enzim meliputi struktur, fungsi, sifat, serta kinetika reaksi disebut enzimologi. Enzim adalah biokatalisator atau katalis protein yang terbentuk pada sel tubuh makhluk hidup. Berperan sebagai biokatalisator, enzim mempercepat reaksi kimia tanpa terjadi perubahan permanen dengan cepat efisien, dan spesifik.
Sebagai biokatalis, enzim sangat efisen dalam mempercepat reaksi, bekerja kondisi lingkungan sedang, dapat terurai secara biologis, aman, ramah lingkungan, serta dapat digunakan berulang-ulang (Sutrisno, 2017)
Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia organik. Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk. Jenis produk yang akan dihasilkan bergantung pada suatu kondisi/zat, yang disebut promoter. Semua proses biologis sel memerlukan enzim agar dapat berlangsung dengan cukup cepat dalam suatu arah lintasan metabolisme yang ditentukan oleh hormon sebagai promoter (Gaman dan Sherrington, 1992).
Dalam arti lain enzim adalah golongan protein yang disintesis oleh sel hidup dan mempunyai fungsi penting sebagai katalisator dalam setiap reaksi metabolisme yang terjadi pada organisasi hidup. Enzim juga merupakan biokatalisator yang menunjang berbagai proses industri. Hal ini disebabkan enzim mempunyai efisiensi dan efektifitas yang tinggi, reaksinya tidak menimbulkan produk samping, serta dapat digunakan berulangkali dengan teknik amobilisasi (Lehninger, 1995)
Untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai aktivitas yang tinggi, perlu diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi pertumbuhan, cara
isolasi, serta jenis substrat yang digunakan. Kondisi pertumbuhan yang menunjang produksi enzim secara maksimal adalah pH, suhu inkubasi, waktu inkubasi, dan komposisi media pertumbuhan harus mengandung sumber energi, sumber karbon, sumber nitrogen dan mineral (Wang, 1979).
Enzim lipase bekerja secara spesifik bagi Enzim lipase bekerja secara spesifik bagi substrat yang memiliki gugus ester. Enzim ini mengkatalisis hidrolisis dan sintesis bentuk ester dari gliserol dan asam lemak rantai panjang. Pada penyiapan sampel dilakukan penambahan asam oleat. Asam ini berfungsi sebagai emulgator dari substrat karena asam oleat sendiri memiliki gugus hidrofil dan hidrofob didua muka yang berlainan. Gugus hidrofob ini akan berikatan dengan asam lemak, sementara gugus hidrofilnya akan berikatan akan berikatan dengan enzim. Hal ini sesuai dengan sifat enzim lipase yang memang larut dalam air. Enzim ini juga berperan dalam transfer lipid antar membran. Hal ini dikarenakan lipase memecah triasilgliserida (molekul yang besar) untuk bisa melewati membran untuk bisa melewati membran dalam mitokondria agar bisa dioksidasi lebih lanjut. Sayangnya enzim ini sedikit sulit untuk diekstraksi dan tidak bekerja pada pH untuk diekstraksi dan tidak bekerja pada pH rendah (Dosanjh dan Kaur, 2002).
Salah satu jenis enzim yang mempunyai peran penting dan tidak ada bandingan dalam pertumbuhan bioteknologi adalah enzim lipase. Enzim ini memiliki sifat khusus dapat memecahkan ikatan ester pada lemak dan gliserol. Selain itu, lipase mempunyai kemampuan mengkatalis reaksi organik baik didalam media berair maupun dalam media non air (Sumarsih, 2004).
Lipase yang berasal dari bakteri pada umumnya adalah protein yang memiliki sifat asam. Dan mempunyai berat molekul dari 20.000 sampai 60.000 memiliki aktivitas spesifik protein murni yang berubah-ubah dari 500 sampai 10.000 unit lipase per mg protein (Nishio, 1987).
Enzim lipase atau lengkapnya triasilgliserol lipase adalah enzim yang menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai substrat alami berupa trigliserida dari asam lemak yang mana reaksinya memerlukan air, dan lipase ekstraseluler berhasil diisolasi dari pseudomonas aeruginosa pada tahun 1986. Enzim lipase memiliki sub unit berupa glikoprotein dan lipoprotein. Sub unit tersebut dapat
sebagai monomer, dimer, oligomer atau polimer. Enzim lipase stabil pada suhu optimumnya yaitu 40˚C, walaupun masih aktif pada 51 ˚C (Nishio, 1987).
Aktivitas enzim ini dapat diukur dengan dua metoda, pada metoda perubahan pH tidak memberikan akurasi yang baik, hal ini bisa dilihat dari nilai regresi dan juga nilai pH yang tidak mengalami penurunan secara bertahap. Metode ini mengukur langsung jumlah asam lemak yang dihasilkan kedalam larutan lewat perubahan pH. Jika lipase masih memproduksi asam lemak maka larutan akan segera bertambah asam. Ketika pH larutan menunjukan nilai konstan pada pH yang makin asam maka aktifitas lipase dalam memprosuksi asam lemak telah berhenti. Perubahan pH yang tidak signifikan inilah yang membuat galat pengukuran menjadi besar. Pada metoda titrimetri, banyaknya asam lemak yang dilepaskan akan dititrasi oleh NaOH sehingga volume NaOH sama dengan volume asam lemak yang dihasilkan oleh aktivitas enzim lipase.
Proses pemanasan pada enzim akan membuat enzim menjadi rusak dan mengurangi aktivitasnya. Kondisi ini digunakan sebagai kondisi control pada penentuan aktivitas enzim dan juga penentuan secara perubahan pH. Pada proses titrasi larutan diamati perubahan warna dari putih menjadi pink kemudian menjadi putih kembali. Jika larutan tidak mengalami perubahan warna kembali maka asam lemak yang dihasilkan dari enzim telah habis dititrasi. Bisa dikatakan bahwa enzim lipase tidak melakukan aktifitas untuk memproduksi asam lemak kembali (Mitsuda, 1989).
III. Alat dan Bahan 3.1.Alat :
- Buret dan Statif - Erlenmeyer 250 Ml - Tabung Reaksi - Inkubator 37oC - Penangas Air 3.2.Bahan :
- Emulsi Minyak - Alkohol 95%
- Aquades - Indikator Fenol
- Na2CO3 0,1 M - Tablet pancreas - NaOH 0,05 M IV. Prosedur Kerja
Hasil pengamatan dicatat dalam tabel berikut ini : No
Tabung
Warna mula-mula setelah inkubasi
Perubahan warna setelah ditambah alkohol dan Pp
Volume Larutan standar NaOh yang diperlukan (Ml)
Jumlah mMol NaOH
T1 = 0’ Merah muda keruh Putih keruh 6,1 0,305 T2 = 15’ Merah muda keruh Putih keruh 7,25 0,3625 T3 = 30’ Merah muda keruh Putih keruh 3,45 0,1725 T4 = 45’ Merah muda keruh Putih keruh 9,2 0,46
Aktivitas lipase yaitu jumlah mMol NaOH yang diperlukan untuk menetralkan hasil reaksi pada tabung no. 2 s/d 4 dihitung dan grafik aktivitas lipase terhadap waktu inkubasi dibuat
V. Data Pengamatan
5.1 Tabel Data Pengamatan
No Perlakuan Hasil
1. Tabung 1 yang sudah terisi suspensi ekstrak pancreas dipanaskan pada suhu 100°C selama 1 menit
Enzim Non aktif
2. Keempat tabung sebelumnya ditambahkan 5mL emulsi minyak dan 1 mL air
Larutan suspensi berubah warna dari putih susu menjadi merah muda keruh
3. Campuran diinkubasi pada suhu kamar (37°C)
-Tabung 1
0 menit : Terjadi perubahan warna merah muda
-Tabung 2
15 menit : merah muda keruh -Tabung 3
30 menit : merah muda keruh -Tabung 4
45 menit : merah muda keruh 4. Ditambahkan etanol PA 20
mL dan PP 10 tetes
Tabung 1,2,3,4 menjadi putih keruh 5. Dititrasi dengan NaOH NaOH yang dihabiskan sebanyak
Tabung 1 (0 menit) : 6,1 mL Tabung 2 (15 menit) : 7,25 mL Tabung 3 (30 menit) : 3,45 mL Tabung 4 (45 menit) : 9,2 mL
VI. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan mengenai penentuan dari enzim lipase, yang dimana pada praktikum ini digunakan metode titrimetrik. Prinsipnya adalah pengaruh faktor eksternal pada aktivitas enzim. Untuk mengetahui pengaruh pemanasan dan inhibitor terhadap aktivitas enzim dengan melakukan uji aktivitas enzim lipase pankreastik. Adapun tujuan dari dilakukannya uji aktivitas enzim lipase pankreastik adalah untuk mengetahui aktivitas enzim dalam memecah lipid menjadi asam lemak dan gliserol dengan berbagai variasi kondisi larutan sampel (minyak).
Prinsipnya yakni pemecahan lipid oleh enzim lipase pankreastik dengan metode yang digunakan yakni pemanasan, penginkubasian dan titrasi asam basa.
Pertama adalah dibuat suspensi ekstrak sebagai bahan pengamatan, kemudian disiapkan emulsi minyak yang dibuat dari campuran minyak yang ditambah air. Akibat adanya perbedaan kepolaran antara minyak dan air menyebabkan keduanya tidak larut, oleh karena itu terdapat emulsi setelah penambahan air. Selanjutnya ditambahkan indicator fenolftalein dimana indicator fenolftalein merupakan asam diprotik dan berfungsi unuk menentukan titik ekuivalen, dan dititrasi dengan larutan standar NaOH 0,5 M hingga berwarna merah muda.
Ekstrak pankreas yang telah dibuat yang bersumber dari enzim lipase yang dimasukkan ke 2 tabung berbeda untuk menguji aktivitas enzim lipase pada kondisi yang berbeda-beda tiap tabung reaksi. Tabung 1 dipanaskan yang bertujuan untuk mematikan enzim sehingga memperbanyak varian kondisi untuk dibandingkan.
Selanjutnya dilakukan pemanasan selama 1 meit pada suhu 100˚C saat air mendidih sehingga dihasilkan larutan putih keruh dan terdapat gelembung. Gelembung ini merupakan proses pemanasan yang mendidih dan penguapan akibat pemanasan yang terjadi dilakukan secara terbuka. Lalu dilanjutkan dengan proses inkubasi dimana tabung 1 selama 0 menit, tabung 2 selama 15 menit, tabung 3 selama 30 menit, dan tabung 4 selama 45 menit. Sebelum proses inkubasi dilakukan terdapat penambahan emulsi minyak yang berfungsi sebagai substrat lipid yang nantinya akan dipecah menjadi asam lemak dan gliserol dengan bantuan enzim lipase. Proses inkubasi pada suhu 37 ˚C agar mengetahui aktivitas enzim pada suhu optimumnya yaitu 37.
Selanjutnya proses titrasi asam basa dengan NaOH sebagai titran dan penambahan alkohol 95% yang berfungsi untuk menghidrolisis protein enzim lipase sehingga reaksi enzimatis akan terhenti karena rusaknya enzim. Lalu ditambah indicator fenolftalein yang menandai titik akhir titrasi menjadi merah muda yang fungsinya sebagai titik ekuivalen. Pada titrasi NaOH digunakakan untuk mengetahui jumlah mol NaOH yang digunakan sebagai aktivasi enzim lipase. Volume NaOH yang digunakan secara berturut-turut yakni 6,1 mL, 7,25 mL, 3,45 mL, 9,2 Ml
Sehingga aktivitas enzim lipase yang disimbolkan dengan jumlah mol dari NaOH yang dibutuhkan sebesar 0,305 mMol ; 0,3625 mMol ; 0,1725 mMol ; 0,46 mMol.
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas dari enzim lipase ini, seperti temperature, proses inkubasi, Ph, dan penambahan indikator eksternal lainnya.
VII. Kesimpulan
1. Uji aktivitas enzim lipase ditentukan dengan metode titrasi titrimetri, dengan emulsi minyak dan proses inkubasi
2. Penambahan emulsi minyak yakni sebagai substrat lipid yang akan dipecah menjadi asam lemak dan gliserol dengan bantuan enzim lipase
3. Pengaruh waktu inkubasi terhadap uji aktivitas enzim adalah dan semakin lama proses inkubasi mempunyai nilai aktivitas enzim lipase yang besar
4. Hubungan antara aktivitas enzim dengan waktu inkubasi adalah berbanding lurus.
5. Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim lipase yakni temperatur, proses penginkubasi, pH, dan penambahan indikator eksternal lainnya
DAFTAR PUSTAKA
Abigor, R.D, P.O.Uadia., T.A. Foglia, M.J, Hass, K. Scott dan B.J. Savary. 2002. Partial and Properties of Lipase from Germaning Seeds of Jatropha Curcas, L. J. Am Oil.Chem.Soc, 79: hal.1123-1126
Dosanjh, N.S., dan Kaur, J. 2002. Immobilization, Stability and esterification Studies of A Lipase From Bacillus sp. Journal Biotechnology and Applied Biochemistry. Vol. 36. Hlm 7-12.
Punjab University Chandigarh.
Gaman, P.M. and K.B Sherington. 1992.. Ilmu Pangan, Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi dan Mikrobiologi. Edisi kedua. Diterjemahkan oleh Ir. Murdijati Gardjito, dkk. UGM Press.
Yogyakarta
Nishio, T., T. Chikano, and M. Kamimura. 1987. Triacylgliserol dalam Enzyme Handbook.
Springer -Verlag, Berlin.
S. Mitsuda, S. Nabeshima, H. Hirhora. 1989.Appl. Microbiol. Biotechnol. 31, 334 ± 337.
Sumarsih, S. 2002. Uji Aktivitas Lipolitik Beberapa Bakteri Hasil Isolasi dari Pelabuhan Tanjung Perak dan Produksi Lipase dari Strain Terpilih. JIPTUNAIR. Surabaya.
Staf Laboratorium Biokimia. 2021. Penuntun Praktikum Biokimia II Jurusan Kimia.
Laboratorium Kimia Universitas Udayana. Badung.
Wang, I.C. 1979. Fermentation and Enzymes Technology. John Wiley and Sons. New York Yunita, Putri. 2012. Skrining dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri dari Limbah Rumah
Pemotongan Hewan. Program Studi Kimia Universitas Airlangga. Surabaya.
LAMPIRAN 1. Data Pengamatan
2. Perhitungan
Menghitung jumlah mMol NaOH dalam titrasi dengan aktivitas enzim lipase Diketahui :
T = 0’ V NaOH = 6,10 mL T = 15’ V NaOH = 7,25 mL T = 30’ V NaOH = 3,45 mL T = 45’ V NaOH = 9,20 mL Ditanya : mol NaOH ?
Jawab :
a. T = 0 menit
Mol NaOH = M NaOH x V NaOH
= 0,05 mMol/mL X 6,10 mL
= 0,305 mMol
= 30,5 mol
b. T = 15 menit
Mol NaOH = M NaOH x V NaOH
= 0,05 mMol/mL X 7,25 mL
= 0,3625 mMol
= 36,25 mol
c. T = 30 menit
Mol NaOH = M NaOH x V NaOH
= 0,05 mMol/mL X 3,45 mL
= 0,1725 mMol
= 17,25 mol
d. T = 45 menit
Mol NaOH = M NaOH x V NaOH
= 0,05 mMol/mL X 9,20 mL
= 0,46 mMol
= 46 mol
3. Grafik
Grafik
50
40
30
20
17,25 30,5 36,25 46
Aktivitas Enzim Lipase
Waktu
