Makalah PCR

Polymerase Chain Reaction

Oleh :

Entri Aprilia (220110120096) Farisya Nur Rohmantika (220110120169) Hanifah Shalihah A (220110120107) Ima Hadya Mulky (220110120158) Irvan Rafani Akhyar (220110120089) Maryam Jamilah (220110120129) Putri Septina (220110120144) Qonny Welendri (220110120127) Redi Saputra A K (220110120136) Siti Hanifah R F (220110120148) Sri Astutiningsih (220110120156) Zakiah Puteri R (220110120145)

Fakultas Ilmu Keperawatan

Universitas Padjadjaran

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kemajuan bidang pendidikan di dunia tentunya diikuti pula oleh kemajuan di bidang teknologi. Tidak bisa dipungkiri lagi kemajuan teknologi khususnya di bidang kesehatan sangat diperlukan untuk menunjang kesehatan masyarakat. Salah satu kemajuan dalam bidang kesehatan adalah reaksi berantai polymerase atau biasa disebut PCR (Polymerase Chain Reaction).

Pada tahun 1993, Kary Mullis menemukan suatu metode replikasi (perbanyakan DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dari metode ini dihasilkanlah DNA dalam jumlah yang banyak dalam waktu yang relatif singkat. Metode inilah yang disebut dengan PCR.

Teknik dari PCR ini banyak diaplikasikan dalam biokimia dan biologi molekuler karena kemudahan-kemudahan yang dimiliki.

1.2 Rumusan Masalah

 Apa yang dimaksud dengan PCR?

 Bagaimana tahapan-tahapan kerja dari PCR?

 Apa manfaat dan kerugian dalam penggunaan PCR?

1.3 Tujuan

 Manjadi bahan kajian bagi mahasiswa Fakultas Ilmu Keperawatan.

 Membahas dan mengkaji manfaat dan kerugian PCR dalam dunia kesehatan.  Mengetahui tahapan-tahapan yang terjadi pada PCR.

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah reaksi penggandaan DNA menggunakan mesin thermal cycler (mesin PCR).Prinsip kerja alat ini adalah dengan menaikan dan menurunkan temperatur dalam periode waktu tertentu untuk mendenaturasi DNA, menempelkan primer pada DNA (annealing) dan menggandakannya (elongasi atau ekstensi). Proses amplifikasi PCR melibatkan variasi suhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimerase yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90 0_C.

Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. DNA yang jumlahnya sangat kecil, misalnya beberapa folikel rambut juga dapat dikarakterisasi dengan metode ini. PCR dapat memproduksi DNA secara cepat,bahkan ketika tidak ada lagi duplikat dari DNA itu yang diketahui. PCR memiliki banyak metode untuk memperbanyak, seperti menghasilkan duplikat DNA. Tugas merangkai DNA dapat dilakukan juga oleh PCR. Misalnya untuk mengetahui segmen DNA dari pasien yang menderita penyakit mutasi genetik.

2.2 Komponen-komponen pada PCR

a. DNA template

DNA template merupakan cetakan DNA atau DNA yang menjadi patokan untuk menggandakan DNA yang lain.

b. Enzim DNA polimerase

DNA polimerase adalah enzim penting dalam replikasi DNA maupun dalam

reaksi polimerisasi deoksiribonukleotida menjadi rantai DNA, dengan kata lain enzim ini mengkatalisasi reaksi pembentukan DNA.

c. Primer

Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

d. dNTP

dNTP merupakan building blok atau bisa disebut ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA,yaitu dATP, dCTP, dGTP dan TTP

e. Buffer

Buffer yang biasanyaterdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

f. Ion logam

• Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim

DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.

• Ion logam monovalen, kalsium (K+).

2.3 Tahap-Tahap pada PCR 1. Denaturasi

Denaturasi dilakukan pada suhu 90-95°C, sehingga terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (template) tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase.

2. Annealing

Selanjutnya, suhu diturunkan untuk penempelan primer oligonukleotida pada sekuens yang komplementer pada molekul DNA cetakan. Tahap ini disebut annealing. Suhu campuran diturunkan sampai mencapai ~55°C atau sesuai melting temperature (Tm) dari primer oligonukleotida (Glick & Pasternak, 2003). Selama tahap ini, primer berpasangan dengan sekuens komplementernya di dalam DNA cetakan. Primer oligonukleotida melekat pada masing-masing utas tunggal DNA dengan arah yang berlawanan; satu primer melekat pada ujung untai DNA sense, sedangkan primer yang lain melekat pada ujung utas DNA antisense.

3. Ekstensi

Tahap selanjutnya adalah tahap ekstensi yang dilakukan pada suhu 72°C. Suhu ini merupakan suhu optimum untuk kerja enzim Taq DNA polimerase. Pada tahap ini enzim Taq DNA polimerase mengkatalis reaksi penambahan mononukleotida pada primer yang sesuai dengan utas DNA komplemen yang berada di sebelahnya. Suhu pada setiap tahap diatur sedemikian rupa sehingga dihasilkan amplifikasi sekuens target DNA yang efisien.

2.4 Keuntungan dan Kerugian pada PCR a. Keuntungan

o Dengan jumlah yang sedikit dari susunan DNA dapat digunakan seperti halnya satu sel yang kecil

o Adanya degradasi DNA menjadi fragmen-fragmen hanya beberapa ratus pasang dapat juga digunakan untuk amplifikasi

o Banyaknya angka copy dari urutan DNA yang spesifik dapat di amplifikasi secara simultan dengan reaksi multiplex PCR

o DNA kontaminan, seperti jamur dan bakteri, tak dapat teramplifikasi karena hanya digunakan yang spesifik untuk manusia saja.

o ‘Commercial kits’ sekarang sudah avalable untuk simpel reaksi PCR dan amplifikasinya.

b. Kerugian

o Target dari susunan DNA dapat tak teramplifikasi dengan adanya atau munculnya penghambat PCR pada DNA yang telah di ekstrak.

o Amplifikasi dapat gagal jika terjadi perubahan urutan pada primer-binding pada susunan genom DNA

o Kontaminasi dari sumber manusia lain selain dari barang bukti forensik tersebut atau kontaminasi sampel DNA teramplifikasi yang tak hati-hati oleh petugas laboratorium forensik.

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Salah satu teknik perbanyakan DNA yang juga banyak dimanfaatkan pada dewasa ini adalah PCR yang telah dijelaskan di atas tadi. Jadi, PCR merupakan metode replikasi DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organism. Dari metode ini dihasilkanlah DNA dalam jumlah yang banyak dalam waktu yang relative singkat, sehingga memudahkan berbagai macam metode yang memanfaatkan DNA. PCR ini pun memiliki tiga tahap, yaitu peleburan (melting), annealing (penempelan) dan ekstensi. Tahapan ini dilakukan dalam 20-30 kali siklus.

3.2 Lampiran

Mesin thermal cycler

Reaksi PCR Potongan DNA

Bakteri Thermus aquaticus

Daftar Pustaka

Kusuma Sri Agung Fitri. 2010. Makalah PCR. Sumedang : Universitas Padjajaran. http://id.wikipedia.org/wiki/Reaksi_berantai_polimerase

http://reaksichainpolimerase.blogspot.com/2007/07/keuntungan-dan-kerugian-pcr-dengan.html

LEMBAR PENGESAHAN

MAKALAH

Polymerase Chain Reaction

Oleh :

Entri Aprilia (220110120096) Farisya Nur Rohmantika (220110120169) Hanifah Shalihah A (220110120107) Ima Hadya Mulky (220110120158) Irvan Rafani Akhyar (220110120089) Maryam Jamilah (220110120129) Putri Septina (220110120144) Qonny Welendri (220110120127) Redi Saputra A K (220110120136) Siti Hanifah R F (220110120148) Sri Astutiningsih (220110120156) Zakiah Puteri R (220110120145) Jatinangor, 14 September 2012 Mengetahui,

M

aria K omariah , S.Kp.,MKes. NIP. 19701224 199903 2 001