BAHAN DAN METODE
Mikrob yang Digunakan dalam Penelitian
Tiga isolat bakteri simbion spons yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat HAL-13, HAL-74, dan HAA-01. Ketiga isolat tersebut merupakan koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor. Ketiga isolat tersebut diisolasi dari spons Haliclona sp. yang berasal dari perairan Raja Ampat Papua oleh Tokasaya (2010).
Mikrob uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Enteropatogenik Escherichia coli K1-1 (Koleksi Dr. dr. Sri Budiarti dari Laboratorium Bioteknologi Hewan, Pusat Antar Universitas, IPB), Pseudomonas aeruginosa (Laboratorium Bioteknologi Hewan, Pusat Antar Universitas, IPB), Staphylococcus aureus (Laboratorium Bioteknologi Hewan, Pusat Antar Universitas, IPB), Candida albicans (Laboratrium Parasitologi, Falkutas Kedokteran Universitas Indonesia), dan Candida tropicalis (Laboratorium Parasitologi, Falkutas Kedokteran Universitas Indonesia).
Ekstraksi Senyawa Antimikrob
Isolasi senyawa antimikrob dari kultur cair bakteri dengan pelarut n-butanol dilakukan seperti yang telah dideskripsikan oleh Müller et al. (2004). Isolat bakteri (HAL-13, HAL-74, dan HAA-01) dikulturkan pada 1 L media sea water complete (5 g bacto pepton, 1 g yeast extract, 3 ml gliserol, 750 mL air laut, dan 250 mL akuades) dan diinkubasi menggunakan inkubator bergoyang pada kecepatan 100 rpm, suhu 30 0C, hingga fase stasioner. Kultur bakteri kemudian ditambahkan 300 mL n-butanol. Campuran diinkubasi pada suhu 40 0C selama 24 jam, campuran kemudian dikocok dengan kecepatan 250 rpm selama 2 jam. Lapisan butanol yang terbentuk diatas kultur kemudian dipisahkan dan dipekatkan menggunakan rotari evaporator, sehingga hanya didapatkan residu kering yang merupakan ekstrak kasar n-butanol. Ekstrak kasar diekstraksi secara bertingkat menggunakan metanol, campuran disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipekatkan sehingga didapatkan residu padat yang kemudian dilarutkan menggunakan metanol hingga konsentrasi 100 mg/mL.
Isolasi senyawa antimikrob menggunakan pelarut etil asetat dilakukan memodifikasi metode yang telah dideskripsikan Sunaryanto et al. (2010). Sebanyak 1 L kultur bakteri yang telah mencapai fase stasioner ditambahkan dengan 1 L etil asetat. Campuran diinkubasi pada suhu ruang selama 12 jam, kemudian campuran dikocok pada kecepatan 250 rpm selama 2 jam. Lapisan etil asetat dipisahkan dan dipekatkan menggunakan rotari evaporator hingga didapatkan residu kering ekstrak kasar etil asetat. Ekstrak kasar diekstraksi secara bertingkat menggunakan metanol, campuran disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipekatkan sehingga didapatkan residu padat yang kemudian dilarutkan menggunakan metanol hingga konsentrasi 100 mg/mL.
Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob
Uji aktivitas antibakteri dan anticendawan dilakukan menggunakan metode difusi pada kertas cakram seperti yang telah dideskripsikan Sudirman (2010). Sebanyak 100 µL ekstrak kasar bakteri yang terlarut dalam metanol diteteskan perlahan-lahan pada kertas cakram berdiameter 6 mm sambil dikeringkan menggunakan pengering rambut (40 0C).
Kertas cakram dikeringkan pada suhu 37 0C selama 2 jam, kemudian diletakkan pada permukaan media agar semisolid yang sebelumnnya telah ditambahkan 1% (v/v) kultur cair strain uji pada konsentrasi sel 5 x 107 (OD620
0.45) untuk EPEC K1-1 dan 1 x 106 sel/mL (OD620 0.45) untuk isolat uji lainnya.
Cawan kemudian diinkubasi pada suhu 10 0C selama 12 jam. Selanjutnya media diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk disekitar kertas cakram kemudian diukur diameternya.
Deteksi Senyawa Antimikrob menggunakan Metode Bioautografi
Uji aktivitas senyawa antimikrob dengan teknik bioautografi dilakukan dengan memodifikasi metode yang telah dideskripsikan oleh Sudirman (2005). Ekstrak kasar bakteri yang terlarut dalam metanol (100 mg/mL) diteteskan secukupnya pada lempeng kromatografi lapis tipis dengan silika gel (MERCK 60 F254) sebagai fase diam. Dua jenis sistem solven yang digunakan dalam analisis ini adalah butanol-etil asetat-air (2:5:1) untuk ekstrak kasar isolat HAL-13 dan
HAA-01 serta heksan-metanol (1:1) untuk ekstrak kasar isolat HAL-74. Bercak senyawa yang terdeteksi pada lempeng kromatogram kemudian dipotong dan dikeringkan pada suhu ruang selama 2 hari.
Lempeng kromatogram diletakkan pada dasar cawan petri steril dan dilapisi dengan 15 mL media agar semisolid yang sebelumnya telah dicampurkan dengan kultur cair bakteri uji yang terdiri dari EPEC K1-1 dan S. aureus. Cawan diinkubasi pada suhu 10 0C selama 12 jam, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam. Zona bening akan terlihat di sekitar lempeng kromatografi lapis tipis (KLT) jika lempeng tersebut mengandung bercak fraksi senyawa aktif. Zona bening yang terbentuk kemudian dihitung nilai faktor retensinya (Rf).
EPEC K1-1 dan S. aureus digunakan dalam uji bioautografi terhadap ekstrak kasar senyawa antimikrob dikarenakan sifat dan potensi klinis dari kedua bakteri uji tersebut. EPEC K1-1 merupakan satu-satunya bakteri uji yang memiliki aktivitas β-laktamase dalam penelitian ini. Penggunaan bakteri uji tersebut diharapkan akan memunculkan fraksi senyawa yang aktivitasnya tidak dihambat oleh enzim β-laktamase. Sehingga kemungkinan untuk mendapatkan senyawa antimikrob yang berbeda dari kelompok senyawa β-laktam lebih besar. S. aureus merupakan bakteri patogen yang umum tersebar pada permukaan tubuh manusia dan mampu bertahan terhadap sistem kekebalan tubuh manusia (Liu 2009). Hingga saat ini S. aureus merupakan patogen yang dikenal umum sebagai penyebab penyakit ISPA yang sering melanda daerah tropis seperti Indonesia. Senyawa antimikrob yang diperoleh dalam penelitian ini diharapkan berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen kemoterapi baru untuk mengatasi penyakit infeksi seperti diare atau ISPA yang sering menimbulkan KLB di Indonesia.
Pemurnian Senyawa Antimikrob dari Ekstrak Kasar
Pemurnian senyawa antimikrob dari ekstrak kasar isolat HAL-13 dilakukan menggunakan piranti semi-automated flash chromatography (Buchi Pump Controler C-610). Piranti tersebut merupakan sistem kromatografi kolom dengan kolom gel silika siap pakai dan pompa untuk mendorong eluen ke dalam kolom. Sebanyak 3 gram ekstrak kasar etil asetat isolat HAL-13 dilarutkan dengan pelarut klorofom-metanol (90%-10%) dan diinjeksikan ke dalam kolom gel silika (0.40 x
150 mm; 40 x 63 µm). Eluen klorofom-metanol (90%-10%) kemudian dialirkan ke dalam kolom dengan kecepatan alir 3.5 mL/menit. Polaritas eluen ditingkatkan dengan menambah konsentrasi metanol dalam larutan eluen secara bertahap dari metanol 20%, 30%, 50%, 70%, hingga metanol 90%. Fraksi senyawa yang keluar dari kolom ditampung pada tabung kaca dengan volume 5 mL untuk tiap fraksi senyawa.
Analisis KLT terhadap fraksi senyawa yang terkumpul dilakukan untuk mengetahui fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram sama, sehingga terdapat beberapa fraksi senyawa yang dapat digabungkan. Fraksi senyawa hasil kromatografi kolom kemudian dipekatkan dengan menggunakan kompresor. Deteksi bercak senyawa pada lempeng kromatografi lapis tipis dilakukan pada dua panjang gelombang ultraviolet, yaitu panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
Uji Bioaktivitas Hasil Fraksinasi Senyawa
Fraksi senyawa diuji aktivitas antimikrobnya menggunakan metode filtrasi pada kertas cakram. Kertas cakram berdiameter 6 mm direndam selama 1 jam dalam fraksi senyawa, kemudian kertas cakram dikeringkan pada suhu 37 0C selama 2 jam. Kertas cakram yang telah kering dan mengandung fraksi senyawa diletakkan di atas permukaan media agar semisolid yang sebelumnya telah dicampurkan dengan kultur cair strain uji (OD620 0.45). Media diinkubasi pada
suhu 10 0C selama 3 hingga 4 jam, lalu diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Fraksi senyawa yang membentuk zona bening pada cawan dianggap sebagai fraksi aktif.
Pemurnian Senyawa Antimikrob menggunakan Teknik KLT Preparatif
Senyawa antimikrob yang terdapat pada fraksi aktif ditingkatkan kemurniannya menggunakan teknik KLT preparatif. Tiga jenis eluen yang digunakan dalam melakukan KLT preparatif antara lain adalah etil asetat, klorofom-metanol (8:2), dan klorofom-metanol (7:3). Fraksi senyawa diteteskan secukupnya pada lempeng gel silika (MERCK 60 F 254, tebal 0.1 mm). Lempeng KLT kemudian diletakkan secara tegak pada botol kaca yang berisi larutan eluen. Bercak senyawa yang terdeteksi pada panjang gelombang 366 maupun 254 nm
diekstraksi langsung dari gel silika menggunakan pelarut metanol. Senyawa dari fraksi aktif yang telah dimurnikan dengan teknik KLT preparatif kemudian diuji aktivitas antimikrobnya menggunakan metode difusi pada kertas saring terhadap EPEC K1-1. EPEC K1-1 digunakan sebagai bakteri uji dalam metode ini untuk mendapatkan senyawa antimikrob yang berbeda dari kelompok senyawa β-laktam, sehingga aktivitasnya tidak dihambat oleh enzim β-laktamase yang telah tersebar diantara strain-strain bakteri patogen.
Isolasi DNA Genom dan Amplifikasi Fragmen DNA Penyandi Domain Ketosintase
Isolasi DNA Genom dilakukan menggunakan metode lisis dengan cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) (Sambrook & Russel 2001). Prinsip dari metode ini adalah melisis sel menggunakan perlakuan kimia (lisozim, sodium dodecyl sulphate, dan CTAB) serta pemisahan molekul DNA dengan molekul organik lainnya menggunakan campuran larutan fenol, klorofom dan isoamilalkohol (PCI).
Isolat HAL-13, HAL-74, dan HAA-01 dikulturkan menggunakan media cair SWC pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 100 rpm dan suhu 30 0C selama 24 jam. Sebanyak 1.5 mL kultur bakteri dipindahkan ke dalam tabung mikro steril dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Pelet sel diresuspensi dengan 100 µL bufer Tris-EDTA (1 x), sebanyak 5 µL (100 mg/mL) lisozim ditambahkan ke dalam suspensi sel. Campuran diinkubasi pada suhu 37 0C selama 30 menit. Campuran kemudian ditambahkan dengan 500 µL SDS (10 % b/v) dan 10 µL (100 mg/ml) proteinase-k. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 0C selama 3 jam. Sebanyak 100 µL CTAB (10 % b/v) dan 80 µL NaCl (5 M) ditambahkan ke dalam campuran dan diinkubasi pada suhu 60 0C selama 20 menit. Pemisahan DNA dari molekul organik lainnya dilakukan dengan penambahan 600 µL larutan PCI (25:24:1). Campuran kemudian dikocok kuat dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Lapisan atas yang berwarna bening dipindahkan ke dalam tabung mikro baru dan dicampurkan dengan larutan CI (24:1). Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Lapisan atas dipindahkan dan dicampurkan dengan 1 mL etanol absolut. Inkubasi dilakukan pada suhu -20 0C selama 12 jam. Pengendapan DNA
dilakukan dengan mensentrifugasi campuran pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Pelet yang berupa molekul DNA kemudian dibilas dengan etanol 70%. DNA genom dilarutkan dalam 50 µL akuabides steril.
Amplifikasi fragmen DNA penyandi domain ketosintase dilakukan menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi kedua fragmen DNA tersebut bertujuan untuk mendeteksi kehadiran kluster gen penyandi kompleks enzim PKS. Reaksi PCR fragmen DNA penyandi domain ketosintase dilakukan melalui 30 siklus yang terdiri dari tiga tahap yaitu denaturasi (94 0C, 1 menit), annealing (50 0C, 1 menit), dan polimerisasi (72 0C, 1 menit), serta tahap post PCR pada suhu 72 0C selama 10 menit.
Amplifikasi Fragmen DNA penyandi domain ketosintase dilakukan dengan mencampurkan berturut-turut 3.25 μl ddH2O, 12.5 μl bufer PCR GC II, 4 μl (2.5 mM) dNTPs, 0.25 μl (5 unit/μl) enzim LA Taq DNA Polymerase, 1 μl (100 pmol) primer degeneratif domain ketosintase (forward: 5’-GCSATGGAYCCSCARCA RCGSVT-3’; dan reverse: 5’-GTSCCSGTSCCRTGSSCYTCSAC-3’), dan 3 μl (0.5 μg) DNA template.
Amplikon fragmen DNA penyandi domain ketosintase divisualisai menggunakan teknik elektroforesis dengan gel agarosa (1%), pewarnaan molekul DNA dilakukan menggunakan etidium bromida (5 µg/ mL). Amplikon akan menunjukkan pita pada ukuran sekitar 700 pasang basa yang merupakan ukuran sebenarnya dari fragmen penyandi domain ketosintase.
Kloning dan Analisis Bioinformatika Domain Ketosintase
Kloning molekuler dalam penelitian ini dilakukan untuk menganalisis sekuen DNA penyandi domain ketosintase secara lengkap. Amplikon fragmen penyandi domain ketosintase dari ketiga isolat diligasikan ke dalam vektor kloning pGEMT-Easy (3 kpb). Plasmid rekombinan yang terbentuk kemudian diintroduksikan ke dalam sel Escherichia coli DH5α menggunakan metode kejutan panas (Sambrook & Russel 2001).
Verifikasi keberhasilan introduksi plasmid rekombinan dilakukan dengan mengisolasi plasmid dari koloni putih E. coli DH5α. Isolasi plasmid rekombinan dilakukan menggunakan PureLinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen).
Plasmid hasil isolasi kemudian dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI untuk memastikan bahwa fragmen DNA penyandi domain ketosintase telah tersisipkan ke dalam plasmid pGEMT-Easy. Sebanyak 3 µL (± 100 ng) plasmid rekombinan hasil isolasi plasmid ditambahkan 2 µL bufer H, 0,2 µL Bouvine serum albumin (BSA), 0.5 µL (6 unit) EcoRI dan ddH2O hingga volume reaksi 20
µL. campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 12 jam. Plasmid rekombinan yang telah dipotong menggunakan enzim EcoRI divisualisasi menggunakan teknik gel elektroforesis.
Plasmid rekombinan yang diberi kode pGEMT-Easy-KS kemudian digunakan dalam proses sekuensing dan analisis bioinformatika fragmen penyandi domain ketosintase. Sekuensing fragmen DNA penyandi domain ketosintase dilakukan dengan menggunakan jasa PT. Genetika Sains Indonesia. Analisis bioinformatika terhadap sekuen fragmen DNA penyandi domain ketosintase dan domain adenilasi dilakukan menggunakan program Basic Local Alignment Search Tools (BLASTX) yang tersedia di situs web http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan sekuen domain ketosintase dilakukan menggunakan program MEGA4 dengan metode neighbor-joining.
