1
Studi Paparan Lipopolisakarida pada Tikus (Rattus norvegicus) Model Asma Terhadap Aktivitas Protease dan Gambaran Histopatologi
Sel Epitel Bronkiolus
Study of Lipopolysaccharide Exposure in Asthma rats (Rattus norvegicus) Model Toward Protease Activity and Histopathology Bronchial Epithelial Cells
Bedhi Kuswantoro, Aulanni’am, Dyah A.Oktavianie A.P
Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya
martodirejobedhi@gmail.com
ABSTRAK
Asma merupakan inflamasi saluran pernapasan yang melibatkan berbagai sel dan mediator inflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh paparan lipopolisakarida (LPS) pada tikus model asma (Rattus norvegicus) terhadap aktivitas protease dan gambaran histopatologi sel epitel bronkiolus. Penelitian ini menggunakan tikus (Rattus norvegicus) jantan yang dibagi dalam tiga kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok asma dan kelompok asma LPS. Sensitisasi alergi dilakukan dengan injeksi intraperitonial OVA sebanyak 10 μg/ml, dilanjutkan dengan nebulasi 1 mg/ml OVA selama 20 menit. Paparan LPS dilakukan dengan cara menginjeksikan 1 μg/ml LPS bakteri Phorpyromonas ginggivalis pada sulkus gingiva tikus. Gambaran histopatologi sel epitel bronkiolus diamati secara kualitatif menggunakan mikroskop sedangkan aktivitas protease diukur menggunakan metode Walter. Hasil penelitian menunjukkan bahwa paparan lipopolisakarida dapat meningkatkan aktivitas protease secara signifikan (p<0,05) pada kelompok asma yang terpapar LPS (0,031c ± 0,0020 µmol/mL.menit) dan kelompok asma (0,023b ± 0,0013 µmol/mL.menit), dibandingkan dengan kelompok kontrol (0,013a ± 0,0024 µmol/mL.menit). Histopatologi sel epitel bronkiolus pada kelompok asma dan kelompok asma terpapar LPS mengalami kerusakan yang ditunjukkan oleh preparat mikroskopis bronkiolus. Kesimpulan dari penelitian ini bahwa paparan LPS sebesar 1 μg/ml dapat meningkatkan aktivitas protease dan menyebabkan peningkatan kerusakan sel epitel bronkiolus.
Kata kunci : Asma, LPS, protease, histopatologi, epitel bronkiolus
ABSTRACT
Asthma is an inflammatory airways involving many cells and inflammatory mediators. This research was conducted to determine the effect of exposure
2
lipopolysaccharide (LPS) in asthma rats (Rattus norvegicus) models on protease activity and histopathology of bronchial epithelial cells. This research used male rats (Rattus norvegicus) in three groups which were control group, asthma group, and exposed LPS on asthma group. Asthma allergy sensitization was conducted by intraperitonial injection of 10 μg/ml ovalbumin (OVA), followed by 20 min 1mg/ml OVA by nebulizer. LPS exposure was conducted by injection of 1μg/ml Phorpyromonas ginggivalis LPS in rat’s gingival sulcus. Protease activity was assessed by Walter method and histopathology of bronchial epithelial cells was observed qualitatively. The results showed the protease activity was increased significantly (p<0,05) in LPS asthma group (0,031c ± 0,0020 µmol/mL.menit), asthma group (0,023b ± 0,0013 µmol/mL.minute), compared with normal group (0,013a ± 0,0024 µmol/mL.minute). The bronchial epithelial cells on asthma group and asthma LPS exposure group were damage that confirmed by microscopial of bronchial preparat. In conclusions of this research LPS exposure 1μg/ml was increased of protease activity at 25.8% and caused increasing the damage of the bronchial epithelial cells.
Keywords:Asthma, LPS, protease, histopathology, bronchial epithelial.
PENDAHULUAN
Asma merupakan inflamasi kronis pada saluran pernapasan yang melibatkan berbagai sel dan mediator, sehingga terjadi peningkatan kepekaan saluran pernapasan. Menurut Busse et al., (2001) dan National Institute Of Health., (2007), asma ditandai dengan obstruksi saluran pernapasan, hiperesponsivitas, hipersekresi mukus, edema dinding saluran pernapasan, deskuamasi epitel, infiltrasi sel inflamasi serta remodeling dari saluran pernapasan. Proses inflamasi asma khas ditandai dengan peningkatan eosinofil, sel mast, makrofag serta limfosit-T di lumen dan mukosa saluran pernapasan.
Berdasarkan beberapa penelitian terbaru menyebutkan bahwa paparan lipopolisakarida (LPS) merupakan faktor resiko yang memperparah keadaan asma. Sumber bakteri Gram negatif yang
berpotensi memproduksi lipopolisakarida (LPS) adalah Porphyromonas gingivalis. Bakteri Porphyromonas gingivalis merupakan bakteri rongga mulut yang menyebabkan adanya plak gigi dan periodontitis. Penelitian yang menjelaskan tentang patomekanisme keparahan asma akibat paparan lipopolisakarida rongga mulut masih relatif sedikit diketahui (Schwartz, 2002; Utomo, 2006).
Peningkatan respon sistem imun tubuh yang terbentuk terhadap paparan lipopolisakarida menyebabkan aktivasi sel mast, makrofag dan neutrofil untuk melepaskan protease. Protease merupakan enzim yang bersifat proteolitik sebagai respon pertahanan saluran pernapasan. Peningkatan produksi protease menyebabkan adanya
3 pengelupasan sel epitel saluran pernapasan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh paparan lipopolisakarida pada tikus (Rattus norvegicus) model asma terhadap peningkatan aktivitas enzim protease dan gambaran histopatologi sel epitel bronkiolus. Studi paparan
lipopolisakarida (LPS) berupa adanya peningkatan aktivitas enzim protease serta perubahan gambaran sel epitel bronkiolus, diharapkan dapat memberikan manfaat sebagai informasi kajian ilmiah tentang patomekanisme asma yang terpapar lipopolisakarida (LPS).
MATERI DAN METODE Perlakuan Hewan Coba
Penelitian ini menggunakan hewan coba berupa tikus (Rattus norvegicus) jantan strain wistar yang dibagi dalam 3 kelompok perlakuan masing-masing terdiri 6 ekor tikus yaitu kelompok kontrol, kelompok asma dan kelompok asma terpapar lipopolisakarida. Penggunaan hewan coba dalam penelitian ini telah mendapatkan sertifikat laik etik oleh Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya No: 77-KEP-UB.
Pembuatan Hewan Model Asma
Pembuatan hewan model asma dilakukan pada hari ke-1 dan ke-14 dengan injeksi ovalbumin (Sigma-Aldrich, Nomer Katalog: A5503) 10 μg/ml secara intraperitoneal dalam AlOH3 dalam PBS (phosphate buffer saline). Inhalasi tikus dilakukan pada hari ke-21 dalam tabung transparan yang dihubungkan dengan Nebulizer. Perlakuan pemicu asma dilakukan dengan nebulasi OVA dalam NaCl steril dengan dosis dari 1 mg/ml selama 20 menit.
Tatalaksana Injeksi Lipopolisakarida Injeksi lipopolisakarida (LPS) dilakukan secara intrasulkuler dengan dosis 1 μg/ml pada sulkus gingiva molar rahang atas kiri tikus. LPS yang digunakan adalah LPS1435/1450 dari Porphyromonas gingivalis (Astarte Biologics) yang berfungsi sebagai agen infeksi rongga mulut dan memodulasi respon imun. Injeksi LPS intrasulkuler dilakukan pada hari ke 10, 11 berturut-turut.
Pengukuran Aktivitas Protease
Pengukuran aktitivitas protease menggunakan metode walter dengan menggunakan kasein sebagai substrat yang diukur dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang maksimum 275 nm. Nilai absorbansi protease yang diperoleh dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku tirosin untuk mendapatkan nilai tirosin yang terbentuk pada reaksi enzimatis. Pengukuran aktivitas enzim protease dilakukan menggunakan rumus (Walter, 1984) :
4 Aktivitas enzim = x x fp Dimana : v = volume total sampel (mL)
q = waktu inkubasi (menit) fp = faktor pengencaran p = jumlah enzim (mL)
Satu unit aktivitas protease dinyatakan dengan banyaknya jumlah mikro mol tirosin yang dihasilkan dari hidrolisis kasein oleh 1 mL protease per menit. Pengamatan Gambaran Sel Epitel Bronkiolus
Pengambilan organ paru tikus dilakukan pada hari ke-21 setelah
inhalasi OVA untuk pembuatan preparat hematoksilin eosin. Gambaran histopatologi sel epitel bronkiolus diamati secara kualitatif menggunakan mikroskop Olympus BX51 dengan perbesaran lemah (100x) hingga perbesaran kuat (400x).
HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini menunjukkan bahwa paparan LPS dengan dosis sebesar 1µg/ml berpengaruh terhadap aktivitas protease pada tikus yang menderita asma. Paparan LPS dengan dosis 1µg/ml merupakan dosis rendah yang mampu memodulasi respon aktivasi sel Th2. Aktivitas protease pada kelompok tikus asma yang terpapar LPS lebih tinggi yaitu 0,031c ± 0,0020 (µmol/mL.menit),
dibandingkan dengan kelompok tikus asma yang hanya mendapatkan paparan ovalbumin yang memiliki aktivitas protease sebesar 0,023b ± 0,0013 (µmol/mL.menit) (Tabel 1). Hal ini sesuai dengan penelitian Hajnalka (2010), bahwa peningkatan aktivitas protease merupakan efek dari proses keparahan dari asma.
5
Gambar 1. Aktivitas protease paru tikus kontrol, asma dan asma yang terpapar lipopolisakarida
Tabel 1. Rataan aktivitas protease paru tikus kontrol, asma dan asma yang terpapar lipopolisakarida
Kelompok Aktivitas Protease Rata-rata (µmol/mL.minute)
Kontrol 0,013a ± 0,0024
Asma 0,023b ± 0,0013
Asma LPS 0,031c ± 0,0020
Dalam penelitian ini pada kelompok tikus kontrol memiliki aktivitas protease sebesar 0,013a ± 0,0024 (µmol/mL.menit). Perbedaan Notasi Beda Nyata Terkecil (BNT) menunjukkan perbedaan yang nyata dan signifikan (p<0,05) yang terjadi antara kelompok tikus kontrol, kelompok asma dan kelompok asma yang terpapar LPS (Gambar 1). Aktivitas protease pada kelompok tikus asma yang terpapar LPS
mengalami peningkatan aktivitas protease sebesar 25,8%.
Hal ini menunjukkan bahwa pada proses patogenesis asma dan paparan LPS dapat meningkatkan aktivitas protease. Hasil penelitian yang diperoleh sesuai dengan penelitian Farrah et al., (2002) yang menjelaskan bahwa paparan OVA, dan endotoksin LPS pada hewan model asma mampu menyebabkan adanya peningkatan aktivitas protease sebesar 33,3 %. Peningkatan aktivitas
6 protease merupakan respon imun yang terbentuk untuk perlindungan paru terhadap paparan ovalbumin dan endotoksin lipopolisakarida.
Peningkatan aktivitas protease dikarenakan paparan LPS dari bakteri Porpyrominas gingivalis yang direspon oleh reseptor Tool-Like Receptor-4 (TLR-4) yang mampu memodulasi sistem imun untuk melepaskan protease. LPS dapat terikat dengan dinding sel saluran pernapasan melalui bantuan senyawa Lipopolysacharide-binding protein (LBP). LPS tidak bertindak secara langsung terhadap sel tetapi melalui aktivasi sel inflamator dan mediator sistem imunitas (Campbell et al., 2006).
Pengaruh yang signifikan paparan dari adanya LPS yang diberikan akan menginduksi respon imun melalui jalur TH-2 yang selanjutnya akan memproduksi sitokin proinflamasi diantaranya IL-4, IL-6, IL-9, IL-13. Sitokin IL-4 dan IL-13 tersebut mengatifkan sel B, sehingga akan memproduksi s-IgE untuk mengaktivasi sel mast. Sitokin IL-6 dan IL-9 tersebut mengaktifkan sel makrofag sehingga akan memproduksi neutrofil. Sel mast, makrofag dan neutrofil yang telah teraktivasi selanjutnya akan memproduksi protease. Paparan LPS juga menyebabkan faktor trakskripsi Nuklear factor κB (NF-κB) yang mengalami migrasi menuju nukleus, untuk mengekspresikan sitokin dan kemokin seperti TNF α. Produksi TNF α yang berlebih pada sel akan menyebabkan agregasi dan aktivasi neutrofil serta pelepasan enzim protease (Campbell et al., 2006).
Produksi protease yang mengalami peningkatan memungkinkan memperparah keadaan asma melalui aktivitas proteolitiknya. Peningkatan protease sebenarnya dapat teratasi dengan inhibitor protease, namun tidak berimbangnya inhibitor terhadap dominasi aktivitas protease saluran pernapasan yang pada akhirnya akan menjadi predisposisi terhadap perkembangan keparahan asma.
Peningkatan aktivitas proteolitik terhadap saluran pernapasan menyebabkan kerusakan susunan sel dan epitel yang mengakibatkan adanya keadaan hiperresponsivitas saluran pernapasan, peningkatan permeabilitas mukosa saluran pernapasan, terhambatnya produksi faktor relaksan epitel dan penurunan pembentukan inhibitor protease (Nadel & Busse, 1998). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa papapan LPS mampu menginduksi respon sistem imun untuk meningkatkan aktivitas protease yang berkorelasi dengan tingkat keparahan keadaan asma. Tingkat keparahan asma dapat ditunjukkan dengan adanya kerusakan yang terjadi pada organ paru tikus putih (Rattus norvegicus) akibat paparan lipopolisakarida (LPS) yang dapat diketahui melalui pewarnaan Hematoksilin-Eosin (Gambar 2).
7
Gambar 2. Struktur histologis bronkiolus tikus dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (Perbesaran 200x)
Keterangan : A = tikus kontrol ; B = tikus asma ; C = tikus asma terpapar lipopolisakarida. Panah merah : kerusakan pada sel epitel bronkiolus
Hasil pewarnaan ini menunjukkan adanya perbedaan gambaran histologis pada sel epitel penyusun bronkiolus paru. Gambar 2 menunjukkan perbandingan kondisi kerusakan sel epitel bronkiolus tikus kontrol, tikus asma dan tikus asma terpapar lipopolisakarida. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian LPS dengan dosis 1 μg/ml dapat merusak pada bagian sel epitel bronkiolus. Sel-sel epitel bronkiolus tikus kontrol (Gambar 2.A) berada dalam kondisi yang baik dan normal dimana sel-sel epitel masih kompak berbentuk
bersilia silindris, susunan sel epitel yang membentuk barisan yang utuh. Sedangkan pada tikus asma (Gambar 2.B) pada bagian epitel mengalami kerusakan pada beberapa titik area tampak sedikit lepasnya sel epitel . Pada gambaran sel epitel bronkiolus tikus yang terpapar LPS (Gambar 2.C) pada bagian epitel mengalami kerusakan yang parah, kerusakan pada beberapa titik area yang lebih banyak, dimana tampak lepasnya sel epitel dan silia yang tidak beraturan.
Paparan lipopolisakarida (LPS) dapat memperparah keadaan asma karena
A B
8 endotoksin direspon melalui interaksi kompleks antara LPS – LBP. Interaksi kompleks tersebut menyebabkan aktivasi sel mast, makrofag dan neutrofil untuk melepaskan enzim protease. Protease berinteraksi melalui reseptor protease activated receptor (PAR). Reseptor PAR menunjukkan mengalami peningkatan pada sel epitel saluran pernapasan penderita asma (Tohda et al, 1999). Proses proteolitik protease terhadap sel epitel bronkiolus terjadi melalui dua jalur yang berbeda, jalur 1 melalui respon langsung protease yang berikatan dengan reseptor PAR. Jalur 2 melalui sel dendrit yang mengaktivasi sel TH2. Pelepasan enzim protease yang meningkat menyebabkan penyerangan protein
penyusun asam nukleat, membran sel epitel bronkiolus, degradasi sel epitel, pengelupasan sel epitel dan pelepasan silia epitel bronkiolus paru.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa paparan lipopolisakarida pada hewan model asma dapat memperparah keadaan asma. Gambaran histopatologi yang diperoleh dalam penelitian ini menunjukkan bahwa aktivitas protease yang meningkat dapat menyebabkan keparahan kerusakan sel epitel bronkiolus. Hal ini sesuai dengan penelitian Yasuhiro, (2011) yang menyatakan bahwa protease dapat memparah keadaan asma melalui aktivitas proteolitiknya terhadap sel
epitel bronkiolus.
KESIMPULAN
Penelitian ini menunjukkan bahwa paparan lipopolisakarida sebesar 1 µg/ml per ekor dapat meningkatkan aktivitas enzim protease hasil isolasi organ paru tikus putih (Rattus norvegicus) model asma sebesar 25,8 % dan menyebabkan
keparahan asma yang ditandai dengan kerusakan gambaran histologi organ paru tikus putih (Rattus norvegicus) model asma berupa peningkatan kerusakan sel epitel bronkiolus.
UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr.Aulanni’am, drh. DES sebagai ketua payung penelitian atas bimbingan, fasilitas Lab Biokimia dan
terima kasih kepada DIKTI yang telah mendanai penelitian ini melalui kegiatan PIMNAS.
DAFTAR PUSTAKA
Busse, W.W. & R.F. Lemanske, Jr. 2001. AsThma. The New England Journal of Medicine 344(5) : 350-362.
Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2006. Biologi-Edisi Kelima-Jilid III. Addison Wesley Longman, Inc
David, R. W. Michael, M.F. CaTherine, & A David. 2005. Cultivable
9 Oral Microbiota of Domestic Dogs. Microbiology Unit, Division of Microbial Diseases, Eastman Dental Institute, UCL, 256 Gray's Inn Road, London WC1X 8LD, United Kingdom. Farrah, K., K. Attila., X. Jie., H.L.
Seung., E. Pappachan., Kolattukudy., B. David., & B. Corry. 2002. Protease-Activated PaThway Underlying Th Cell Type 2 Activation and Allergic
Lung Disease. J
Immunol;169;5904-5911.
Hajnalka Szabó. 2010. Regulation Of Proteolytic Activity In Lung Inflammation: Cytokine-Induced Changes In Pulmonary EpiThelial Cells. Department of Paediatrics, University of Szeged.
Nadel, J.A., & W.W. Busse. 1998. AsThma. Am J Respir Crit Care Med;157: S130-8. National Institutes of HealTh. Definition.
2007. In: Global Initiative For AsThma. BeThesda: National Institutes of HealTh;.p. 50-9. Schwartz, D. A. 2002. The Genetics Of
Innate Immunity. Chest Journal 121 : 62S–68S.
Tohda, Y., H. Nakahara., H. Kubo., R. Haraguchi, M. Fukuoka., S. Nakajima. 1999. Effects Of Ono-1078 (Pranlukast) On Cytokine Production In Peripheral Blood Mononuclear Cells Of Patients WiTh Bronchial AsThma. Clin Exp Allergy;29:1532-6.
Utomo, H. 2006. Management Of Oral Focal Infection In Patients WiTh AsThmatic Symptoms. Dent. J. (Maj. Ked. Gigi) 39(3) :120– 125.
Walter, H.,E. 1984. MeThod WiTh Haemoglobin, Casein, And Azocoll As Substrate In. Bergmeyer. HU (ed). MeThods of enzymatic analysis. Verlag Chemie. Deerfield Beach Florida Basel.
Yasuhiro, Matsumura. 2011. Role Of Allergen Source-Derived Proteases In Sensitization Via Airway EpiThelial Cells. Department of Internal Medicine, Akishima Hospital,
1260 Nakagami-Cho,
Akishima-Shi, Tokyo 196-0022, Japan
