RESPON METABOLIT ANTI PATOGEN PADA AKAR TUSAM AKIBAT PENGIMBASAN INTERAKSI SIMBIOTIK MIKORISA. Fakultas Kehutanan Universitas Gadjah Mada

(1)

RESPON METABOLIT ANTI PATOGEN PADA AKAR

TUSAM AKIBAT PENGIMBASAN INTERAKSI

SIMBIOTIK MIKORISA

Fakultas Kehutanan

Universitas Gadjah Mada

(2)

LATAR BELAKANG

• Masa sukulen panjang

• Peka terhadap patogen • Tergantung pada mikorisa

Pinus merkusii Jungh. et de Vriese

Sehat

?

Mikorisa Ekto

(3)

M M i i k k o o r r i i z z a a Kompetisi/ Kompetisi/ antibiosis antibiosis Kompetisi/ Kompetisi/ antibiosis antibiosis Blocking Blocking • KimiawiKimiawi • FisikFisik T T r r i i c c h h o o d d e e r r m m a a Antagonisme Antagonisme • KompetisiKompetisi • AntibiosisAntibiosis • ParasitismeParasitisme Sintesis hormon Sintesis hormon

Patogenesis

• Inokulasi

Inokulasi

• Inkubasi

_Inkubasi

• Infeksi

Infeksi

Landasan

Teoritis

(4)

Tujuan

1. Isolasi fitoaleksin enzim

β

-

1,3-glukanase dan

kitinase sebagai respon infeksi jamur

pembentuk mikorisa pada tusam.

• Aktifitas fitoaleksin enzim

β-1,3-glukanase

dan

kitinase terhadap jamur penyebab rebah

semai secara in vitro.

• Pengaruh inokulan mikorisa terhadap

perkembangan Fusarium sp ; Rhizoctonia sp.

dan pertumbuhan semai tusam.

• Pengaruh T. reesei sebagai biokontrol

terhadap pembentukan mikorisa

• Pengaruh waktu inokulasi terhadap interaksi

antagonistik antara T. reesei dengan jamur

rebah semai (Fusarium sp. dan R. solani)

(5)

Tahun I

T0 T0 Trc Trc TrcTrc_Mi_Mi _Trc_Trc T-14 T-14 T+14T+14 Pembentukan Pembentukan mikorisa mikorisa Trichoderma In vivo In vivoIn vitro In vitro Jamur mikorisa Induksi Induksi Tanaman

Tanaman • fitoaleksin_{• kitinase}

• β-1, 3-glukanase Interaksi Interaksi

METODE

Patogen Patogen

(6)

mikorisa Ekto

Induksi Tanaman

Metabolit sekunder

* fitoaleksin

* Pathogenesis – Related Protein

Pembentukan

mikorisa

Interaksi

ß- 1,3-glukanase

Tahun 2

(7)

mikorisa Ekto

Induksi tanaman

Metabolit sekunder

* Pathogenesis – Related Protein

Pembentukan

mikorisa

Interaksi

kitinase

Trichoderma

Waktu

Patogen damping off

Tahun 3

(8)

Metode Khusus fitoaleksin

Akar (10 gr) + etanol 70% (50ml), rendam 24 jam

Evaporasi (40o_{) sampai ¼ volum semula}

Larutan fitoaleksin kasar dlm etanol Materi kering + etanol

Evaporasi (40oC)

Ekstraksi dengan petrolium ether Saring

(9)

Metode Khusus 1- 3 β glukanase

Karakterisasi β-1,3-Glukanase

• SDS-PAGE mengacu pada metode Laemli (1970)

• Karakterisasi pH optimal aktifitas enzim mengacu pada metode Aono et al. (1995) dan Fontaine et al. (1997) dengan

modifikasi.

• Karakterisasi suhu optimal aktifitas enzim.

Ekstraksi Pathogenesis-Related Protein

• Ekstraksi menggunakan metode Vannini et al. (1999). • Dialisis menggunakan metode Colligan et al.(1996).

Isolasi β-1,3-Glukanase

Kromatografi gel filtrasi mengacu pada metode Colligan et al. (1996) dan Harjono (2000) dengan modifikasi

(10)

Inokulasi

mikorisa

pd tusam

Akar dipotong,

dimsukkan dlm –80 C

Panen, 4,6,8,

minggu

Ekstraksi

crude protein

Aktivitas kitinase.

Deteksi isoform kitinase

Pengendapan am. sulfat

Dialisis, pemekatan PEG

Kromatografi gel filtrasi

sephacril S-300 HR

Karakterisasi, BM, pH, suhu

optimum, aktifitas antifungal

kitinase pada R. solani &

Fusarium sp.

(11)

Uji in vivo antara jamur patogen, agen biokontrol dan jamur pembentuk mikorisa

a. Inokulasi

R.solani

dan

Fusarium

sp. 15 hari sebelum semai

ditanam

b. Perlakuan :

Faktor A

- Tanah tidak bermikorisa (M₀)

- Tanah bermikorisa (M₁)

Faktor B

- Tanpa patogen (P₀)

- Dengan inokulasi

R. solani

(P₁)

- Dengan inokulasi

Fusarium

sp. (P₂)

Faktor C

- Tanpa

T. reesei

(T₀)

-

T. reesei

bersama waktu penanaman semai (T₁)

- 7 hari setelah penanaman semai - 14 hari setelah penanaman semai

c. Pengamatan

- Persen kematian semai - Persen infeksi mikorisa

(12)

Hasil tahun pertama

0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Waktu (hari) Jum la h u ju ng a ka r Kontrol T1 T13 T27 W-14 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Waktu (hari) Ju m la h uj un g a ka r Kontrol T1 T13 T27 W0 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Waktu (hari) Ju m la h u ju ng a ka r Kontrol T1 T13 T27 W+14

Perkembangan jumlah ujung akar semai tusam pada media tanpa inokulasi jamur mikorisa ekto

W-14 : Introduksi Trichoderma 14 hari sebelum penambahan tanah steril.

W0 : Introduksi Trichoderma bersama-sama dengan penambahan tanah steril.

W+14 : Introduksi Trichoderma 14 hari setelah penambahan tanah steril.

(13)

Perkembangan jumlah ujung akar semai tusam pada media yang diinokulasi jamur mikorisa ekto

W-14 : Introduksi Trichoderma 14 hari sebelum penambahan tanah steril.

W0 : Introduksi Trichoderma bersama-sama dengan penambahan tanah steril.

W+14 : Introduksi Trichoderma 14 hari setelah penambahan tanah steril. 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Waktu (hari) Ju m la h u ju ng a ka r Kontrol T1 T13 T27 W-14 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Waktu (hari) Ju m la h uj un g ak ar Kontrol T1 T13 T27 W0 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Waktu (hari) Ju m la h u ju ng a ka r Kontrol T1 T13 T27 W+14

(14)

Aktifitas fitoaleksin thd persentase perkecambahan spora

Fusarium

sp

0,00 0,00 100 43,33 52,66 80 56,33 66,33 40 93,66 72,67 10 71,33 74,33 2 94,00 88,33 0 8 minggu 0,00 0,00 100 1,00 2,00 80 26,33 47,66 40 56,33 50,00 10 46,67 48,00 2 86,67 77,33 0 6 minggu 0,00 0,00 100 0,67 0,00 80 5,33 66,67 40 66,33 51,33 10 56,00 58,00 2 84,67 85,00 0 4 minggu 0,00 2,67 100 1,00 0,67 80 17,33 2,67 40 26,67 32,33 10 46,70 49,00 2 71,00 63,67 0 Pohon Akar bermikorisa Akar tidak bermikorisa

Konsentrasi (%) Tusam

Keterangan :

a) tiap perlakuan sumber ekstrak dan konsentrasi diukur 300 spora b) konsentrasi 2 % hanya dari etanol

(15)

0,00 0,00 100 1,50 1,91 80 1,65 2,80 40 4,49 0,5 10 1,63 1,65 2 3,73 3,51 0 8 minggu 0,00 0,00 100 0,39 0,61 80 0,99 0,71 40 1,60 2,09 10 1,66 1,77 2 3,62 3,42 0 6 minggu 0,00 0,00 100 0,34 0,00 80 0,35 1,96 40 2,79 2,04 10 1,71 1,79 2 3,71 3,47 0 4 minggu 0,00 0,00 100 0,34 0,30 80 0,48 0,34 40 0,90 0,95 10 1,75 1,55 2 3,12 3,38 0 Pohon Akar bermikorisa Akar tidak bermikorisa

Konsentrasi (%) Tusam

Keterangan :

a) tiap perlakuan sumber ekstrak dan konsentrasi diukur 20 spora b) konsentrasi 2 % hanya dari etanol

(16)

Aktivitas

_β

-1,3-glukanase

dari

crude protein

No. Sampel Kadar Protein (_l) µg/µ Aktivitas Enzim (µU) Aktivitas spesifik (µU/µg)

1 TM 0.2764 259,4202 55,3645

2 M4M 0,1856 333,8082 93,6874

3 M6M 0,3563 1349,7078 378,8122

4 M8M 0,3948 675,0547 170,9865

5 EP 0,3398 1831,6029 539,0238

Keterangan : TM : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam tanpa mikorisa ; M4M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 4 minggu; M6M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 6 minggu; M8M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 8 minggu; EP : crude protein hasil ekstraksi dari akar tusam dewasa bermikorisa.

(17)

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 0 2 4 6 8 10 12 14

OD 280 nm fraksi Aktivitas enzim pada tiap fraksi

Isolasi

(18)

Aktivitas

_β

-1,3-glukanase dari hasil kromatografi

Keterangan : GFCA I = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak pertama aktivitas enzim; GFCA II = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak kedua aktivitas enzim; GFCA III = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak ketiga aktivitas enzim.

17,5283

30,3789

9,4968

0 5 10 15 20 25 30 35 Aktivitas Enzim (_µU)

GFCA I GFCA II GFCA III

Hasil Kromatografi

(19)

0,0551 0,1818 0,1542 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 Kadar Protein (µg/µl)

31,8119 16,7101 6,1587 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 Aktivitas spesifik (µg/µU)

Aktivitas

β

-1,3-glukanase dari hasil kromatografi

Keterangan : GFCA I = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak pertama aktivitas enzim; GFCA II = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak kedua aktivitas enzim; GFCA III = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak ketiga aktivitas enzim.

(20)

Karakterisasi

_β

-1,3-glukanase hasil isolasi

y = -0,0274x + 5,132 R2 = 0,9418 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 0 10 20 30 40 50 Mobilitas Relatif (mm) lo g 1 0 Be ra t m o le k u l p ro te in s ta n d a rt Marker GFC Results peak 2 Linear (Marker)

Hasil interpolasi kurva berat molekul protein standart menunjukkan bahwa β -1,3-glukanase hasil isolasi memiliki berat molekul 15 kD.

(21)

Karakterisasi

_β

-1,3-glukanase hasil isolasi

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 10 20 30 40 50 60 Temperature (oC ) E n zy m e A ct iv it y (µ U ) Temperature Poly. (Temperature)

Hasil karakterisasi pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa β -1,3-glukanase hasil isolasi memiliki kisaran suhu yang sempit untuk aktivitasnya. Suhu optimal untuk aktivitas enzim tersebut adalah 40o_{C .}

(22)

Karakterisasi

β

-1,3-glukanase hasil isolasi

0 2 4 6 8 10 12 14 16 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH E n zy m e A c ti v ity (µ U ) pH Poly. (pH)

Hasil karakterisasi pengaruh pH terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa β -1,3-glukanase hasil isolasi memiliki aktivitas optimal pada pH cenderung asam. pH optimal untuk aktivitas enzim tersebut adalah 6 .

(23)

Karakterisasi

_β

-1,3-glukanase hasil isolasi

No. Sampel Persentase perkecambahan Fusarium sp.

1 Kontrol 68%

2 GLUC15 14,54%

3 M6M 17,32%

4 EP 12,86%

Persentase perkecambahan konidia Fusarium sp. yang diinkubasikan dalam protein dari akar semai tusam (P. merkusii) yang berasosiasi dengan jamur pembentuk mikorisa ekto. GLUC15 = β

-1,3-glukanase hasil isolasi dari akar semai tusam (P. merkusii); M6M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 6 minggu; EP : crude protein hasil ekstraksi dari akar tusam dewasa

bermikorisa. Penghitungan persentase dilakukan dengan menjumlah konidia yang berkecambah dan tidak berkecambah dari tiga bidang pandang mikroskop dan dilakukan dengan dua kali perulangan.

(24)

19,86 17,86 23,53 18,18 P₂ 24,70 9,52 31,25 33,33 P₁ 27,62 11,11 21,74 50,00 P₀ Tanah bermikorisa 5,41 7,14 0,00 9,09 P₂ 4,60 0,00 9,09 4,70 P₁ 3,81 0,00 4,76 6,67 P₀ Tanah tidak bermikorisa 3 2 1 Rerata Ulangan Sumber variasi

Keterangan : P₀ : tanpa patogen

P₁ : patogen Fusarium sp. P₂ : patogen Rhizoctonia sp.

Rerata persentase infeksi jamur mikorisa semai tusam (

P. merkusii

)

(25)

Aktivitas spesifik kitinase

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 4M 6M 8M Sampel A kt iv ita s sp es ifi k ( un it/m g) mikorisa

tidak bermikorisa 4 M : 4 minggu

6 M : 6 minggu 8 M : 8 minggu

Aktivitas spesifik kitinase dari crude protein semai tusam bermikorisa dan tidak bermikorisa umur 4, 6 dan 8 minggu. Aktivitas kitinase diukur dengan menginkubasikan substrat–enzim selama 30 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan DNS dan direbus selama 15 menit. Aktivitas kitinase diukur pada absorbansi 540, visibel.

(26)

Persentasi tingkat kejenuhan Ammonium Sulfat

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 30 50 70

Tingkat kejenuhan ammonium sulfat (%)

A k ti v it s s p e s if ik ki ti n a s e (U n it /m g )

Perbandingan aktivitas spesifik kitinase dengan tingkat kejenuhan 30, 50, 70 %.

(27)

52,158 4,350 3,568 0,000553 0, 155 Sephacril S-300 HR 85,47 1,422 1,166 0,000906 0,777 Pengendapan amonium sulfat dan dialisis 100 1 0,819 0,00106 1,293 Crude protein Recovery (%) Tingkat pemurnian Aktivitas spesifik (unit.mg-1₎ Aktivitas kitinase (unit) Protein total (µ g) Langkah pemurnian

Rekapitulasi pemisahan kitinase dari

50

g akar semai

(28)

Suhu Optimal 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 10 20 30 40 50 Suhu C A kt ivi ta s sp e si fi k ki ti n a se (U n it )

Nilai suhu optimal dicapai pada suhu 300 _{C. Konsentrasi protein yang}

digunakan untuk masing – masing pengamatan adalah 0,156 µg ml-1_.

Data merupakan hasil rata – rata dua ulangan percobaan

(29)

pH optimal

pH Optimum 0 ,0 3 0 ,0 4 0 ,0 5 0 ,0 6 0 ,0 7 0 ,0 8 0 ,0 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH A k lt iv it a s s p e s if ik k it in a s e (U n it )

Nilai pH optimal dicapai pada pH 5. Konsentrasi protein yang

digunakan untuk masing–masing pengamatan adalah 0,156 µg ml-1_.

(30)

Ringkasan hasil

• Akar tusam mengeluarkan senyawa fitoaleksin,

_β

-1,3-glukanase dan kitinase dengan aktivitas yang lebih tinggi pada

akar bermikorisa dibandingkan dengan akar tidak bermikorisa.

• Isolat enzim

β

-1,3-glukanase memiliki berat molekul 15 kD,

kurang tahan terhadap pemanasan dan bekerja optimal pada

pH cenderung asam. Sedangkan enzim kitinase memiliki berat

molekul 52 kDa, aktivitas optimum kitinase pada pH 5 dan suhu

30

0

C. • Senyawa fitoaleksin,

_β

-1,3-glukanase dan kitinase yang

berasosiasi dengan jamur pembentuk mikorisa ekto memiliki

aktivitas antifungal.

• Inokulasi jamur mikorisa dan introduksi T.reesei kedalam

perakaran semai tusam dapat menghambat perkembangan

patogen penyebab rebah semai (R. solani dan Fusarium sp.).

Perlakuan ini tidak menimbulkan hambatan pembentukan dan

perkembangan mikorisa apabila waktu aplikasi Trichoderma

tepat.

• Pengendalian patogen penyebab penyakit rebah semai

diperoleh dari inokulasi T.reesei pra tanam dan selanjutnya

dapat meningkatkan perkembangan mikorisa.

(31)

Kesimpulan

Inokulasi jamur pembentuk mikorisa

ekto sangat berpotensi untuk

meningkatkan ekspresi enzim yang

berperan pada ketahanan semai tusam

(32)

Publikasi

Naemah, D., S. M. Widyastuti dan Sumardi. 2004. Pengaruh waktu aplikasi

Trichoderma terhadap perkembangan mikoriza pada akar Pinus

merkusii Jungh. et de Vriese. Agrosains BPPS. 16(2):173-178.

Tektonia, R., S. M. Widyastuti dan Sumardi. 2004. Pengaruh inokulasi

mikoriza terhadap perkembangan penyakit rebah semai (Fusarium

sp.) pada semai Pinus merkusii Jung. et de Vriese. Jurnal Fitopatologi.(accepted)

Anggoro, M.D., S.M. Widyastuti dan S. Margino. 2005. Isolasi dan

karakterisasi _β-1,3-glukanase akar semai tusam (Pinus merkusii

jungh. et de vriese) yang berasosiasi dengan jamur pembentuk mikorisa ekto. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia.(accepted)

Handayani, A., S.M. Widyastuti dan S. Margino. 2005. Isolasi dan

karakterisasi kitinase akar tusam (Pinus merkusii Jungh. et de Vriese) yang bersimbiosis dengan jamur mikoriza-ekto. Jurnal

Perlindungan Tanaman Indonesia.(accepted)

Suryantini, R., SM. Widyastuti dan Sumardi. 2005. Pengaruh Waktu

Inokulasi Trichoderma reesei terhadap Patogenisitas Jamur Lanas

(damping-off) dan Perkembangan Mikorisa pada Semai Tusam

(33)

Widyaningsih, S., S.M. Widyastuti dan Sumardi. 2005. Produksi fitoaleksin pada tusam (pinus merkusii jungh. et de vriese) sebagai respon infeksi jamur mikoriza. BIOTA. (submitted)

Widyastuti, S.M., A. Handayani, Harjono dan Sumardi. 2005. Aktivitas Anti Jamur Kitinase dan

β-1,3-glukanase

Akar Semai Tusam (Pinus

merkusii Jungh. et de Vriese) yang Berasosiasi dengan Jamur

Pembentuk Mikorisa Ekto. Jurnal Perlindungan Tanaman. (submitted)

Widyastuti, S. M., Sumardi, Harjono dan D. Naemah. 2005. Uji aktivitas biokontrol Trichoderma formulasi hasil reisolasi dari media semai tusam setelah 5 bulan aplikasi secara in vitro. Agr UMY.

(submitted)

Widyastuti, S. M., Sumardi dan R. Tektonia. 2005. Uji awal aktivitas

senyawa metabolit anti patogen akar tusam (Pinus merkusii Jung.

et de Vriese.) akibat pengimbasan interaksi mikoriza ekto

terhadap Fusarium sp. Jurnal Perlindungan Tanaman

Indonesia.(submitted)