ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN MAWAR MERAH (Rosa hybrida L.)
SKRIPSI
RANDY HALASSON SINAGA 120802030
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN MAWAR MERAH (Rosa hybrida L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains
RANDY HALASSON SINAGA 120802030
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN 2017
PERSETUJUAN
Judul : Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Daun Tumbuhan Mawar Merah (Rosa hybrida L.)
Kategori : Skripsi
Nama Mahasiswa : Randy Halasson Sinaga Nomor Induk Mahasiswa : 120802030
Program Studi : Sarjana (S1) Kimia
Departemen : Kimia
Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara
Disetujui di
Medan, April 2017 Komisi Pembimbing :
Pembimbing 2 Pembimbing 1
Dr. Sovia Lenny, M.Si Drs. Albert Pasaribu, M.Sc.
NIP: 1975 1018 2000 032001 NIP: 1964 08101 1991 031002
Diketahui/ Disetujui oleh
Departemen Kimia FMIPA USU Ketua,
Dr. Cut Fatimah Zuhra, M.Si NIP: 197404051999032001
PERNYATAAN
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN MAWAR MERAH (Rosa hybrida L.)
SKRIPSI
Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.
Medan, April 2017
RANDY HALASSON SINAGA 120802030
PENGHARGAAN
Bersyukur pada Bapa di surga atas Kasih Setia-Nya. Sungguh merupakan anugerah- Nya dimana penulis dapat menyelesaikan skripsi yang menjadi Tugas akhir program studi S-1 Kimia dengan judul isolasi senyawa flovonoida dari daun tumbuhan mawar merah ini tepat pada waktu-Nya.
Kedua orang tua penulis Sabar Sinaga dan ibu Ruskaini br. Sianipar, saudara penulis Ruslita Nuriani Sinaga, Rolando Sinaga, Roseilda Regita Sinaga, yang terus memberi doa kepada penulis. Bersyukur buat orang-orang yang Tuhan taruhkan untuk membantu penulis menyelesaikan skripsi ini, penulis juga mengucapkan terimakasih kepada :
1. Bapak Drs. Albert Pasaribu, M.Sc dan Dr. Sovia Lenny S.Si , M.Si, selaku dosen pembimbing skripsi penulis.
2. Ibu Dr. Cut Fatimah Zuhra, M.Si selaku ketua Jurusan Departemen Kimia FMIPA USU sekaligus dosen PA penulis serta staf pengajar dan staf struktural Departemen KIMIA FMIPA USU.
3. Bapak Lamek Marpaung, M.Phil, Ph.D selaku Kepala Laboratorium Kimia Bahan Alam tempat penulis mengerjakan Penelitian. Serta Asisten
Laboratorium dimana sangat membantu dalam proses penelitian.
4. Bapak/Ibu Dosen FMIPA USU bidang ilmu organik, anorganik,Polimer, kimia-fisika, Ilmu dasar, analitik, kimia bahan alam.
5. Kakak Rohaniku Naomi F. Sitorus S.Si, FriCoBenMiRa ERCOLE
Geo,Ranyco, Ruben – Adriell Benedict Novri, Meryana, Ida, Cindy, Thedy – Selsilira Janeetta Lina, Siska, sella.
6. Sahabat Berdikari dan KTB SMP – SMA kabanjahe.
7. Pelayanan UKM KMK USU UP MIPA koordinasi 2015 - 2016. Komisi Pembinaan se-USU dan Komisi Kelompok Kecil UP MIPA 2015, 2016 Dahlia, Rosalia, Grace, Tumiar, k’ Nova, K’Winda, Ardi Ginting, Frans Nainggolan (FT sipil 2012) dll.
8. Kakak alumni, panitia, teman dan adik stambuk Kimia FMIPA USU.
9. Dan kepada semua pihak yang membantu penulis secara langsung maupun tidak yang tidak bias di sebutkan namanya, penulis mengucapkan terima kasih.
Tuhan Yesus Mengasihi Kita semua.
Penulis
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN MAWAR MERAH (Rosa hybrida L.)
ABSTRAK
Isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan mawar merah (Rosa hybrida L.) dilakukan dengan ekstraksi maserasi menggunakan pelarut metanol kemudian disaring dan dipekatkan. Ekstrak pekat metanol diekstraksi menggunakan etil asetat kemudian disaring dan dipekatkan. Ekstrak pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi dengan n-heksana. Lapisan metanol dipekatkan dan dihidrolisa dengan HCl 6%, kemudian filtrat diekstraksi partisi dengan kloroform.
Ekstrak pekat kloroform kemudian dianalisis KLT, lalu dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan (90:10) v/v, (80:20) v/v,(70:30) v/v dan (60:40) v/v (50:50) v/v. Senyawa yang diperoleh dimurnikan dengan cara dikristalisasi dan diperoleh pasta berwarna kuning kecoklatan sebanyak 6.9 mg dan Rf=0,4. Selanjutnya diidentifikasi dengan analisis spektroskopi dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Visible, Inframerah (FT-IR) dan Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR). Dari hasil interpretasi analisis data spektroskopi diduga bahwa senyawa flavonoida yang diisolasi adalah golongan isoflavon.
Kata kunci : Daun mawar merah, Rosa hybrida L., Flavonoida, Isoflavon
ISOLATION OF FLAVONOID COMPOUND FROM LEAVES OF RED ROSES (Rose hybrida L.) PLANTS
ABSTRACT
Isolation of flavonoida compound from leaves of red roses (Rosa hybrida L.) was performed by extraction maceration using methanol solvent then filtered and concentrated. Concentrated methanol extract was extracted using ethyl acetate then filtered and concentrated. Concentrated ethyl acetate extract was diluted with methanol and extracted partition with n-hexane. Methanol layer was concentrated and hydrolyzed with HCl 6%, then the filtrate was extracted partition with chloroform.
Concentrated chloroform extract was then analyzed TLC, then separated by column chromatography with silica gel stationary phase and a mobile phase n-hexane: ethyl acetate in the ratio (90:10) v / v, (80:20) v / v, (70:30 ) v / v and (60:40) v / v (50:50) v / v. Compound derived purified by crystallized and obtained brownish yellow pasta as much as 6.9 mg and Rf = 0.4. Furthermore identified by spectroscopic analysis by using UV-Visible spectrophotometer, Infrared (FT-IR) and Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR). From the interpretation of spectroscopic data analysis suggested that flavonoids isolated compounds are a class of isoflavones.
Keywords : leaves of red roses, rosa hybrida L., Flavonoid, Isoflavone
DAFTAR ISI
Halaman
Persetujuan ii
Pernyataan iii
Penghargaan iv
Abstrak v
Abstract vi
Daftar isi vii
Daftar Tabel ix
Daftar Gambar x
Daftar Lampiran xi
BAB 1 Pendahuluan 1.1. Latar Belakang 1
1.2. Permasalahan 2
1.3. Tujuan Penelitian 3
1.4. Manfaat Penelitian 3
1.5. Lokasi Penelitian 3
1.6. Metode Penelitian 3
BAB 2 Tinjauan Pustaka 5
2.1. Tumbuhan Mawar Merah 5
2.2. Senyawa Organik Bahan Alam 6
2.3. Senyawa Flavonoid 7
2.3.1. Klasifikasi Senyawa Flavonoida 8
2.3.2. Sifat Kelarutan Flavonoida 15
2.3.3. Bosintesis Flavonoid 15
2.4. Skrinning Fitokimia 18
2.5. Teknik Pemisahan 18
2.5.1. Ekstraksi 19
2.5.2. Partisi 19
2.5.3. Kromatografi 20
2.5.3.1. Kromatografi Lapis Tipis 20
2.5.3.2. Kromatografi Kolom 22
2.5.4. Hidrolisis 22
2.6. Teknik Spektroskopi 23
2.6.1. Spektrofotometri UV-Visible 23
2.6.2. Spektrometri Infra Merah (FT-IR) 24
2.6.3. Spektrometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1 H-NMR) 25
BAB 3 Bahan dan Metodologi Penelitian 27
3.1. Alat-alat 27
3.2. Bahan 28
3.3. Prosedur Penelitian 28
3.3.1. Penyediaan Sampel 28
3.3.2. Uji Pendahuluan 29
3.3.3. Ekstraksi 30
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis 31
3.3.5. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom 31
3.3.6. Pemurnian 32
3.3.7. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis 32
Tipis 3.3.8. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 32
3.3.8.1. Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible 32
3.3.8.2. Identifikasi dengan Spektofotometer Inframerah 33
( FT-IR ) 3.3.8.3. Identifikasi dengan spekrometer Resonansi 33
Magnetik Inti Proton (1H-NMR) 3.4. Bagan Skrining Fitokimia 34
3.5. Bagan Penelitian 36
BAB 4 Hasil dan Pembahasan 38
4.1. Hasil Penelitian 38
4.2. Pembahasan 41
BAB 5 Kesimpulan dan Saran 40
5.1. Kesimpulan 40
5.2. Saran 40
Daftar Pustaka 41
DAFTAR TABEL
Nomor Judul Halaman Tabel
2.1 Sifat dari Golongan-golongan Flavonoida Menurut Harborne 14 2.2 Ciri Spektrum UV Golongan Flavonoida Utama 24 2.3 Frekuensi Vibrasi berbagai ikatan menurut Herbert 24
DAFTAR GAMBAR
Nomor Judul Halaman Gambar
2.1 Struktur Antosianin 10
2.2 Struktur Flavonol 11
2.3 Struktur Flavon 11
2.4 Struktur Khalkon 12
2.5 Struktur Auron 12
2.6 Biosintesa Flavonoid 16
4.1 Spektrum UV-VISIBLE Senyawa Hasil Isolasi 37
4.2 Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi 38
4.3 Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi 39 4.4 Struktur Isoflavonoida
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Judul Halaman Lampiran
Lampiran 1 Gambar daun tumbuhan mawar merah 46
(Rosa Hybrida L)
Lampiran 2 Determinasi Tumbuhan mawar merah 47
Lampiran 3 Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak pekat 48 Kloroform Daun tumbuhan mawar merah
sebelum kromatografi kolom
Lampiran 4 Kromatogram Lapis Tipis Senyawa isolasi 49 Setelah penggabungan fraksi
Lampiran 5 Kromatogram Lapis Tipis senyawa hasil isolasi 50 Uji kemurnian
Lampiran 6 Spektrum Ultraviolet-Visible Senyawa Flavonoid 51 Lampiran 7 Ekspansi H-NMR
1
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Flavonoida merupakan kandungan khas tumbuhan hijau, dan terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nektar, bunga, buah, dan biji (Markham, 1988). Senyawa flavonoida adalah senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzene yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linier yang terdiri dari tiga atom karbon. (Manitto, 1981).
Flavonoida sebagai kelompok senyawa fenolik ditemukan dalam tanaman dan memiliki banyak kegunaan, dan selama bertahun-tahun telah banyak peneliti mencari tahu manfaat flavonoida dan pengembangan terutama berkaitan dengan kesehatan manusia seperti pengembangan obat kanker sampai penyakit jantung koroner (Eastwood, 1999). Flavonoida banyak terdapat dalam daun atau di sel epidermis dimana memiliki peran dalam kelangsungan hidup fisiologis tanaman. Senyawa ini berkontribusi pada ketahanan terhadap penyakit tanaman (Harborne, 2000).
Tanaman mawar memiliki daun majemuk dengan 3 atau 5 berselang dan bersirip ganjil, tinggi tanaman mawar ini antara 0.3 sampai 0.5 Meter (Kartapraja,1995). Manfaat bunga dan daun mawar mengasilkan aroma khas dan telah banyak dimanfaatkan dalam industri parfum, bentuk parfum berupa minyak alami, kandungan minyak esensial dari tumbuhan ini yang memiliki lebih 400 zat volatile telah berhasil hasil diidentifikasi, beberapa negara timur tengah telah memproduksi dalam skala besar dalam bentuk minyak esensial seperti Turki, Bulgaria, dan Rusia (Schulz, 1980).
Li dalam jurnalnya tahun 2009 berjudul Anthocyanin Compositions and Biological Activities From the Red Petals of Korean Edible Rose (Rosa hybrida cv.
Noblered) dalam ekstrak metanol asam mahkota bunga mawar merah dengan konsentrasi 50 µg / mL terdapat senyawa antosianin dengan aktivitas biologis yaitu sebagai antioksidan, anti kanker dan antialergi. Lopes et al. pada 2010 dalam penelitiannya juga menunjukkan aktivitas antioksidan oleh pigmen antosianin bunga mawar merah dan dapat menyembuhkan beberapa penyakit, seperti diabetes mellitus (Miyake et al., 1998).
Hal yang menarik dari hasil penelitian Lubis (2015) yang telah mengindentifikasi senyawa flavonol dari bunga tumbuhan mawar putih dan senyawa dihidroflavonol dari bunga tumbuhan mawar merah. (Hutauruk, 2016) terlihat perbedaan golongan flavonoida yang terkandung pada tumbuhan mawar dengan Family yang sama hanya berbeda spesies memperlihatkan keberagaman flavonoid yang terkandung.
Hasil skrining sampel dari daun tumbuhan mawar merah dengan perekasi FeCl3 5% menunjukkan ektrak metanol positif fenolik dan ektrak etil asetat menunjukkan positif flavonoida.
Berdasarkan informasi literatur, peneliti terdahulu dan hasil skrining sehingga peneliti tertarik untuk mengisolasi senyawa flavonoid dari daun Tumbuhan Mawar Merah sehingga dapat memberikan informasi perbandingkan golongan flavonoid yang terkandung dalam daun mawar merah dengan peneliti terdahulu yang telah mengindentifikasi bunga mawar putih.
1.2 Permasalahan
Permasalahan dalam penelitian ini adalah golongan apakah flavonoid yang terkandung dalam daun mawar merah.
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi senyawa flavonoid dari daun mawar merah dan menentukan golongan flavonoid hasil isolasi dengan analisis Spektrofotometer UV-Vis, FT-IR, dan Spektrofotometer H-NMR.
1.4 Manfaat Penelitian
Memberikan sumber informasi ilmiah pada bidang Kimia Bahan Alam Hayati khususnya tentang golongan senyawa flavonoid yang terkandung dalam daun mawar merah.
1.5 Lokasi Penelitian
1.Tempat Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan yaitu daun tumbuhan mawar merah yang diperoleh dari kota Berastagi, Kabupaten Karo, Sumatera Utara.
2. Tempat Melakukan Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam hayati, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3. Lokasi Identifikasi Senyawa
Identifikasi senyawa hasil isolasi yang meliputi analisa Spektrofotometer UV- Vis, FT-IR dan Spektrometer 1H-NMR yang akan dilakukan di LIPI, Komplek PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang.
1.6 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan metode isolasi, Tahap awal daun mawar merah dijadikan dalam bentuk serbuk kering kemudian di uji skrining fitokimia, yaitu
Tahap isolasi yang dilakukan : 1. Ekstraksi Maserasi
2. Pemisahan Tanin 3. Ekstraksi Partisi 4. Hidrolisa
5. Analisis Kromatografi Lapis Tipis 6. Analisis Kromatografi Kolom 7. Analisis Kristal Hasil Isolasi
a). Analisis Kromatografi Lapis Tipis b). Pengukuran Titik Lebur
c). Identifikasi dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, Infra Merah (FT-IR) dan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR).
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Mawar Merah
Mawar berasal dari Asia Tengah, Amerika, Eropa dan Afrika. Mawar mempunyai 125 spesies, 95 spesies berasal dari Asia, 18 spesies berasal dari Amerika dan sisanya dari Eropa dan Afrika (Kartapraja, 1995). Tumbuhan mawar sangat populer dan sangat favorit hal ini mendorong perkembangan kebun tanaman hias ini, siklus pertumbuhan yang cepat yaitu 2-3 bulan dengan kualitas cahaya cukup akan mengasilkan warna baik dan ukuran bunga dan bentuknya, daun serta batang yang kuat (Chaanin, 2003).
Tumbuhan mawar merah memiliki akar berbentuk serabut yang memanjang, dengan warna coklat muda dan coklat gelap fungsi akar ini sendiri sebagai penyerap unsur hara dan air yang terkandung dalam tanah juga sebagai penyokong batang tanaman, sedang batangnya berbentuk bulat panjang dan bercabang dan yang khas dari batang tanaman mawar adalah tumbuhnya duri dengan warna batang abu-abu, kecoklatan dan hijau lumut.
Daun mawar berukuran kecil dengan ukuran sekitar 2 sampai 3 cm, memiliku 5 sampai 9 anak daun pada satu cabang. Bentuk daunnya sendiri agak runcing dan bergerigi. Bunga dan akar dalam kondisi kering serta daun dalam kondisi segar dimanfaatkan dalam mengobati beberapa penyakit, misalnya batuk kering, campak, haid tidak teratur, keputihan dan penurunan bagian uterus setelah melahirkan (Hariana, 2013).
Sistematika tumbuhan mawar merah Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta Klass : Dycotyledoneae Ordo : Rosales
Famili : Rosaceae Genus : Rosa
Spesies : Rosa hybrida L.
Nama Lokal : Bunga Mawar Merah (Herbarium Medanese, 2016)
2.2 Senyawa Organik Bahan Alam
Aspek kimia dalam tanaman dan penyelidikan tentang kehidupan tanaman merupakan ruang lingkup yang dikenal fitokimia, dimana kajian ilmu ini meliputi uraian tentang isolasi dan konstitusi senyawa kimia dalam tanaman, membandingkan struktur senyawa kimia tanaman hingga penggolongan senyawa kimia yang ada di alam, yang terakhir adanya perbandingan komposisi senyawa kimia dari bermacam-macam jenis tanaman atau penelitian untul pengembangan senyawa kimia dalam tanaman. Khas fitokimia dapat terlihat dari peran aktif dalam penelitian obat obatan yang lebih lanjut dalam dunia farmasi.
Senyawa kimia bermolekul besar merupakan bagian utama dalam organ tanaman kering, senyawa kimia tanaman yang jumlahnya paling banyak adalah senyawa kimia bermolekul kecil dari kelompok yang disebut terakhir dengan penyebaran terbatas; selanjutnya kelompok ini disebut metabolit sekunder. Senyawa kimia yang telah pernah diidentifikasi telah banyak dikenal, dan telah banyak pengelompokkannya, mulai dari sifat khas yang dimiliki antara lain warna, rasa, bau, pH hingga kelarutannya.
Minyak atsiri merupakan produk identifikasi kimia dari tanaman yang memiliki sifat khas memiliki aroma khas, dapat dipisahkan dari senyawa kimia tanaman lain. Berbeda hal dengan alkaloid, senyawa ini bersifat basa dan
mengandung unsur N. Suatu metoda yang mudah memisahkan senyawa kimia tanaman keseluruhan zat pahit dalam sari dapat menjadi zat yang dapat dikristalkan, hasil metoda ini disebut zat pahit. Lain hal dengan zat warna, yang jumlahnya dalam tanaman sangat banyak, piqmen tanaman mempunyai struktur kimia yang beraneka ragam.
Pengendapan protein dari larutan dengan membentuk senyawa tidak larut disebut senyawa tannin (zat samak). Zat samak mempunyai arti penting dalam berbagai industri. Disamping protein, hasil penelitian menunjukkan bahwa sari tanaman pada umumnya mengandung senyawa yang bersifat alkohol atau fenol yang cukup larut. (Robinson, 1995)
2.3 Senyawa Flavonoid
Markham (1988), mengemukakan bahwa penyebaran senyawa flavonoid pada tumbuhan meliputi bagian daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga, buah, dan biji.
Senyawa ini merupakan salah satu kelompok fenolik yang paling banyak menarik perhatian peneliti dari metabolit sekunder yang terdapat pada tumbuhan tingkat tinggi.
Kandungan antosianin yang merupakan subklas flavonoid memberikan warna merah, oranye, biru, dan ungu pada daun, bunga, dan buah-buahan, sebagai pigmen telah memfasilitasi pengujian hipotesis “Mendel's law and transposable elements” pigmen flavonoid dari upaya untuk mengubah warna bunga oleh rekayasa genetika (Tanaka et al., 1998)
Flavonoid menjadi kelompok sangat besar dari produk alami, banyak terdapat pada jaringan tanaman di dalam sel atau pada permukaan organ tanaman. Struktur kimia dari kelas ini didasarkan pada C6-C3-C6. Flavonoid dapat dimodifikasi oleh hidroksil, metoksi, atau kelompok O-glikosilasi hidroksil serta C-glikosilasi ke atom karbon dari kerangka flavonoid. (Williams, 2000)
Flavonoida berasal dari kelompok senyawa yang paling umum yaitu flavon.
Suatu jembatan oksigen terdapat diantara cincin A dalam kedudukan orto dan atom karbon benzil yang terletak di sebelah cincin B. Senyawa heterosiklik ini pada tingkat oksidasi yang berbeda terdapat dalam kebanyakan tumbuhan. Flavon adalah bentuk yang mempunyai cincin C dengan tingkat oksidasi yang paling rendah dan dianggap sebagai struktur induk dalam nomenklatur kelompok senyawa ini (Manitto, 1992).
Flavonoida umumnya terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoida yang mana pun mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida.. (Harborne, 1996).
Pada tumbuhan, flavonoida memiliki beberapa fungsi termasuk menarik serangga untuk proses penyerbukan dan penyebaran benih juga dapat bersifat protector system pertahanan, misalnya sebagai pertahanan UV-B dan pitoaleksin, serta penghubung antara tanaman dan mikroba pengatur transportasi auksin.
(Winkel,2001) Dalam tubuh manusia, flavonoida sangat bermanfaat dalam makanan oleh Karena senyawa fenolik merupakan senyawa dengan sifat antioksidan kuat, beberapa temuan bahwa senyawa bermanfaat mengobati gangguan sirkulasi perifer, menurunkan tekanan darah dan meningkatkan aquaresis. Banyak juga obat-obat mengandung flavonoid yang dipasarkan diberbagai negara sebagai obat anti- inflamasi, antispasmodik, antialergi dan antivirus. Oleh temuan ini, dugaan bahwa makanan yang mengandung senyawa flavonoid dapat mengobati penyakit, bahkan penyakit berat seperti kanker hingga penyakit jantung (Heinrich et al, 2005).
2.3.1 Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Flavonoid terdapat dalam berbagai bentuk struktur. Keragaman struktur flavonoid ini disebabkan karena perbedaan tahap modifikasi lanjutan dari struktur dasar flavonoid, antara lain:
1. Flavonoid O-glikosida.
Flavonoid biasanya terdapat sebagai flavonoid O-glikosida, pada senyawa tersebut satu gugus hidroksi flavonoid (atau lebih) terikat pada satu gula (atau lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam.
Pengaruh glikosilasi meyebabkan flavonoid menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air (cairan). Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat, walaupun galaktosa, ramnosa, xilosa, dan arabinosa sering juga terdapat. Gula lain yang ditemukan adalah alosa, manosa, fruktosa, apiosa dan asam glukuronat serta galakturonat.
2. Flavonoid C-glikosida.
Gula dapat juga terikat pada atom karbon flavonoid dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon- karbon. Glikosida yang demikian disebut C-glikosida. Sekarang gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoid. Jenis gula yang terlibat ternyata jauh lebih sedikit ketimbang jenis gula pada O-glikosida. Jenis aglikon flavonoid yang terlibat pun sangat terbatas. Jadi, walau pun isoflavon, flavanon, dan flavonol kadang-kadang terdapat dalam bentuk C-glikosida, hanya flavon C-glikosida yang paling lazim ditemukan.
3. Flavonoid Sulfat
Gabungan flavonoid lain yang mudah larut dalam air yang mungkin ditemukan hanya flavonoid sulfat. Senyawa ini mengandung satu ion sulfat atau lebih, yang terikat pada hidroksil fenol atau gula.
4. Biflavonoid
Biflavonod adalah flavonoid dimer, walau pun prosianidin dimer (satuan dasarnya katekin) biasanya tidak dimasukkan ke dalam golongan ini.
Flavonoid yang biasanya terlibat adalah flavon dan flavanon yang secara biosintesis mempunyai pola oksigenasi yang sederhana 5,7,4’ (atau kadang- kadang 5,7,3’,4’) dan ikatan antar-flavonoid berupa ikatan karbon-karbon atau kadang-kadang ikatan eter. Biflavonoid jarang ditemukan sebagai glikosida, dan penyebarannya terbatas, terdapat terutama pada gimnospermae.
5. Aglikon flavonoid yang aktif-optik
Aglikon flavonoid mempunyai atom karbon asimetrik dan dengan demikian menunjukkan keaktifan optik (yaitu memutar cahaya terpolarisasi-datar). Yang termasuk dalam golongan flavonid ini ialah flavanon, dihidroflavonol, katekin, pterokarpan, rotenoid, dan beberapa biflavonoid (Markham, 1988).
Flavonoid dalam tumbuhan sebagai campuran; jarang sekali dijumpai hanya flavonoid tunggal dalam jaringan tumbuhan. Disamping itu, sering terdapat campuran yang terdiri atas flavonoid yang berbeda kelas. Antosianin berwarna yang terdapat dalam daun bunga hampir selalu disertai oleh flavon atau flavonol. Umumnya antosianin juga dalam bentuk campuran, terutama dalam jaringan bunga.
Penggolongan jenis flavonoid dalam jaringan tumbuhan awalnya didasari oleh sifat kelarutan dan reaksi warna, yang kemudian diikuti dengan pemeriksaaan ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis, secara kromatografi satu arah, dan pemeriksaan ekstrak etanol secara dua arah, sehingga flavonoid dapat dipisahkan dengan cara kromatografi. Komponen masing-masing diidentifikasi dengan mambandingkan kromatografi dan spectrum, dengan memakai senyawa pembanding yang sudah dikenal.
1. Antosianin
Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam tumbuhan. Pigmen yang berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebab hamper semua warna merah jambu, merak marak, merah, merah senduduk, ungu, dan biru dalam daun bunga, daun, dan buah pada tumbuhan tangkat tinggi.secara kimia semua antosianin merupakan turunan suatu struktur aromatik tunggal, yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari pigmen sianidin ini dengan metilasi atau glikosilasi.
O
OH
A C
B
Gambar.2.1 Struktur antosianin
2. Flavonol dan flavon
Flavonol sangat tersebar luas dalam tumbuhan, baik dalam kopigmen antosianin dalam daun bunga maupun dalam daun tumbuhan tingkat tinggi, senyawa ini sering terdapat dalam bentuk glikosida. Dalam tumbuhan terdapat banyak sekali glikosida flavonol.
O
O
OH A C
B
Gambar.2.2 Struktur flavonol
Flavon berbeda dengan flavonol Karena pada flavon tak terdapat penyulihan 3-hidroksi. Hal ini mempengaruhi serapan UV-nya, gerakan kromatografinya, seta reaksi warnanya, dan Karena itu flavon dapat dibedakan dari flavonol berdasarkan ketiga sifat tersebut. Flavon terdapat juga sebagai glikosida tetapi jenis glikosidanya lebih sedikit daripada jenis glikosida pada flavonol. Jenis ini yang paling umum ialah 7-glukosida, contohnya luteolin 7-glikosida.
O
O A C
B
Gambar.2.3 Struktur flavon
3. Flavonoid minor, xanton, dan stilbelina
Khalkon, auron, flavonon, dihidrokhalkon, dan isoflavon disebut ‘flavonoid minor’
Karena penyebarannya masing-masing kelas ini terbatas, terdapat secara sporadic (misalnya flavonon) atau terbatas pada sangat sedikit golongan tumbuhan (misalnya isoflavon pada leguiminosa dan iridaceae).
A O
B
Gambar.2.4 Struktur Khalkon
Khalkon dan auron merupakan ‘antoklor’, yaitu pigmen kuning yang dapat dideteksi berdasarkan perubahan warna, daun bunga berwarna kuning diuapi dengan uap ammonia akan menghasilkan perubahan warna dari kuning menjadi jingga atau merah. flavonon merupakan isomer khalkon, walapun khalkon sering dijumpai di alam bersama-sama dengan analog flavon. Beberapa flavonon mempunyai rasa, misalnya, naringin jeruk Seville, citrus aurantium, dan rasa sangat pahit.
O
O
A CH B
Gambar.2.5 Struktur auron
4. Tanin
Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam angiospremae terdapat khusus dalam jaringan kayu. Dalam industry, tannin adalah senyawa yang berasal dari tumbuhan, yang mampu mengubah kulit hewan yang mentah menjadi kulit siap pakai Karena kemampuannya menyambung silang proteina.
Secara kimia terdapat dua jenis tanin yang tersebar tidak merata dalam dunia tumbuhan. Tanin-terkondensasi banyak terdapat pada tumbuhan paku-pakuan dan gymnospermae, serta tersebar luas dalam angiospermae, terutama pada jenis tumbuhan berkayu. Sebaliknya, tanin yang terhidrolisa penyebarannya terbatas pada tumbuhan berkeping dua. Akan tetapi kedua jenis tanin ini dapat dijumpai bersamaan dalam tumbuhan yang sama seperti yang terjadi pada kulit dan daun.
5. kuinon
Kuinon merupakan senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar seperti kromofor pada benzokuinon, yang terdiri atas dua gugus karbonil yang terkonjugasi dengan dua ikatan rangkap karbon-karbon. Empat kelompok kuinon yaitu, benzokuinon, naftokuinon, antrakuinon dan kuinon non isoprenoid. Tiga kelompok pertama biasanya terhidroksilasi dan bersifat senyawa fenol, serta gabungan dengan gula sebagai glikosida atau dalam bentuk kuinol.
6. Pigmen Flavonoid
Semua flavonoid, menurut strukturnya, merupakan senyawa induk flavon, harborne dalam bukunya tahun 1987 mengkelaskan senyawa flavonoid dalam sepuluh kelas.
Identifikasi dan garis besar kesamaan sifat senyawa flavonoid serta yang membedakan sifat dan ciri khas flavonoid berdasarkan kelas yang satu dengan yang lain.
Tabel 2.1 Sifat berbagai golongan flavonoid Golongan
flavonoida
Penyebaran Ciri khas
Antosianin
Proantosianidin
Flavonol
Flavon
Glikoflavon
Biflavonil
Khalkon dan auron
Flavanon
Isoflavon
Pigmen bunga merah marak, dan biru juga dalam daun dan jaringan lain.
Terutama tidak berwarna, dalam daun tumbuhan yang berkayu.
Terutama ko-pigmen tidak berwarna dalam bunga sianik dan asianik tersebar luas dalam daun.
Seperti flavonol
Seperti flavonol
Tidak berwarna dan hampir seluruhnya terbatas pada gimnospermae
Pigmen bunga kuning, kadang- kadang terdapat juga dalam jaringan lain
Tidak berwarna, dalam daun dan buah (terutama dalam Citrus)
Tidak berwarna, sering kali dalam akar, hanya terdapat dalam suku Leguminosae
Larut dalam air, λ maks 515- 545 nm, bergerak dengan BAA pada kertas.
Menghasilkan antosianidin bila jaringan dipanaskan dalam HCl 2M selama setengah jam.
Setelah hidrolisis, berupa bercak kuning murup pada kromatogram Forestal bila disinari sinar UV, maksimal spektrum pada 330 – 350 nm.
Setelah hidrolisis, berupa bercak coklat redup pada kromatogram Forestal mak- simal spektrum pada 330-350 nm.
Mengandung gula yang terikat melalui ikatan C-C, bergerak dengan pengembang air, tidak seperti flavon biasa.
Pada kromatogram BAA berupa bercak redup dengan RF tinggi .
Dengan amonia berwarna merah (perubahan warna dapat diamati in situ), maksimal spektrum 370-410 nm.
Berwarna merah kuat dengan Mg/HCl, kadang – kadang sangat pahit .
Bergerak pada kertas dengan pengembang air, tidak ada uji warna yang khas.
2.3.2 Sifat Kelarutan Senyawa Flavonoida
Flavonoida merupakan senyawa polar maka umumnya flavonoida larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, air dan lain-lain.
Disamping itu adaanya gula yang terikat pada flavonoida cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah larut dalam air. Dengan demikian campuran pelarut di atas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida.
Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).
Flavonoida sebagai polifenol dan mempunyai sifat kimia seperti fenol yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Akan tetapi jika didiamkan dalam larutan basa dan terdapat banyak oksigen maka akan cemderung terurai, ini dikarenakan gugus hidroksil yang tak tersulih atau suatu gula flavonoid. (Watson, 2014)
2.3.3 Biosintesis Flavonoida
Fenil propana bersumber dari asam sikimat (jalur fenilalanin), senyawa flavonoid diturunkan dari unit fenil propane C6-C3 melalui jalur poliketida yang dimana tersusun atas tiga molekul malonil-KoA yang tergabung dengan unit fenil propana sekaligus sebagai KoA tioester dalam pembentukan unit awal triketida. Oleh Karena itu, flavonoid hasil dari biosintesis gabungan terdiri dari unit unit yang diturunkan dari asam sikimat dan jalur poliketida.
Triketida yang merupakan unit awal mengalami siklimasi pengaruh enzim kalkon sintase sehingga membentuk gugus kalkon pada flavonoid. Kemudian terjadi siklus, dalam fase siklus ini akan menghasilkan cincin piranon yang mengandung inti flavanon, dalam ini memiliki ikatan C2-C3 teroksidasi (tidak jenuh) dan menghasilkan gugus flavon, atau dihiroksilasi pada posisi C3 cincin piranon dan menghasilkan gugus flavanol pada flavonoid.
Flavonol kemudian dioksidasi dan menghasilkan antosianin, ciri khas dari senyawa antosianin yakni dapat memberikan warna biru terang pada bunga dan warna anggur merah gelap, warna kuning dan jingga pada mahkota bunga, serta dapat
menyerap cahaya pada spectrum UV ( pengaruh gugus kromofor) yang kemudian dapat menarik perhatian serangga.
Skema biosintesis dari turunan asam sikimat :
Asam sikimat → asam prefenat → asam p-hidroksifenil piruvat → asam p- hidroksifenillaktat → asam p-hidroksisinamat → flavanon. Hidroksilasi pada cincin A dan B terjadi setelah pembentukan cincin sempurna (Sirait, 2007).
Gambar 2.6 Biosintesa hubungan antara jenis monomer flavonoida dari alur asetat- malonat dan alur sikimat
2.4 Skrinning Fitokimia
Kandungan senyawa metabolit sekunder dalam suatu tanaman dapat diketahui dengan suatu metode pendekatan yang dapat memberi informasi adanya senyawa metabolit sekunder. Salah satu metode yang dapat digunakan adalah metode skrinning fitokimia.
Identifikasi flavonoid dilakukan dengan melarutkan ekstrak pekat sampel dalam metanol panas dan menambahkan serbuk Mg dan HCl akan mengalami perubahan warna orange, merah sampai ungu untuk flavon, flavonol tergantung senyawa yang terkandung dalam sampel yang diidentifikasi. (Farnsworth, 1966) dengan H2SO4(p) akan mengalami perubahan warna menjadi larutan kuning menandakan adanya kandungan flavonoid jenis flavon atau flavonol. (Cannell, 1998) menggunakan NaOH 10% akan mengasilkan larutan biru violet. Secara luas identifikasi yang paling sering digunakan adalah dengan pelarut FeCl 5%, dimana perubahan warna bersifat stabil pada warna kehijauan, biru, hitam-biru (Robinson, 1995).
2.5 Teknik Pemisahan
Pemisahan komponen berdasarkan jenis dan sifat komponen yang akan dipisahkan, terdiri atas dua jenis yaitu, pemisahan fisika dimana pemisahan yang didasari oleh perbedaan sifat-sifat komponen dalam campuran dalam skala besar, sedangkan pemisahan kimia merupakan pemisahan berdasarkan pada perbedaan molekul kecil senyawa ataupun golongan tertentu (Muldja, 1995).
Pemilihan teknik pemisahan sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisahkan. Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik. Keempat teknik kromatografi itu adalah : kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas cair (KGC), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
2.5.1 Ekstraksi
Dalam analisis fitokimia, umunya digunakan tumbuhan segar yang dimasukkan kedalam alcohol mendidih. Cara lain, tumbuhan dapat dikeringkan sebelum diekstraksi. Namun dalam proses pengeringan dalam keadaan terawasi untuk mencegah terjadinya perubahan kimia misalnya dikeringkan dalam waktu cepat pada suhu kamar, dan dengan aliran udara yang baik.
Prosedur klasik untuk memperoleh kandungan senyawa organic dari jaringan tumbuhan kering adalah dengan mengekstraksi serbuk bahan dengan alat soxhlet yang selanjutnya digunakan sederetan pelarut secara berganti-ganti, mulai dengan eter, lalu eter minyak bumi, dan kloroform (Harborne, 1996). Terdapat sejumlah metode ekstraksi, yang paling sederhana adalah ekstraksi dingin (dalam labu besar berisi biomassa), dengan cara ini bahan kering hasil gilingan diekstraksi pada suhu kamar secara berturut-turut dengan pelarut yang kepolarannya makin tinggi. Keuntungan utama cara ini adalah merupakan metode ekstraksi yang mudah karena ekstrak tidak dipanaskan sehingga kemungkinan kecil bahan alam terurai. Penggunaan pelarut dengan peningkatan kepolaran secara berurutan memungkinkan pemisahan bahan alam berdasarkan kelarutannya (dan polaritasnya) dalam ektraksi. Hal ini sangat mempermudah proses isolasi. Ekstraksi dingin memungkinkan banyak senyawa terekstraksi, meskipun beberapa senyawa memiliki kelarutan terbatas dalam pelarut ekstraksi pada suhu kamar (Heinrich et al, 2009).
2.5.2. Partisi
Proses partisi sangat tergantung dari daya larut dalam dua macam cairan, oleh karena itu sangat peka terhadap perbedaan berat molekul solute. Atas dasar itu, suatu campuran zat yang komponennya merupakan anggota seri homolog, biasanya paling baik dipisahkan dengan kromatografi partisi, terutama anggota-anggota yang mempunyai jumlah atom C lebih dari lima. Pada partisi kedua fasenya tidak dapat diatur konstan polaritasnya, metode ini dipakai untuk pemisahan senyawa yang bersifat lebih polar.
Cara partisi pelarut yang sederhana menghilangkan sebagian besar komponen yang tak diinginkan dan, terutama jika dilanjutkan dengan uji biologi, fraksi-fraksi yang lebih kaya akan komponen yang dicari diperoleh dengan cepat. Tahap pemisahan saponin dari bahan tumbuhan, langkah tunggal partisi dengan butanol-air sering dipakai untuk memekatkan saponin dalam fraksi butanol dan merupakan langkah pembersihan. Jadi, ekstak methanol baha tumbuhan dipartisi dulu dengan n- butanol-air sebelum fraksi butanol dimurnikan lebih lanjut (Hostettman, 1980)
2.5.3. Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan yang pertama dipakai untuk memisahkan zat-zat warna tanaman. Teknik pemisahan dalam sebuah campuran dengan menggunakan fase gerak dan fase diam dalam kromatografi. Dua fase yaitu fase gerak dan fase diam. Fase gerak dapat berupa gas ataupun cairan sistem pelarut dan fase diam dapat berupa lapisan cairan ataupun permukaan padat (Adnan, 2007).
Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi: kromatografi partisi, kromatografi pasangan ion, kromatografi penukar ion, kromatografi adsorbsi, kromatografi eksklusi ukuran. Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi cair kinerja tinggi, dan kromatogtrafi gas (Marston, 1995)
2.5.3.1 Kromatografi Lapis Tipis
Metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan bahan yang larut dalam lipid, yaitu lipid, steroid, karotenoid, kuinon sederhana, dan klorofil disebut kromatografi lapis tipis. Kelebihan khas dari KLT adalah keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya. kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkam pada pelat dan merupakan keuntungan dalam identifikasi senyawa yang tidak murni. Namun kelemahan KLT yaitu kerja penyaputan pelat kaca dengan penjerap (Harborne, 1987).
Pada umumnya fase diam bersifat polar dan senyawa polar akan melekat lebih kuat pada lempeng daripada senyawa tak polar akibat interaksi tarik menarik dipole.
Senyawa tak polar kurang melekat erat pada fase diam polar sehingga bergerak naik lebih jauh ke atas lempeng. Jarak tempuh ke atas lempeng merupakan cermin polaritas senyawa. Peningkatan polaritas pelarut akan menurunkan interaksi senyawa dengan fase diam sehingga senyawa dalam fase gerak bergerak lebih jauh pada lempeng (Bresnick, 2005).
Terdapat bermacam-macam pelat, pelat dapat mengandung indikator fluoresensi atau tidak. Penambahan indikator ini memungkinkan pendeteksian semua senyawa yang memadamkan fluoresensi bila pelat diamati dengan disinari sinar UV berpanjang gelombang 254nm. Untuk pengukuran RF pada KLTmembutuhkan proses yang memakan waktu. Biasanya KLT dilakukan dengan cara pengembangan naik di dalam suatu bejana jenuh dengan fase pelarut. Deteksi senyawa pada pelat KLT biasanya dilakukan dengan penyemprotan (Harborne, 1987).
Kromatografi Lapis Tipis terutama berguna untuk mencari pelarut untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi flavonoida secara ko-kromatografi, isolasi flavonoida murni skala kecil, penyerap dan pengembang yang digunakan umumnya sama dengan penyerap dan pengembang pada kromatografi kolom dan kromatografi kertas (Markham, 1988).
Parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis dimana harga Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu komponen pada kromatogram.
Rf didefenisikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh komponen terhadap jarak yang ditempuh pelarut atau fase gerak.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam KLT yang juga mempengaruhi harga Rf antara lain struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan, sifat dari penyerap dan derajat aktivasi, tebal kerataan dan lapisan penjerap, pelarut dan derajat kemurnian fase gerak, derajat kejenuhan dari uap, jumlah cuplikan yang digunakan, suhu, kesetimbangan (Sastrohamidjojo, 1996).
2.5.3.2 Kromatografi Kolom
Ada empat jenis kromatografi yang dapat dimasukkam dalam kromatografi kolom, yaitu kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi pertukaran ion, dan kromatografi filtrasi gel. Dalam kromatografi adsorbs komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom. Alumina dan silika gel merupakan dua adsorben yang paling popular dipakai.
Silika gel mempunyai luas permukaan yang lebih besar, yaitu sekitar 500m2/g, tetapi mempunyai aktivitas kimia yang lebih kecil dan lebih baik untuk pemisahan senyawa- senyawa organic yang peka terhadap perubahan-perubahan karena aktivitas permukaan yang mempunyai sifat katalitik.
Pengisian kolom dilakukan dengan seragam. Setelah adsorben dimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dalam kolom dengan menggunakan vibrator atau dengan plunger. Pada bagian bawah dan atas dari isian kolom diberi wol kaca atau sintered gkass disc untuk menyangga isian. Untuk hasil pemisahan yang baik, maka kecepatan elusi harus dalam keadaan konstan yang dimana bergantung kepada ukuran partikel bahan isian, dimensi dari kolom, viskositas cairan dan tekanan yang dipakai untuk mengalirjan zat pelarut.
2.5.4 Hidolisis
Metode hidrolisis asam pada fraksi air merupakan gabungan dan modifikasi, uji flavonoid yang positif dihidrolisis untuk memutuskan ikatan gula dari aglikon flavonoid dan sekaligus memisahkan senyawa lain yang mungkin terkandung dan terikat pada flavonoid.
Satu gugus hidroksil pada flavonoid terikat pada satu gula dengan ikatan yang terikat pada satu gula dengan ikatan yang tahan asam. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga terdapat adalah galaktosa, ramnosa, silosa, arabinosa, dan rutinosa. Waktu yang diperlukan untuk memutuskan suatu gula dari suatu flavonoid O-glukosida dengan hidrolisis asam ditentukan oleh sifat gula (Markham, 1988)
2.6. Teknik Spektroskopi
Metoda spektroskopi merupakan instrument utama dalam kimia modern untuk identifikasi struktur molekul. Pada kimia organik, metode spektroskopi digunakan untuk menentukan dan mengonfirmasikan struktur molekul, untuk memantau reaksi dan untuk mengetahui kemurnian suatu senyawa. Metoda yang paling penting untuk kimia organik adalah spektroskopi resonansi magnetic inti: Spektroskopi 1H dan 13C NMR, spektrometri massa, inframerah dan spektroskopi UV/Vis. (Meier, 2002)
2.6.1 Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel (UV-Vis)
Spektrum UV-Visibel merupakan hasil interaksi antara radiasi elektromagnetik (REM) dan molekul. radiasi elektromagnetik merupakan bentuk energi radiasai yang mempunyai sifat gelombang dan partikel (foton). Karena bersifat sebagai gelombang, beberapa parameter perlu diketahui, misalnya panjang gelombang, frekuensi, bilangan gelombang, serapan.
Spektrofotometer UV-Visibel digunakan terutama dalam analisis kuantitatif, tetapi dapat juga digunakan untuk analisis kualitatif. Pada analisis kualitatif, proses yang dilakukan adalah untuk membandingkan panjang gelombang maksimum, serapan dan daya serap, serta membandingkan spectrum serapan. Pemilihan pelarut yang digunakan dalam spektrofotometri UV sangat penting. Pelarut tidak boleh mengabsorpsi cahaya pada daerah panjang gelombang pengukuran sampel (Adnan, 2007)
Ciri spektrum menurut Markham pada tahun 1988, khas jenis flavonoid utama dengan pola oksigenasi yang setara dapat dilihat dari tabel 2.2 dibawah :
Tabel.2.2 Rentangan Serapan Spektrum UV-Visible golongan Flavonoida Pita II (nm) Pita I (nm) Jenis Flavonoid
250-280 310-350 Flavon
250-280 330-360 Flavonol (3-OH tersubstitusi)
250-280 350-385 Flavonol (3-OH bebas)
245-275 310-330 bahu Isoflavon
275-295 300-330 bahu Flavanon dan dihidroflavonol 230-270
(kekuatan rendah)
340-390 Khalkon
230-270 (kekuatan rendah)
380-430 Auron
270-280 465-560 Antosianidin dan antosianin
2.6.2 Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR)
Setiap molekul senyawa yang memiliki struktur kimia yang berbeda akan memiliki spektrum inframerah yang berbeda, hal ini dikarenakan setiap molekul.
Frekuensi vibrasi berbagai ikatan dapat dilihat dari table 2.3 sebagai berikut :
Tabel 2.3 Frekuensi vibrasi berbagai ikatan Frekuensi
(cm-1)
4000 650
2500 2000 1800 1650 1550
Ikatan O-H C≡C Hampir
tidak ada pita absorbsi
C=O C=N C-Cl
C-H C≡N C=C C-O
=CH X=C=Y N=O C-N
N-H (C,O,N,S) C-C
≡CH N=O
Vibrasi ulur ikatan C=0 biasanya di pengaruhi beberapa faktor, adanya ikatan C=C yang bertetangga dengan gugus karbonil menyebabkan terjadinya delokalisasi electron π pada ikatan karbonil dan ikatan rangkap konjugasi ini menaikkan sifat ikatan tunggal C=O. Akibatnya, tetapan kekuatan k turun dan frekuensi absorpsi C=O turun dimana ini juga disebut efek konjugasi (Herbert, 1989).
Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul. Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul:
1. Streching (vibrasi regang/ulur) : vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan atau pemendekan ikatan.
2. Bending (vibrasi lentur/tekuk) : vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan.
Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energi lebih dari satu panjang gelombang, energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi lentur.
Tipe vibrasi yang berlain-lainan ini disebut cara vibrasi fundamental (Supratman, 2010).
2.6.3 Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti proton (1H-NMR)
Spektroskopi resonansi magnet proton digunakan untuk menentukan jenis lingkungan atom yang berbeda yang ada dalam molekul dimana jumlah atom hydrogen pada masing-masing jenis lingkungan hydrogen dan jumlah atom hydrogen pada atom karbon tetangga. Sinyal-sinyal muncul oleh karena proton-proton dalam setiap molekul berada dalam lingkungan kimia yang berlainan. Sinyal sinyal resonansi akan terletak terpisah oleh Karen adanya pergeseran kimia atau Chemical shift (Herbert, 1989).
Tidak semua sinyal berpola sederhana seperti berupa garis tunggal atau singlet, beberapa sinyal mengikuti pola pemecahan (splitting) yang karakteristik, seperti doublet, triplet, dan kuartet. Pemecahan disebabkan oleh penggandengan spin- spin (spin-spin coupling), yaitu interaksi magnetic suatu inti dengan inti lain. Jenis lingkungan kimia proton dapat dilihat dari pergeseran kimia yang terjadi, dimana tanda integrase memberi informasi jumlah relatif proton yang ada. Jumlah orientasi suatu inti yang diberi medan magnet eksternal ditentukan oleh bilangan kuantum spin
inti. Fenomena 1H-NMR terjadi jika inti yang searah dengan medan magnet eksternal dibuat mengabsorpsi energi berupa radiasi elektromagnetik sehingga orientasi spinnya berubah.
Untuk 1H-NMR, standar pembanding yang direkomendasikan adalah tetrametilsilan [(CH3)4Si/TMS)]. TMS juga dapat digunakan untuk 13C-NMR. Berikut alasan penggunaan TMS sebagai pembanding magnetic inti proton :
1. Stabil secara kimia, simetris, dan beresonansi pada medan atas (upper field).
2. Proton pada gugus metil senyawa ini lebih terperisai.
3. TMS memberikan sinyal tajam (singlet), 12 proton.
4. Bersifat inert.
5. Titik didih rendah shingga mudah dihilangkan.
6. Larut dalam sebagian besar pelarut organik.
7. Tidak larut dalam air atau D2O.
Dalam skala yang dianjurkan, “skala δ” TMS dijadikan sebagai titik nol dan meningkat
ke daerah yang lebih rendah (downfield).
Geseran kimia (chemical shift) berasal dari medan magnet sekunder yang ditimbulkan oleh peredaran electron mengelilingi inti secara induksi oleh medan magnet terapan. Medan magnet sekunder ini relative lebih kecil dan dapat searah atau berlawanan arah dengan medan terapan. Akibatnya, medan magnet efektif yang diterima inti akan lebih kecil atau lebih besar daripada medan terapan (Hebert, 1989).
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat
1. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu 2. Spektrofotometer UV-Visible Shimadzu 3. Spektrometer 1H-NMR JEOL
4. Rotarievaporator Bűchi B-480
5. Labu rotarievaporator Pyrex
6. Gelas Beaker Gratech
7. Corong pisah Gratech
8. Labu didih Schoot/ Duran
9. Kolom kromatografi Pyrex
10. Neraca analitis Ohaus
11. Lampu UV UVGL 58
12. Gelas ukur Pyrex
13. Erlenmeyer Pyrex
14. Corong kaca Pyrex
15. Ekstraktor Schoot/ Duran
16. Tabung reaksi Pyrex
17. Penangas air Memmert
18. Botol vial
19. Batang pengaduk 20. Pipet tetes
21. Pipa kapiler 22. Spatula
23. Statif dan klem 24. Alat destilasi 25. Chamber
3.2 Bahan
1. Daun mawar merah (Rosa hybrida L.)
2. Metanol Destilat
3. N-heksana Teknis
4. Etil asetat Teknis
5. Kloroform Teknis
6. Benzena Teknis 7. Aseton Teknis
8. Silika gel 60 G (0.063-0.200 mm) E.Merck. KGaA
9. Plat KLT Merck/ Kieselgel 60F254
10. Kertas saring Whatman no.42
11. FeCl3 5%
12. NaOH 10 % 13. Serbuk Mg
14. HCl(p) p.a. Merck
15. H2SO4(p) p.a. Merck
16. HCl 6%
17. Kapas Gesunde Medical
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti yaitu daun mawar merah (rosa hybrida L.) diperoleh dari kota Berastagi, Sumatera Utara. Daun mawar merah dipisahkan dari batang dan dikeringkan pada ruangan tanpa sinar matahari langsung, kemudian dihaluskan dan dipisahkan serbuk daun dan serat daun. Serbuk daun mawar merah yang diteliti sebanyak 1220 gram.
3.3.2 Uji Pendahuluan
Orientasi awal penelitian dilakukan uji positif senyawa fenolik dan flavonoid dimana Serbuk daun mawar merah dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif ekstrak metanol dan ekstak etil asetat daun mawar merah sebagai berikut :
A. Uji positif ekstrak metanol
1. Dimasukkan 10 gram serbuk daun mawar merah ke dalam erlenmeyer 2. Ditambahkan 100 mL metanol ke dalam erlenmeyer
3. Didiamkan ± 24 jam 4. Didekantasi
5. Dimasukkan filtrat hasil dekantasi masing-masing ekstrak sampel ke dalam 4 tabung reaksi dan diberi label (I, II, III, IV) masing masing tabung reaksi 6. Diuji positif dengan pereaksi
a. Tabung I : dengan FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam
b. Tabung II: dengan serbuk Mg, dan HCl(p) menghasilkan larutan merah muda c. Tabung III: dengan NaOH 10% menghasilkan larutan biru violet
d. Tabung IV: dengan H2SO4(p) menghasilkan larutan orange kekuningan
B. Uji positif ekstrak etil asetat
1. Dimasukkan 10 gram serbuk daun mawar merah ke dalam erlenmeyer 2. Ditambahkan 100 mL etil asetat ke dalam erlenmeyer
3. Didiamkan ± 24 jam 4. Didekantasi
5. Dimasukkan filtrat hasil dekantasi masing-masing ekstrak sampel ke dalam 4 tabung reaksi dan diberi label (I, II, III, IV) masing masing tabung reaksi 6. Diuji positif dengan pereaksi
a. Tabung I : dengan FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam
b. TabungII: dengan serbuk Mg, dan HCl(p) menghasilkan larutan merah muda c. Tabung III: dengan NaOH 10% menghasilkan larutan biru violet
d. Tabung IV: dengan H2SO4(p) menghasilkan larutan orange kekuningan
3.3.3 Ekstraksi
Proses ekstraksi awal dilakukan secara ekstraksi maserasi, dimana serbuk daun mawar merah sebanyak 1200 gram dimasukkan ke dalam ekstraktor, Kemudian dimasukkan pelarut metanol sebanyak 5L dan dibiarkan sampel terendam selama ±24 jam.
Kemudian filtrat hasil perendaman dipisahkan dari sampel. Proses maserasi, perendaman dengan metanol dan penampungan filtrat dilakukan hingga 4 kali dimana sampel telah negatif flavonoid melalui uji positif FeCl3 5%. Filtrat hasil perendaman kemudian diuapkan dengan alat rotarievaporator hingga pelarut metanol habis menguap.
Proses ekstraksi selanjutnya adalah pemisahan senyawa tanin. Ekstrak pekat metanol kemudian dilarutkan dengan pelarut etil asetat kemudian disaring. Filtrat kemudian diuapkan dengan alat rotarievaporator hingga pelarut etil asetat habis menguap. Ekstrak etil asetat selanjutnya dilarutkan dengan pelarut metanol.
Kemudian diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai senyawa non-polar habis.
Lapisan metanol kembali dipekatkan dengan alat rotarievaporator hingga pelarut metanol habis menguap.
Fraksi metanol kemudian dihidrolisis dengan HCl 6N dan aquadest, dipanaskan diatas penangas ± 60menit, kemudian didinginkan dan disaring. Filtrat kemudian di ekstraksi partisi dengan kloroform hingga lapisan bawah negatif flavonoid dalam uji positif dengan FeCl3 5%. Filtrat methanol asam diuapkan hingga pelarut metanol habis menguap. Diperoleh ekstak pekat kloroform sebanyak 0.5293 gram.
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan untuk mengetahui sistem pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Analisis Kromatografi Lapis Tipis menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 Merck.
Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksan:etil asetat dengan perbandingan (90:10) , (80:20) , (70:30) , (60:40) dan (50:50) .
Ditotolkan ekstrak pekat kloroform pada empat plat silika. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10) , (80:20) , (70:30) , (60:40) dan (50:50) yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi hingga pelarut mencapai batas yang telah ditentukan. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan, diamati dibawah lampu UV dan kemudian difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh.
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Tahap pemisahan berikutnya adalah dengan kromatografi kolom dimana fasa diam menggunakan silika gel 60 F254 Merck dan fasa gerak yaitu n-heksana, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 (v/v).
Tahapan persiapan proses kromatografi kolom, terlebih dahulu dirangkai alat kromatografi kolom. Silika gel 60 F254 Merck sebanyak 40 gram dibuburkan dengan menggunakan pelarut n-heksana, dimasukkan ke dalam kolom kromatografi secara perlahan-lahan kemudian di tutup dengan kapas, dimasukkan n-heksana hingga silika gel padat. Ekstrak pekat kloroform di larutkan dengan etil asetat kemudian dicampur dengan 10 gram Silika gel 60 F254 Merck, kemudian di uapkan hingga pelarut etil asetat habis menguap. kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel kemudian kembali tutup dengan kapas, lalu ditambahkan secara perlahan-lahan fasa gerak n-heksana:etil asetat mulai dari perbandingan 90:10 (v/v), 80:20 (v/v), 70:30 (v/v), 60:40 (v/v). Filtrat yang terpisah ditampung dalam botol vial sebanyak 5 mL, lalu di KLT untuk penggabungan fraksi dimana dengan membandingkan harga Rf yang sama lalu diuji positif dengan FeCl3 5%.
3.3.6 Pemurnian
Senyawa hasil kromatografi kolom berupa ekstrak pekat kemudian dilarutkan dengan etil asetat hingga seluruhnya larut, kemudian dimurnikan dengan ekstraksi partisi penambahan pelarut non-polar n-heksana, kemudian dipisahkan senyawa non-polar.
dilakukan secara berulang-ulang hingga senyawa non-polar dalam ekstrak senyawa hilang dan didapat senyawa polar murni.
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Hasil kromatografi kolom berupa ektrak pekat berupa pasta kemudian dilakukan analisis kromatografi lapis tipis menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak kloroform : metanol (90:10) v/v, n-heksana : etil asetat (70:30)v/v.
Ekstrak pekat berupa pasta dilarutkan dengan etil asetat kemudian ditotolkan pada plat silika. Dimasukkan plat silika dimasukkan kedalam bejana KLT. Setelah pelarut fasa gerak bergerak sampai batas atas, plat silika dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah lampu UV dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5%, dihitung harga Rf yang diperoleh.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer Ultraviolet-Visible (UV-Vis) dilakukan di LIPI, Komplek PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang, dengan menggunakan pelarut metanol dan diperoleh data seperti ditunjukkan pada gambar 4.1.
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR)
Analisis dengan alat Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) dilakukan di LIPI, Komplek PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang, dengan menggunakan pelarut KBr dan diperoleh data seperti ditunjukkan pada gambar 4.2
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analisis dengan alat Spektrometer 1H-NMR dilakukan di LIPI, Komplek PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang, dengan menggunakan pelarut Aseton dan diperoleh data seperti ditunjukkan pada gambar 4.3
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
3.4.1 Ekstraksi dengan Pelarut Metanol
diekstraksi maserasi dengan
metanol disaring
dimasukkan dalam tabung reaksi
ditambahkan FeCl3 5%
diamati
perubahan
warna
Larutan hitam (Positif Fenolik) Serbuk daun mawar merah
( Rosa hybrida L. )
Ekstrak metanol sampel daun mawar merah
A. Ekstraksi dengan pelarut etil asetat
diekstraksi maserasi dengan
Etil asetat disaring
dimasukkan dalam tabung reaksi
ditambahkan FeCl3 5%
diamati
perubahan
warna
Larutan hitam (Positif Flavonoida) Serbuk daun mawar merah
( Rosa hybrida L. )
Ekstrak metanol sampel daun mawar merah
3.5. BAGAN PENELITIAN
dimaserasi dengan metanol hingga
terendam didiamkan selama ± 24 Jam
diulangi sebanyak 4 kali disaring
diuji positif dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga seluruh pelarut metanol menguap
dilarutkan dengan etil asetat secara berulang ulang sampai negatif flavonoid yang diuji dengan pereaksi FeCl3 5%
disaring
diuji dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga pelarut etil asetat habis menguap
dilarutkan dengan metanol
diekstraksi partisi dengan n-heksana hingga larutan bebas senyawa non-polar
dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga seluruh metanol menguap dihidrolisa dengan menggunakan HCl 6%
sambil dipanaskan selama ± 60 menit didinginkan
disaring
Diekstraksi partisi dengan klorofom
Hingga negatif Flavonoid yang di uji dengan pereaksi FeCl3 5%
Diuapkan hingga pelarut metanol habis menguap Lapisan metanol-asam
chcl CHCl3
Residu 1200 g serbuk daun mawar merah
(Rosa hybrida L.)
Residu Ekstrak etil asetat
Lapisan metanol Lapisan n-
heksana Tidak dilanjutkan
Ampas Ekstrak metanol
Ekstrak pekat metanol
Ekstrak pekat etil asetat
Ekstrak pekat Kloroform
Bagan lanjutan
diuji kromatografi lapis tipis untuk mengetahui eluen yang sesuai dikolom kromatografi menggunakan fase diam silika gel dan
fase gerak n-heksana:etil asetat (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50)v/v ditampung 10mL tiap fraksi dalam botol vial
diuji kromatografi lapis tipis
digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
dianalisis kromatograsi lapis tipis diuapkan hingga pelarut habis dilarutkan dengan etil asestat
dicampur dengan silika gel
diuapkan hingga pelarut habis menguap dikolom kromatografi menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak n- heksana : etil asetat (70:30) v/v
dianalisis kromatografi lapis tipis digabung fraksi murni noda tunggal diuapkan hingga pelarut habis
dikarakterisasi dengan Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer FT-IR, Spektrometer 1-H-NMR
Ekstrak pekat klorofom
Hasil Fraksi 1-19
Eluen n- heksana:etil
asetat (90:10)v/v
Fraksi 20-34 Eluen n- heksana:etil
asetat (80:20)v/v
Fraksi 35-64 Eluen n- heksana:etil
asetat (70:30)v/v
Fraksi 65-84 Eluen n- heksana:etil
asetat (60:40)v/v
Fraksi 85-100 Eluen n- heksana:etil
asetat (50:50)v/v
Fraksi 1-15 Eluen n- heksana:etil
asetat (70:30)v/v
Fraksi 16-33 Eluen n- heksana:etil
asetat (70:30)v/v
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Tahap awal penelitian berupa orientas terhadap sampel daun mawar merah, identifikasi awal kandungan flavonoid pada daun segar mawar merah positif terhadap pereaksi FeCl3 5% perubahan warna hijau muda dari ekstrak etil asetat sampel menjadi hitam menuntukkan kandungan flavonoid.
Hasil isolasi dari daun mawar merah diperoleh dengan menggunakan fase gerak n-heksana:etil astat (70:30) v/v, dan senyawa yang diperoleh berbentuk pasta berwarna kuning kecoklatan, dengan massa = 6.9 mg dan diuji kemurnian kromatografi lapis tipis dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (70:30) v/v dengan Rf = 0,4
Spektrum UV-Visible senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut metanol dapat dilihat pada data spektrum dibawah ini :
Gambar 4.1 Spektrum UV-Visibel Senyawa Hasil Isolasi
Dari hasil spektrum Spektrofotometer UV-Visibel pada gambar 4.1 senyawa hasil isolasi memberikan serapan panjang gelombang yaitu dengan panjang gelombang 275,0 nm.
Hasil analisis spektrofotometer FT-IR dari pasta hasil isolasi dapat dilihat pada Gambar 4.2 sebagai berikut:
Gambar 4.2 Spektrum Inframerah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi
Dari hasil analisis Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) memberikan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang (cm-1) sebagai berikut:
1. Pada bilangan gelombang 3302.13-3145.90 cm-1 menunjukkan vibrasi -OH 2. Pada bilangan gelombang 2947.23 cm-1 menunjukkan vibrasi C-H Streching 3. Pada bilangan gelombang 1710.86 cm-1 menunjukkan vibrasi C=O Streching
4. Pada bilangan gelombang 1606.70 cm-1 menunjukkan vibrasi C=C Streching aromatis
5. Pada bilangan gelombang 1373,32 cm-1 menunjukkan vibrasi C-H bendind 6. Pada bilangan gelombang 1060.85 cm-1 menunjukkan vibrasi C-O-C Simetris 7. Pada bilangan gelombang 977.91 cm-1 menunjukkan vibrasi C-O-C tak simetris
Hasil analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut Aseton memberikan pergeseran kimia pada daerah (ppm) pada gambar 4.3 sebagai berikut :
Gambar 4.3 Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
