BAB IV
METODE PENELITIAN 4.1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental untuk menguji aktivitas antibakteri pada sediaan emulgel Tamanu Oil 5% dengan menggunakan variasi gelling agent CMC Na 2%, 2,5%, 3% terhadap pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes.
4.2. Skema Kerja Penelitian
Gambar 4. 1 Skema Kerangka Konseptual
Formulasi sediaan emulgel mengandung tamanu oil kadar 5% dengan variasi gelling agent CMC-Na 2%, 2,5%, dan 3%
Formula 2 Tamanu oil (CMC-Na 2,5 %) Formula 1
Tamanu oil (CMC-Na 2 %)
Formula 3 Tamanu oil 5 (CMC-Na 3 %)
Evaluasi Sediaan
Analisis Data Persiapan bahan uji
Preparasi media
Preparasi bakteri
Pengujian difusi Kelompok Uji :
Formulas 1 : CMC Na 2%
Formula 2 : CMC Na 2,5%
Formula 3 : CMC Na 3%
Kelompok kontrol :
Kontrol positif : Clyndamicin Kontrol negatif : F0
4.3. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Mikrobiologi dan Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang dan lab Putra Indonesia.
Penelitian yang dilakukan ialah uji efektivitas antibakteri sediaan emulgel dengan variasi gelling agent CMC Na terhadap pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes.
4.4. Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2019 sampai bulan maret 2020
4.5. Variabel Penelitian 4.5.1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah penggunaan gelling agent Carboxymethylcelluloce (CMC Na) pada konsentrasi 2%, 2,5%, dan 3%
dalam sediaan emulgel.
4.5.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung dari penelitian ini yaitu diameter zona hambat dari masing-masing formula.
4.6. Alat dan Bahan Penelitian 4.6.1 Bahan Penelitian
Bahan yang akan digunakan pada penelitian ini adalah Tamanu Oil.
4.6.2 Bakteri Uji
Bakteri uji yang digunakan pada penelitian ini adalah Propionbacterium Acnes. Bakteri ini diperoleh dari Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang
4.6.3 Alat Penelitian
- Hotplate - Gelas ukur
- Beaker Glass - Kertas Perkamen
- Batang Pengaduk - Stamper
- Cawan Porselain - Mortir
-
- Mortir - Pipet tetes 4.6.4 Bahan Formulasi Emulgel
Bahan penelitian yang digunakan meliputi Tamanu Oil, CMC Na , Propilenglikol, Butil Hidroxy Toluena, Polysorbate 80, Sorbitan monolaurate 20, Metil Paraben, Propil Paraben, dan aquadest.
4.6.5 Formulasi Emulgel
Tabel IV. 1 Formulasi Emulgel
No Bahan Fungsi
F0
(%) Formula I (%)
Formula II (%)
Formula III (%)
1 Tamanu Oil Bahan Aktif - 5 5 5
2 CMC Na Gelling
agent
2 2 2,5 3
3 Propilenglikol Humektan 5 5 5 5
4 Butil Hidroxy Toluena
Antioksidan 0,1 0,1 0,1 0,1
5 Metil Paraben Pengawet 0,1 0,1 0,1 0,1
6 Propil Paraben Pengawet 0,1 0,1 0,1 0,1
7 Polysorbate 80 Emulgator 5,31 5,31 5,31 5,31
8 Sorbitan monolaurate 20
Emulgator 4,69 4,69 4,69 4,69
9 Aquadest Pelarut 76,7 76,7 76,2 75,7
4.6.6 Skema Cara Pembuatan Emulgel
Gambar 4. 2 Skema cara pembuatan 4.7. Tahap Persiapan
4.7.1 Preparasi Media 1. Nutrient agar
Dalam penelitian ini digunakan satu media yakni Mueller Hinton Agar (MHA). Pembuatan media Mueller Hinton Agar (MHA) dengan melarutkan bahan sebanyak 38 gram (dengan komposisi : Meat infusion solid form 300g/l, Casein acid hydrolysate 17,5 g/l, Starch 1.5 g/l dan Agar 15 g/l) kedalam 1 L aquadest 1 L. Erlenmeyer diletakkan diatas hot plate kemudian masukkan magnetic stirer kedalam erlenmeyer untuk mempercepat pelarutan sampai didapatkan larutan media menjadi berwarna kuning jernih. Setelah itu erlenmeyer di aluminium foil kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada
Disiapkan semua alat dan bahan
Dikembangkan gelling agent CMC-Na+ aquadest dalam
mortir Fase air: PG, tween 80, nipagin,
aquadest. Campur ad homogen
Fase minyak: Tamanu oil, BHT, span 20 dan nipasol.
Aduk ad homogen
Fase minyak dimasukkan ke dalam fase air sedikit demi sedikit. Gerus ad terbentuk
emulsi yang homogen menggunakan homogenizer
Campuran emulsi dimasukkan ke basis gel sedikit demi sedikit. Gerus perlahan ad
terbentuk emulgel
suhu 121°C. Dituang media steril ke cawan petri steril secara aseptis (Hafsan et.
al., 2015).
2. Nutrient Broth
Media nutrient broth dibuat dengan melarutkan bahan nutrient broth (Beef infusion form, starch, casein acid hydrolysate) sebanyak 21 gram kedalam 1 L aquadest dan dipanaskan sambil dikocok dengan menggunakan pengaduk magnetik hingga homogen. Larutan tersebut dimasukkan kedalam labu erlenmeyer dan ditutup dengan kapas dan aluminim foil kemudian di sterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 °C.
4.7.2 Pembuatan Standart Mc Farland
Diambil aquadest kira-kira setengah dari tabung reaksi. Kemudian tambahkan H2SO4 1% sebanyak 9950 μL dan BaCl2 1% sebanyak 50μl.
Campur kedua larutan dalam tabung tersebut, dikocok sampai homogen dan terbentuk larutan keruh. Kekeruhan ini dipakai sebagai suspensi bakteri dengan 4.7.3 Preparasi Bakteri
Proses peremajaan bakteri yang berasal dari biakan murni diambil 3-4 ose kemudian dioleskan pada media Mueller Hinton Broth (MHB). Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C. Sebelum membuat suspensi bakteri, siapkan terlebih dahulu standar McFarland 0,5 yang setara dengan jumlah perkiraan suspensi bakteri yaitu 1,5 x 108 CFU/ml (Ningsih et. al., 2013).
Kemudian dilakukan pembuatan suspensi bakteri dengan teknik dilusi (pengenceran). Bakteri uji diambil dari hasil peremajaan menggunakan mikro pipet kemudian dimasukkan ke dalam 5 ml aquades steril (tabung A), dikocok menggunakan vortex dan dibandingkan dengan standar McFarland 1,5 x 108 CFU/ml (Ningsih et. al., 2013).
Untuk pengujian dilakukan pencampuran biakan pada media yang MHA di cawan petri yang diambil sebanyak 1 ml menggunakan mikro pipet kemudian diaduk secara merata.Kemudian dilanjutkan pencampran sampai habis. Setelah selesai bakteri dii inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam (sehari)(Hafsan et. al., 2015).
4.8. Uji Aktivitas Antibakteri
4.8.1 Uji daya Hambat Bakteri dengan Metode Sumuran
Prosedur pengujian pada bakteri Propionibacterium acnes secara difusi cakram dilakukan dengan cara yang pertama menyiapkan 3 formula emulgel dengan variasi gelling agent CMC Na masing-masing 2%, 2,5%, 3% dengan kadar Tamanu Oil 5%, kontrol positif (Klindamisin 1,2%) dan kontrol negatif (F0), kemudian menyiapkan media Nutrient agar yang sudah padat dan bakteri Propionibacterium acnes yang telah diremajakan. Lalu, membandingkan jumlah koloni pada peremajaan bakteri Propionibacterium anes dengan standar McFarland. Kemudian, dituang media MHA dengan ketebalan 4 mm atau sebanyak 25 ml kedalam cawan petri yang berisi 1 ml biakan bakteri.
Dihomogenkan dengan cara menggoyangkan cawan petri, ditutup dan dibiarkan memadat ± 10 menit. Lalu, dibuat lubang sumuran dengan blue tip steril dengan diamerer 6 mm yang ditekan pada permukaan media. Dimasukkan sediaan emulgel kedalam lubang sumuran masing-masing sebanyak 0,1 g. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Dilakukan pengamatan aktivitas antibakteri dengan melihat zona bening yang terbentuk disekitar kertas cakram dan diukur dengan menggunakan jangka sorong.
4.9 Metode Analisis
Analisis data pada pengujiana antibakteri dilakukan secara deskriptif dengan melakukan pengukuran terhadap diameter zona hambat dari daerah berwarna bening dari masing-masing komponen senyawa pada sediaan emulgel Tamanu Oil terhadap bakteri Propionibacterium acnes dengan menggunakan alat jangka sorong. Daerah berwarna bening di sekitar cekungan diukur menggunakan jangka sorong dengan menghitung diameter daerah yang berwarna bening. Hasil pengukuran tersebut merupakan diameter zona hambat dari sediaan emulgel tamamu oil terhadap bakteri Propionibacterium acnes.
Kemudian dilakukan uji statistik dengan metode One Way Anova menggunakan software Statistical Product and Service Solution (SPSS), dengan derajat kepercayaan 95% (α = 0,05).
