Jurnal Penelitian Sains Edisi Khusus Desember 2009 (D) 09:12-15
Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase
dari Sumber Air Panas Danau Ranau Sumatera Selatan
Muharni
Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan, Indonesia
Intisari: Penelitian tentang isolasi dan identifikasi bakteri termofilik penghasil kitinase dari sumber air panas Danau Ranau Sumatera Selatan dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan isolat bakteri termofilik penghasil kitinase. Bak-teri diisolasi dari lokasi sumber air panas Kota Batu Kecamatan Banding Agung, Kabupaten Ogan Komering Ulu Selatan dan skrining dilakukan dengan menggunakan media agar kitin. Hasil penelitian didapatkan dua isolat yang mampu menghasilkan kitinase dengan indeks kitinolitik 0,89 dan 1,25. Berdasarkan karakteristik morfologi dan fisiologi isolat, menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri termofilik penghasil kitinase yang diidentifikasi termasuk ke dalam genus Bacillus
Kata kunci: kitinase, bakteri termofilik
Abstract: The research on isolation and identification of chitinase producing thermophilic bacteria from Lake Ranau hot springs of South Sumatra has been done to get isolate of chitinase producing thermofilic bacteria. Bacteria were isolated from Kota Batu hot springs, Banding Agung district, South OKU Residence and screening by chitin solid media. The results of this research were found two isolates that can produce chitinase by chitinolytic index 0.89 and 1.25. Based on morphological and physiological character, shows that both isolates chitinase producing thermofilic bacteria identified as a member of genusBacillus.
Keywords: chitinase, thermophilic bacteria
Desember 2009
1 PENDAHULUAN
M
ikroorganisme termofilik mampu mensintesismolekul stabil pada kondisi panas, termasuk molekul enzim. Bioteknologi umumnya tertarik pada enzim dari mikroorganisme yang mendukung untuk bekerja dibawah kondisi normal dimana enzim dari mikroorganisme mesofilik akan mengalami denaturasi. Dengan alasan inilah enzim ini menjadi sasaran terma-suk kelayakannya sebagai model untuk penelitian dan penyelidikan protein-protein yang bersifat termosta-bil dan kemampuannya sebagai biokatalis pada biote-knologi modern[1].Aplikasi enzim didalam bioteknologi semakin me-nuntut enzim yang bersifat tahan lingkungan. Karena faktor utama yang paling merusak enzim adalah suhu, maka usaha pertama yang akan dilakukan adalah men-cari mikroba penghasil enzim-enzim termofilik dari berbagai sumber alam[2]. Hal ini berkaitan dengan
keuntungan yang akan diperoleh bila proses produksi dilakukan pada suhu tinggi, diantaranya adalah me-ngurangi kontaminasi, meningkatkan kecepatan trans-fer massa dan menurunkan viskositas dari larutan[3].
Kitinase adalah enzim yang mendegradasi kitin
menjadi N-asetilglukosamin, degradasi kitin dapat dilakukan oleh organisme kitinolitik dengan meli-batkan enzim kitinase. Organisme pendegradasi kitin umumnya berasal dari kelompok mikroorganisme di-antaranya adalah dari kelompok bakteri. Bakteri yang dilaporkan memiliki aktivitas kitinolitik adalah seperti, Vibrio furnissi[4], Serratia marcescens[5],
Bacillus circulans danPseudomonas aeruginosa[6].
Enzim kitinase yang dihasilkan oleh mikroorga-nisme kitinolitik mempunyai potensi tinggi untuk mendegradasi limbah yang mengandung kitin, karena dengan adanya enzim kitinase memungkinkan konversi kitin yang melimpah menjadi produk yang berguna. Bakteri kitinolitik pada bidang pertanian berfungsi sebagai agen biokontrol terhadap fungsi patogen maupun serangga hama yang umumnya memiliki kom-ponen kitin pada dinding selnya[4].
Pada bidang farmasi aplikasi kitinase sangat poten-sial, dimana hidrolisis kitin oleh kitinase menghasilkan N asetil glukosamin yang dapat dikonversi men-jadi hexa-N-kitobiosa yaitu suatu oligosakarida yang memiliki aktivitas antitumor[7]. Sedangkan di bidang
medis kitinase digunakan untuk terapi penyakit yang disebabkan oleh fungi.
c
Muharni/Isolasi & Identifikasi Bakteri . . . JPS Edisi Khusus (D) 09:12-15 Adanya mikroorganisme yang unggul merupakan
salah satu faktor penting dalam usaha produksi en-zim. Oleh karena itu, penggalian mikroorganisme in-digenous penghasil kitinase perlu dilakukan di Indone-sia. Keragaman hayati yang tinggi memberikan pelu-ang ypelu-ang besar untuk mendapatkan mikroorganisme yang potensial untuk dikembangkan sebagai penghasil enzim[8].
Mengingat pentingnya peranan kitinase dalam in-dustri, maka berbagai usaha akan dilakukan untuk meningkatkan produktivitas dan aktivitasnya antara lain, mencari dan mengembangkan mikroorganisme baru yang memiliki kemampuan memproduksi kiti-nase serta menseleksi strain mikroorganisme penghasil kitinase yang tinggi.
Sumatera Selatan mempunyai beberapa sumber air panas, salah satunya adalah Danau Ranau yang ter-letak 260 km dari Kota Palembang memiliki suhu air panas berkisar antara 37,3−63,7◦C yang berpotensi untuk mendapatkan bakteri termofilik. Mengingat be-sarnya potensi pemanfaatan aktivitas kitinase pada industri, maka perlu dilakukan penelitian untuk men-cari isolat-isolat lokal yang selama ini belum banyak dilakukan, khususnya dari ekosistem sumber air panas Danau Ranau. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan isolat bakteri termofilik penghasil kitinase dari sumber air panas Danau Ranau, Suma-tera Selatan
2 METODE PENELITIAN
2.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari - April 2007, di Laboratorium Mikrobiologi dan Laborato-rium Genetika & Bioteknologi Jurusan Biologi FMIPA Universitas Sriwijaya.
2.2 Bahan yang digunakan
Bahan yang digunakan dalam penelitiaan ini an-tara lain, sampel air panas Danau Ranau, medium Luria Bertani, medium agar kitin, media uji fisiologis (medium triple sugar iron agar (TSIA), medium si-mon sitrat, medium indol, medium semi solid, medium MR-VP broth, medium urea broth), reagen pewar-naan Gram (pewarna Gram A, Gram B, Gram C dan Gram D) dan pewarna endospora (Malachite Green dan Safranin).
2.3 Cara Kerja
Isolasi Bakteri Termofilik Sampel diambil dari air yang berasal dari sumber air panas dengan cara menggerus batu-batuan atau sedimen yang terdapat di dalam air, lalu dimasukkan kedalam botol sampel yang
berukuran 250 ml. Sampel air yang telah diambil dis-uspensikan sebanyak 10 ml ke dalam 90 ml larutan fisi-ologis steril sampai homogen dan dilakukan pengence-ran sampai 106. Diambil 1 ml sampel dan dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian dituangkan media agar yang masih cair dan mempunyai suhu±40◦C banyak 10 ml. Setelah media membeku diinkubasi se-lama 48 -72 jam pada suhu 60◦C. Koloni bakteri yang tumbuh dan mempunyai karakter morfologi berbeda ditetapkan sebagai isolat terpilih untuk dilanjutkan uji aktivitas protease.
Seleksi Isolat Termofilik Penghasil Kitinase Isolat-isolat yang diperoleh pada tahap isolasi, dipin-dahkan ke media agar kitin dengan cara dibotolkan, dan biarkan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 60◦C. Isolat bakteri yang menghasilkan kitinase ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloni, selanjut-nya zona bening yang terbentuk diukur diameterselanjut-nya untuk ditentukan indeks kitinolitiknya. Semua isolat bakteri termofilik yang menghasilkan kitinase selan-jutnya akan dikarakterisasi.
Karakterisasi Bakteri Termofilik[9] Karakteri-sasi isolat bakteri termofilik penghasil kitinase me-liputi, makroskopis koloni, mikroskopis sel, motilitas dan uji biokimia
• Makroskopis koloni seperti, bentuk , elevasi dan tepian koloni.
• Mikroskopis sel seperti, bentuk sel, sifat Gram dan ada tidaknya endospora.
• Motilitas
• Uji Biokimia seperti, Hidrolisis pati, hidrolisis kasein, fermentasi glukosa, fermentasi sukrosa, fermantasi laktosa, produksi H2S, produksi
in-dol, produksi urease, produksi katalase, uji metil merah, uji Voges-Prokauer, uji TSIA, uji Sim-mon’s sitrat.
Identifikasi Hasil karakterisasi dari masing-masing isolat diidentifikasi dengan menggunakan Bergey’s Manual of Determinative Bakteriology
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik Penghasil Kitinase
Hasil isolasi dan seleksi bakteri termofilik penghasil kitinase dari sumber air panas Danau Ranau, diper-oleh 8 isolat bakteri termofilik seperti yang terdapat pada Tabel 1.
Muharni/Isolasi & Identifikasi Bakteri . . . JPS Edisi Khusus (D) 09:12-15 Tabel1: Hasil Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik
Peng-hasil Kitinase
No Kode Aktivitas Indeks
Isolat Kitinase Kitinolitik
Pada tabel 3.1 dapat dilihat bahwa sebanyak 8 lat bakteri termofilik yang didapatkan hanya 2 iso-lat bakteri termofilik yang memiliki aktivitas kiti-nase, dengan indeks kitinolitik tertinggi pada iso-lat CN1 sebesar 1,25 dan yang terendah pada isoiso-lat CN5 sebesar 0,89. Adanya aktivitas kitinase ditandai dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni bak-teri pada mdium agar kitin (Gambar 1). Zona bening terbentuk karena terjadinya pemutusan ikatanβ−1,4 homopolimer N-Asetilglukosamin pada kitin oleh kiti-nase menjadi monomer N-asetilglukosamin. Perbe-daan indeks kitinolitik dari isolat disebabkan perbe-daan aktivitas enzim kitinase dari masing-masing iso-lat tersebut. Susi[10] menyatakan bahwa, besarnya
zona bening yang dihasilkan tergantung pada jum-lah monomer N-asetilglukosamin yang dihasilkan dari proses hidrolisis kitin dengan memutus ikatan β −
1,4 homopolimer N-Asetilglukosamin. Semakin besar jumlah monomer N-asetilglukosamin yang dihasilkan maka akan semakin besar zona bening yang terbentuk di sekitar koloni
Gambar 1: Aktivitas kitinase isolat bakteri termofilik pada medium agar kitin setelah 48 jam inkubasi pada suhu 60◦C. Keterangan: 1 = isolat CN1, 2 = isolat CN5
Kitin sebagai substrat juga akan menginduksi akti-vitas enzim kitinase, enzim juga diatur melalui pe-ngendalian genetis yang melibatkan induksi sintesis enzim pada taraf genetis. Untuk terjadinya sintesis en-zim dibutuhkan suatu induser yakni berupa substrat atau senyawa yang sekerabat dengan substrat dari reaksi yang dikatalis oleh enzim tersebut. Wang dan Chang[11]menyatakan, bakteri menghasilkan kitinase
untuk menghidrolisis kitin yang akan dimanfaatkan oleh mikroba sebagai sumber karbon.
3.2 Karakterisasi Bakteri Termofilik Penghasil Kitinase
Hasil karakterisasi makroskopis koloni, mikroskopis sel, motilitas dan uji biokimia dari isolat bakteri ter-mofilik penghasil protease dapat dilihat pada Tabel 2.
Hasil karakteristik makroskopis menunjukkan bahwa bentuk koloni bulat dengan tepian bervariasi serta elevasi low convex dan convex, mikroskopis sel diketahui sel berbentuk batang, Gram positif dan memiliki endospora, uji motilitas menunjukkan 1 isolat bersifat motil dan 1 isolat nonmotil, dan uji biokimia semua isolat menunjukkan sifat fisiologis yang sama. Berdasarkan karakter tersebut semua isolat termasuk kedalam genusBacillus.
Bacillusmerupakan genus yang sering dijumpai dari kelompok bakteri termofilik yang berhasil diisolasi dari berbagai tempat yang bersuhu ekstrim. Seperti yang telah dinyatakan oleh Brock & Madigan[12],
Bacillus merupakan jenis yang sering dijumpai pada kisaran suhu yang luas. Bacillus mampu hidup pada suhu minimum 30◦C, optimum 60◦C dan maksimum 72◦C dan menghasilkan enzim secara ekstraseluler.
4 KESIMPULAN
Isolasi dan identifikasi bakteri termofilik penghasil kitinase dari sumber air panas Danau Ranau Suma-tera Selatan, diperoleh 2 isolat yang mampu meng-hasilkan kitinase dengan indeks kitinolitik tertinggi sebesar 1,25 dihasilkan oleh isolat CN1, dan isolat CN5 dengan indeks kitinolitik sebesar 0,89. Kedua isolat bakteri termofilik yang mampu menghasilkan kitinase tergolong dalam genusBacillus.
DAFTAR PUSTAKA
[1]Andrade, C.,M.M.C Nei Pereira Jr., & G. Antranikian,
1999, Extremely thermophilic microorganisms and their polymerhidrolytic enzyme,a reviews, Department of Technical Microbiology, Technical University Hamburg Germany
[2]Suhartono, M.T., 2000, Exploration Of Indonesian
Thermophiles Producing Thermostable Chitinolytic Enzymes,Report, Research Center For Biotechnology, Bogor Agric. University, Bogor
Muharni/Isolasi & Identifikasi Bakteri . . . JPS Edisi Khusus (D) 09:12-15 Tabel2: Hasil karakterisasi bakteri termofilik penghasil kitinase
Karakter Isolat Isolat CN1 Isolat CN2
Makroskopis koloni Irreguler, Circuler, Echinulate , Echinulate ,
Crenate , Low Entire ,
convex convex
Mikroskopis Sel Sel berbentuk batang, Sel berbentuk batang,
Gram positif, Gram positif, menghasilkan menghasilkan
endospora endospora
Motilitas Motil Nonmotil
Uji Biokimia
- Hidrolisis pati Positif Positif
- Hidrolisis kasein Positif Positif
- Fermentasi glukosa Negatif Negatif
- Fermentasi sukrosa Negatif Negatif
- Fermentasi laktosa Negatif Negatif
- Produksi H2S Negatif Negatif
- Produksi Indol Negatif Negatif
- Produksi Urease Negatif Negatif
- Produksi Katalase Positif Positif
- Uji metil merah Positif Positif
- Uji V. Proskauer Negatif Negatif
- Uji Simmon’s sitrat Negatif Negatif
Nama Bacillussp.1 Bacillus sp. 2
[3]Kamelia, R., M. Sidumarta dan D. Natalia, 2005, Isolasi
dan Karakterisasi Protease Intraselular Termostabil dan BakteriBacillus stearothermophilusRP1,Makalah Seminar Nasional MIPA, FMIPA Universitas Indonesia, Jakarta
[4]Hirano, S., 1996, Chitin Biotechnology Applications,
Biotechnol Annu Rev, 2 : 237 - 258
[5]Suzuki, K., Taiyoji, N. Sugawara, N. Nikaidou, B.
Henrissat, and T. Watanabe, 1999, The Third Chitinase gene(chi C)ofSerratia marcescens2170 and the Relationship of its Product to Other BacterialChitinases. Biochem. J., 343 : 587 - 596.
[6]Folders, J., J. Algra, M.C. Roelofs, C.L. Leendert, J.
Tommassen, and W. Bitter, 2001, Characterization of Pseudomonas aeruginosa Chitinase a Gradually Secreted Protein,J. Bacteriology, 183 : 7044-7052
[7]Patil, R.S., V. Ghormade, and M.V. Deshpande, 2000,
Chitinolytic Enzymes Exploration,Enzyme and Microbiol. Technol, 26 : 473-483
[8]Akhdiya, A., 2003, Isolasi bakteri Penghasil Enzim
Protease Alkalin Termostabil,Jurnal Buletin Plasma Nutfah, Vol.9, 7 hlm.
[9]Cappuccino, J.G. & N. Sherman, 1992,Microbiology a
Laboratory Manual, 3rd
Edition, The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., California, USA, 462 hlm.
[10]Susi, 2002, Isolasi Kitinase dariScleroderma columnaedan
Trichoderma harzianum,Jurnal Ilmu Dasar, 3(1) : 30 - 35
[11]Wang, S.L. and W.T. Chang, 1997, Purification and
Characterization of Two Bifungsional
Chitinases/Lysozymes Extracellularly Produced by Pseudomonas aeruginosaK-187 in a Shrimp and Crab Shell Powder Medium,Appl. And Environ. Microbial, 63 (2) : 380 - 386
[12]Brock, T.D. & T.M. Madigan, 1991,Biology of
Microorganism, Sixth edition, Pretice hall. International, Inc.
