BAHAN DAN METODE Pembentukan Populasi F-2 Transgenik

# _{Ko r e sp o nd e n si: Balai Pe ne litian Pem u liaan Ikan . Jl. Raya 2} Pan t u r a Su kam an d i, Su b an g 41 2 6 3 , Jawa Bar at , In d o n e sia. Te l. + (0 2 6 0 ) 5 2 0 5 0 0

E-m ail: khai r ul _ syahput r a@ yahoo.com

Tersedia online di: ht t p://ej ournal-balit bang.kkp.go.id/index.php/j ra

TRANSM ISI GEN krt-GP11 DAN PERFORM A KETAHANAN IKAN M AS (

Cyprinus carpio

)

TRANSGENIK F-2 TERHADAP INFEKSI KHV

Khairul Syahput ra#_{, Flandriant o Sih Palimirmo, dan Yogi Himawan}

Balai Penelitian Pem uliaan Ikan

ABSTRAK

Pembentukan ikan mas transgenik merupakan salah satu program penelitian di Balai Penelitian Pemuliaan Ikan, Sukamandi dalam rangka menghasilkan varietas unggul ikan mas tahan infeksi KHV (Koi herpesvirus). Pada tahun 2015 telah dilakukan pembentukan ikan mas transgenik tahan KHV generasi F-2. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi transmisi gen krt-GP11, ketahanan ikan mas transgenik F-2 terhadap infeksi KHV, keberadaan marka Cyca-DAB1*05 tahan KHV pada populasi ikan mas transgenik F-2. Ikan mas transgenik F-2 dihasilkan dengan memijahkan ikan mas transgenik F-1 jantan dengan betina non-transgenik. Pengujian transmisi transgen dan deteksi marka ketahanan KHV pada transgenik F-2 dilakukan dengan metode PCR menggunakan primer spesifik untuk transgen krt-GP11 dan gen Cyca-DAB1*05. Evaluasi ketahanan ikan mas transgenik F-2 terhadap infeksi KHV dilakukan dengan uji tantang secara kohabitasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transmisi gen krt-GP11 pada keturunan F-2 memiliki persentase yang relatif rendah yaitu sebesar 0%-2%. Ikan mas transgenik F-2 memiliki ketahanan relatif baik terhadap KHV dengan sintasan uji tant an g se be sar 90% dan tidak b erbe da n yata d en gan ikan m as pe mb an ding atau no n-tran sgen ik (P> 0,05). Tingginya pesentase keberadaan marka Cyca-DAB1*05 pada populasi transgenik berperan pada ketahanan ikan mas transgenik terhadap infeksi KHV.

KATA KUNCI: ikan mas; KHV; transgenik; uji tantang; transmisi gen krt-GP11

ABSTRACT: Transmission of krt-GP11 gene and resist ance performance of F-2 transgenic common carp (Cryprinus carpio) against to KHV infection. By: Khairul Syahputra, Flandrianto Sih Palimirmo, and

YogiHimawan

Creat ing of t ransgenic common carp is one of t he breeding programs in Research Inst it ut e for Fish Breeding for producing a superior st rain of common carp resist ant t o KHV (Koi herpesvirus). Since 2015, t he creat ion of common carp t ransgenic has been conduct ed t o produce F

2 populat ion resist ant t o KHV. This st udy was aimed t o evaluat e t he

t ransmission of krt -GP11 gen, t he resist ant ce of F

2 t ransgenic common carp against t o KHV infect ion, and t he

exist ence of Cyca-DAB1*05 marker resist ant t o KHV in F₂ t ransgenic populat ion. F₂ t ransgenic populat ion has been produced by mat ing F₁ t ransgenic male wit h non t ransgenic female. Transgene t ransmission and t he exist ence of marker resist ant t o KHV in F₂ t ransgenic populat ion were evaluat ed by PCR method using specific primer t o krt -GP11 gene and Cyca-DAB1*05 gene, respect ively. The resist ance of F₂ t ransgenic populat ion against t o KHV infect ion was evaluat ed by challenge t est using cohabit at ion met hod. The result showed t hat t ransmission of krt -GP11 gene in F₂ t ransgenic population was relat ively low wit h percent age of 0-2%. The resist ance of F₂ transgenic common carp against t o KHV was relat ively high wit h survival rat e of 90% and was not significantly different from non t ransgenic (P> 0.05). High percent age of t ransgenic population having Cyca-DAB1*05 marker had a role in resistance of t ransgenic population against KHV infect ion.

KEYW ORDS: common carp; KHV; transgenic; challenge test; transgene transmission

PENDAHULUAN

Tekno lo gi t ransgenik po t ensial digunakan unt uk m e n in g k a t k a n k e t a h a n a n p e n ya k it p a d a ik a n

penyakit lainnya sepert i int ro duksi gen lakto ferin pada ikan grass carp (Ct enopharyngodon idellus) yang dapat meningkat kan ket ahanan t erhadap virus GCH (Grass Carp Haemorrhage) (Zh o ng et al., 20 02), sedangkan pada ud an g t elah dilakukan o le h Lu & Sun (2 00 5) dengan ment ransfer gen ant isense Taura syndrome vi-rus-coat protein dapat meningkatkan ketahanan terhadap virus Taura. Tid ak hanya ket ahanan t erhadap virus, ketahanan penyakit yang disebabkan bakt eri juga t elah dilapo rkan, sepert i pada ikan channel cat fish (Ict alurus punct at us) (Du n h a m et al., 2 0 0 2 ), ik a n m e d a k a (Sarmasik et al., 2002), dan ikan grass carp (Weifeng et al., 2004). Ke t ahanan t erhadap bakt e ri dan virus juga t elah dilapo rkan o leh Chio u et al. (2014) pada ikan rainbo w t ro ut .

Pe ndekat an t ransgenesis perlu dilakukan unt uk menghasilkan ikan mas t ahan penyakit khususnya Koi H er p esvi r us (KHV). KHV m e r u p a k a n vir u s ya n g imuno genik (gliko pro t ein) t ahan KHV. Beberapa hasil penelitian menyebutkan bahwa gen gliko prot ein dapat meningkat kan ket ahanan ikan t erhadap virus sepert i pada ikan rainbo w t ro ut (LaPat ra et al., 2001; Kim et al., 2000), ikan mas (Kanello s et al., 2006), dan ikan ko i (Emmenegger & Kurat h, 2008).

Pembent ukan ikan mas t ransgenik tahan KHV t elah diawali de ngan pem be nt u kan ikan mas t ransgen ik founder dengan mengint ro duksikan gen gliko pro t ein t a h a n KHV (k r t -GP1 1 ) m e n g g u n a k a n m e t o d e elektroporasi sperma. Pada tahun 2013 telah diperoleh calo n in du k founder jant an yan g po sit if m e mb awa t r an s ge n d i sp e rm a , d an p ad a t ah u n 2 0 1 4 t e lah dipero leh ikan mas t ransgenik F-1 jant an yang po sit if membawa t ransgen di sperma. Berdasarkan hasil uji t ant ang, ikan mas t ransgenik F-1 memiliki daya t ahan t erhadap KHV yang lebih baik dibandingkan ikan no n-t ran s ge n ik d e n gan p e n in gkan-t an sin n-t asan se b e sar 20 ,3 2% (Syahp ut ra et al., 2 01 4). Pada t ah un 2 01 5, kegiat an pe nelit ian lanju t an yan g dilakukan ad alah pe mb en t u kan ikan m as t ransge nik F-2 t ahan KHV. Pe m b e n t u kan ikan m a s t ran s ge n ik F-2 d ilak u kan dengan mengawinkan ikan mas jant an t ransgenik F-1 dengan ikan mas bet ina no n-t rangenik.

mas t ransgenik F-2. Keberadaan marka t ersebut dapat m e me n garu h i ke t ah an an ikan m as t ran sgen ik F-2 t erhadap infeksi KHV selain gen krt -GP11 yang t elah d iin t r o d u k s ik a n . Be b e r a p a p e n e lit ia n t e r b a r u yang membawa gen krt -GP11 pada gamet dipijahkan d e n gan in d u k b e t in a yan g n o n -t ra n sge n ik u n t u k mendapat kan keturunan F-2. Induk yang telah matang go n ad d ip ijah kan d an d it e mp at kan ke d alam b ak pemijahan. Pemijahan dilakukan dengan met o de semi-buat an dan semi-buat an yang disesuaikan dengan ko ndisi kesiapan induk saat pemijahan. Induk diinduksi dengan p e n yu n t ik a n o va p r im u n t u k m e n d a p a t k a n keseragaman kemat angan sperma, t elur, dan o vulasi. Pada induk b et ina o vaprim diberikan dengan d o sis 0 ,3 m L/k g b o b o t , s e d a n g k an p a d a in d u k jan t a n dilakukan penyunt ikan ovaprim dengan dosis 0,15 mL/ kg bo bo t. Pada pemijahan buat an, sel telur, dan sperma d ip e ro leh dari ind u k yan g t e lah d iin jeksi o vap rim dengan cara st riping yang dilakukan 10-12 jam set elah penyuntikan. Lar va dan benih yang dihasilkan dipelihara sesuai dengan SOP pemeliharaan lar va dan benih ikan mas. Lar va dipelihara pada bak pendederan t ahap-1 ukuran 25 m2

dengan kepadat an 800 eko r/m2

m e n gg u n ak an DNA ge n o m yan g d ie k st r aksi d a ri jaringan sirip. Det eksi dilakukan pada 100 eko r benih ikan mas t rasngenik F-2 yang t elah berumur 2-3 bulan ya n g d iam b il se ca ra a cak . Ek st ra ksi DNA ge n o m dilakukan dengan menggunakan kit ko mersial GeneJET DNA Pur ificat ion Kit (The rm o Scie nt ific, Lit h uania), dengan pro sedur mengikut i pro t o ko l yang t erdapat pada manual kit . DNA hasil ekst raksi disimpan pada suhu -20°C hingga dilakukan pro ses amplifikasi PCR. Kemurnian dan kuant it as DNA diukur menggunakan alat GeneQuantTM_1300.

Analisis PCR u nt uk de t e ksi t ran sge n d ilaku kan m e n g gu n ak a n k it Fas t St a r t PCR Ma s t e r (Ro ch e , Jerman) dan primer spesifik unt uk gen krt -GP11 yait u forward: 5’-GCCTTCGTGGCCCTTCCCAC-3’ dan reverse: 5 ’-GGTTGCTCCTGTCCGCCACC-3 ’ d e n gan p an jan g fragmen amplifikasi 480 bp. Ko mpo sisi bahan yang

digunakan untuk amplifikasi PCR adalah 12,5 µL

M as-t er M ix

PCR; 0,375 µL untuk tiap primer (20 µM); 2,5

µL DNA genom dan ditambahkan

w at er PCR-gr ade

hingga total volume 25 µL.

Pr o g r a m PCR ya n g digunakan meliput i: 95°C selama empat menit ; (95°C selama 30 det ik; 64°C selama 30 det ik; 72°C selama sat u menit ) sebanyak 40 siklus; dan 72°C selama t ujuh m e n it . Ha sil a m p lifik a si PCR d is e p a ra s i d e n g a n elekt ro fo resis pada gel agaro se 2% yang t elah diberi pewarna GelRedTM _{(Bio t ium) dan hasil elekt ro fo resis} d ia m a t i p a d a UV t r a n s ilu m in a t o r d a n didokumentasikan menggunakan kamera digital Canon EOS 1100D.

Det eksi M arka Cyca-DAB1*05 pada Populasi Ikan M as Transgenik F-2

Pe n gu jia n in i d ilak u k a n u n t u k m e n g e va lu a s i pengaruh keberadaan marka Cyca-DAB1*05 t erhadap ket ahanan ikan mas t ransgenik F-2 pada infeksi KHV s e la in p e r a n t r a n s g e n k r t -GP1 1 ya n g t e la h diint ro duksi. Det eksi marka Cyca-DAB1*05 dilakukan pada 50 eko r ikan mas t ransgenik F-2 dengan met o de PCR menggunakan primer spesifik unt uk alel Cyca-jaringan sirip menggunakan kit ko mersial GeneJET DNA Purificat ion Kit (Thermo Scient ific, Lit huania), dengan p ro se d u r me n giku t i p ro t o ko l yan g t e rd ap at p ad a manual kit . Pro gram PCR amplifikasi Cyca-DAB1*05 meliput i: 95°C se lama t iga menit ; (95 °C selama 30 det ik; 50°C selama 30 det ik; 72°C selama sat u menit ) sebanyak 30 siklus; dan 72°C selama 10 menit . Hasil am plifikasi PCR m arka Cyca-DAB1 *05 d ivisualisasi dengan pro sedur yang t elah dijelaskan sebelumnya.

Uji Tantang Ikan M as Transgenik F-2

Uji t ant ang dilakukan dengan met o de ko habit asi yang me ngacu pada pro t o ko l n o mo r-3 t ent ang u ji t ant ang ikan mas t erhadap KHV (Pusat Pengembangan Ika n Ma s Na sio n al, PPIMN 2 0 1 2 ). Ik a n u ji yan g digunakan adalah benih ikan mas t ransgenik F-2 yang diambil secara acak pada po pulasi F₂B# 2. Po pulasi F₂B# 2 m e r u p a k a n p o p u la s i t e r in d ik a s i p o s it if membawa gen krt -GP11 di benih. Sebagai pembanding digunakan ikan mas Rajadanu hasil seleksi t ahan KHV yang merupakan koleksi BPPI, Sukamandi dan ikan mas Majalaya t ahan KHV (Man t ap ) yan g d ip e ro le h d ari BBPAT, Su ka b u m i. Pe n g u jia n d ila k u k a n d e n g a n menambahkan sebanyak t iga ekor ikan sumber infeksi KHV pada t iap pengujian. Ikan sumber infeksi KHV dibuat dengan cara menginjeksikan filt rat e homogenat e virus KHV dengan do sis 0,1 mL/eko r. Set elah diinjeksi virus KHV, ikan sumb er dipelihara dalam aku arium berukuran 60 cm x 40 cm x 40 cm dengan kepadat an sat u eko r per lit er air hingga menunjukkan gejala klinis t erinfeksi KHV. Verifikasi ikan sumber t elah t erinfeksi KHV d ilakukan d en gan me t o d e PCR. Analisis PCR d ila k u k a n p a d a b e b e r a p a ik a n s u m b e r ya n g m e n u n ju kkan ge jala klin is t e rin fe ksi KHV se lam a pemeliharaan.

Uji t an t an g d ilaku k an p a d a w ad ah u ji b e r u p a akuarium berukuran 60 cm x 40 cm x 40 cm. Jumlah ikan uji yang digunakan sebanyak 30 ekor per akuarium d e n gan ke p ad at an s at u e ko r p e r lit e r a ir. Se t iap p e rlaku an u ji t an t an g d ilaku kan d e n gan t iga kali ulangan. Suhu air pemeliharaan dikondisikan pada suhu yang permisif bagi perkembangan KHV yait u berkisar 22°C-24°C. Uji tant ang dilakukan selama 14 hari, set iap akuarium pengujian diberikan aerasi yang cukup selama p e n g u jia n . Ika n u ji d ib e r i p a ka n d u a k ali se h a ri menggunakan pakan ko mersial (pro t ein 28%). Pakan diberikan secuku pnya agar ikan uji t e t ap be rt ah an hidup. Penyifo nan dan pergant ian air (sebanyak 50% vo lume air pengujian) dilakukan set iap dua hari sekali unt uk membersihkan sisa pakan. Pengamat an gejala klinis dan m o rt alit as ikan uji dilakukan set iap h ari selama pengujian. Ikan yang mat i selama pengujian d a n s e la n ju t n ya d ila k u k a n p e m e r ik s a a n KHV menggunakan met o de PCR.

Pem eriksaan KHV dengan M etode PCR

2X (Thermo Scie nt ific, Lit huania). Primer PCR yang d igun akan un t u k p e me riksaan KHV ad alah sph l-5 dengan sekuen forward 5'-GAC ACC ACA TCT GCA AGG AG-3' dan reverse 5'-GAC ACA TGT TAC AAT GGT CGC-3 ' d e n g an p a n jan g fr ag m e n am p lifik a s i 2 9 0 b p . Ko mpo sisi bahan yang digunakan unt uk amplifikasi

PCR adalah 12,5 µL

M axima Hot St art Green PCR M ast er M ix (2X)

; 0,5 µL untuk tiap primer (20 µM); 2 µL DNA

genom dan ditambahkan water nuclease-free hingga to tal

volume 25 µL. Proses PCR dilakukan dengan program:

95°C selama empat menit ; (95°C selama 30 det ik; 55°C selama 30 det ik; 72°C selama sat u menit ) sebanyak 40 siklus; dan 72°C selama 10 menit . Hasil amplifikasi PCR dice k d en gan p ro sed u r yan g t e lah dije laskan sebelumnya.

Analisa Data

Dat a t ran sm isi ge n krt -GP1 1 d an p e m e riksaan marka Cyca-DAB1*05 pada po pulasi t ransgenik F-2, sert a dat a hasil deteksi KHV pada uji t ant ang dianalisis secara deskript if. Analisis statistik dilakukan pada dat a sint asan uji t ant ang menggunakan uji one way Anova dengan selang kepercayaan 95%. pemijahan semi-buat an sedangkan F₂B# 1 dan F₂B# 2 dihasilkan dari pemijahan buat an.

Det eksi dan Transmisi Gen krt-GP11 Pada Lar va dan Benih Populasi F-2 Transgenik

Hasil analisis PCR det eksi t ransgen krt -GP11 pada lar va menunjukkan bahwa hanya sat u po pulasi yang po sit if membawa t ransgen di lar va dari lima po pulasi yang dihasilkan, yait u populasi F₂SA# 1. Transgen yang t e rd e t e k s i p a d a p o p u la s i F₂SA# 1 m e n u n ju k k a n pe rsen t ase yan g ke cil, dari lim a samp el p en gu jian dengan masing-masing sam pel t erdiri at as 30 eko r lar va h an ya sa t u s am p e l yan g p o sit if t e rd e t e ks i t ransgen unt uk masing-masing po pulasi (Gambar 1).

Hasil yang relat if berbeda t erdet e ksi pada level benih, berdasarkan analisis PCR menunjukkan bahwa pada po pulasi F₂B# 2 yang negat if t ransgen di lar va namun t erdeteksi pada level benih. Hal ini disebabkan karena transmisi t ransgen yang relatif rendah, sehingga individu t ransgenik yang t erdist ribusi pada po pulasi t ransgenik memiliki persent ase yang kecil. Selain it u, p e n g am b ila n sam p e l yan g d ilak u kan s e cara acak 100 ekor. Transgen yang terdet eksi pada populasi benih F₂B# 2 memiliki persent ase yang kecil yait u dari 100 e ko r yan g d ip e riksa h an ya d u a e ko r yan g p o sit if t ransgen (Gambar 2).

Hasil det eksi t ransgen pada lar va dan benih ikan m as t ransge n ik F-2 m en u njukkan bah wa t ransge n dapat diwariskan at au dit ransmisikan dari F-1 pada generasi F-2, meskipun t idak semua induk F-1 dapat menurunkan t ransgen pada F-2. Transmisi t ransgen dari F-1 ke F-2 leb ih rend ah dib andingkan dengan g e n e r as i s e b e lu m n ya ya it u d a r i f ounder ke F-1 . Tran sm isi t ran sge n p ad a p e n e lit ian in i h an ya 2 %, sedangkan dari founder ke F-1 sebesar 3% (Syahput ra et al., 2014). Transmisi t ransgen pada penelit ian juga be rbed a de ngan t ransmisi t ran sgen pad a ikan m as

Transmisi t ransgen pada ikan mas t ransgenik pada penelit ian ini juga cukup rendah dibandingkan dengan jant an founder t idak ment ransmisikan t ransgen pada ket urunan F-1. Variasi t ransmisi t ransgen pada ikan transgenik juga dilapo rkan o leh Kobayashi et al. (2007), t ransmisi t rangen dari induk F-1 ikan nila t ransgenik pada ket urunan F-2 berkisar ant ara 55%-60%.

t ransgen (tidak terdistribusi mosaik) dan ikan t ersebut dikawinkan dengan non-transgenik akan menghasilkan 5 0 % an akan t ran sge n ik (Figu e ire d o et al., 2 0 0 7 ). Maclean (1998) menambahkan bahwa ident ifikasi ikan t ransgenik akan sulit dilakukan pada po pulasi dengan p e r s e n t a s e t r a n s g e n ik ya n g r e la t if k e cil d a n t erdist ribusi mo saik, kecuali pada po pulasi t ersebut menggunakan penanda yang mudah didet eksi sepert i gene report er.

Uji Tant ang

Berdasarkan hasil uji t ant ang, ikan mas t ransgenik F-2 me miliki ket ahanan t e rh ad ap KHV yang relat if t inggi meskipun t idak lebih baik dibandingkan dengan ikan pembanding atau no n-transgenik. Secara st at istik, t ingkat ket ahanan ikan mas t ransgenik F-2 t erhadap KHV t idak berbeda signifikan dengan ikan pembanding

(P> 0 ,0 5 ). Ikan p e m b an din g m e ru p akan ikan m as Rajadanu dan Majalaya yang membawa marka Cyca-DAB1 *0 5 t e rkait ke t ah anan t e rh ad ap in fe ksi KHV (Ariyant o et al., 2015). Ikan mas t ransgenik F-2 yang d it a n t a n g d e n ga n KHV s e la m a 1 4 h ar i m e m ilik i sin t asan 9 0 %. Pe rfo rm a ke t ah an an KHV ikan m as t ransgenik F-2 lebih baik dibandingkan dengan F₁ dan sedikit lebih rendah dibandingkan dengan generasi founder. Berdasarkan uji t ant ang dengan met o de dan ko n disi yang relat if sama, ikan mas t ransge nik F-1 memiliki sint asan sebesar 85,56% dan founder memiliki sint asan sebesar 98,89% (Gambar 3).

Hasil p e ne lit ian in i me n un ju kkan bahwa selain t ransgen dapat diwariskan, perfo rma ket ahanan ikan mas t ran sgenik t erh adap KHV juga d iwariskan d ari F-1 ke generasi F-2. Beb erapa hasil p ene lit ian lain menyebutkan bahwa karakter ketahanan penyakit pada Gambar 1. Det eksi t ransgen (krt -GP11) pada lima po pulasi lar va ikan mas t ransgenik F₂;

M= marker DNA; (+ )= ko nt ro l po sit if plasmid; 1= F₂B# 1; 2= F₂B# 2; 3= F₂SA# 1; 4= F₂SA# 2; dan 5= F₂SA# 1

Figure 1. Det ect ion of t ransgene (krt -GP11) in five larvae of populat ions F-2 t ransgenic com-mon carp; M = DNA marker; (+ )= posit ive cont rol of plasmid; 1= F

2B# 1; 2=

F

2B# 2; 3 = F2SA# 1; 4= F2SA# 2; and 5= F2SA# 1

1

1 2 + M 3 4 5

480 bp

Gambar 2. Det eksi t ransgen (krt -GP11) pada benih ikan mas t ransgenik F-2; A) po pulasi F₂B# 1 dan B) po pulasi F₂B# 2; M= marker DNA; (+ )= ko nt ro l po sit if plasmid; 1-5= sampel benih ikan mas t ransgenik F-2

Figure 2. Det ect ion of t ransgene (krt -GP11) of j uvenile F-2 t ransgenic common carp; A) F

2B# 1

popula-t ion and B) F

2B# 2 populat ion; M = DNA marker; (+ )= posit ive cont rol of plasmid; 1-5=

j uvenile samples of F-2 t ransgenic common carp M + 1 2 3 4 5

500 bp

M + 1 2 3 4 5

300 bp

500 bp 300 bp

ik an t ran sg e n ik d a p at d iw arisk an p a d a ge n e ra si berikutnya. Chio u et al. (2014) melapo rkan bahwa pada ik a n t r a n s g e n ik r a in b o w t r o u t t e t a p m e m ilik i ket ahanan t erhadap infeksi IHNV dan Aeromonas sp. p ad a g e n e ra s i F-2 d a n F-3 (Ch io u et al., 2 0 1 4 ). Penelit ian lainnya juga dilapo rkan o leh Sarmasik et al. (2 00 2), ikan med aka t ransgen ik p ada gen erasi F-2 memiliki resist ensi t erhadap infeksi bakteri Pseudomo-nas dan Vibrio.

mo lekuler ketahanan terhadap penyakit KHV pada ikan mas. Persent ase keberadaan marka Cyca-DAB1*05 yang kemat ian ikan uji selama uji t ant ang disebabkan o leh infeksi KHV. Se mu a ikan u ji po sit if t erinfeksi KHV berdasarkan analisis PCR (Gambar 5). Hasil pengujian ini juga m enunjukkan bahwa ikan uji yang m ampu Gambar 3. Sint asan (A) dan sint asan harian kumulat if (B) ikan uji hasil uji t ant ang dengan KHV. Sint asan

ikan uji t idak berbeda secara signifikan (P> 0,05) (Bar merupakan st andar deviasi (n= 3)

Figure 3. Survival rat e (A) and cumulat ive daily survival rat e (B) of t est fish aft er KHV challenge t est . Survival rat es of t est fish were not significant ly different (P> 0.05) (Bars are st andard deviat ion (n= 3)) 0

Figure 4. Det ect ion of Cyca-DAB1*05 marker in F-2 t ransgenic common carp; M = DNA marker; (+ )= posit ive cont rol of Cyca-DAB1*05 marker; (-)= negative control; 1-13= sample of F-2 t ransgenic common carp

M - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 +

100 bp 500 bp

bert ahan hidup merupakan ikan mas yang memiliki ket ahanan t erhadap infeksi KHV.

Paramet er lain yang mendukung pada uji t ant ang KHV juga diamat i pada penelit ian ini meliput i gejala klinis dan suhu air pengujian. Berdasarkan pengamat an gejala klinis pada ikan uji selama uji t ant ang, ikan uji yang po sit if KHV dari hasil analisis PCR menunjukkan gejala klinis ikan mas t erinfeksi KHV. Gejala klinis yang t eramat i pada ikan sakit dan mat i meliput i respo ns ikan uji t erhadap pakan berkurang, ikan lemah, dan gerakan lamban, dapat bergerak sangat akt if, sering naik ke permukaan air, insang pucat memut ih dengan banyak lendir, kulit memar, dan melepuh. Gejala klinis yang t eramat i pada penelit ian ini sama sepert i yang dilapo rkan o leh Gray et al. (2002), Sano et al. (2005), dan Sunart o et al. (2005).

Suhu air yang terukur selama pengujian berada pada kisaran yang permisif bagi perkembangan KHV yait u b e rkisar an t ar a 2 0 °C-2 2 °C. He d rick et al. (2 0 0 0 ), Haenen et al. (2004), dan Sano et al. (2004) melaporkan b a h w a s u h u o p t im a l p e r k e m b a n g a n KHV ya n g menyebabkan kemat ian pada ikan mas berkisar antara 16°C-25°C. Gillad et al. (2003) menambahkan bahwa KHV dapat t umbuh pada kisaran suhu 15°C-25°C, suhu o pt imal bagi perkembangan KHV pada kisaran suhu 2 0 °C-2 5 °C ya n g m e n ye b a b k a n k e m a t ia n a t a u mo rt alit as pada ikan mas hingga 90%-95%.

KESIM PULAN

Transmisi gen krt -GP11 pada ikan mas t ransgenik ket urunan F-2 relat if rendah yait u berkisar 0%-2%. Ikan m as t ran sge n ik F-2 m e m iliki ke t ah an an t erh ad ap in feksi KHV yang re lat if t inggi dengan sin t asan u ji

tant ang sebesar 90%. Keberadaan marka Cyca-DAB1*05 be rpe ran t e rh adap ket ahan an ikan m as t ransgen ik t e r h a d a p in fe k s i KHV s e la in t r a n s g e n ya n g dint ro duksikan.

UCAPAN TERIM A KASIH

Penelit ian ini dibiayai o leh Anggaran Pendapat an dan Belanja Negara (APBN) melalui DIPA Tahun Anggaran 2015 di Balai Penelit ian Pemuliaan Ikan, Sukamandi. Terima kasih disampaikan kepada semua t eknisi yang t elah membant u dalam kegiat an penelit ian ini. Terima kasih juga disampaikan kepada dewan redaksi unt uk se m u a sa ra n , m as u k an , d a n p e rb aika n t e rh ad ap makalah ini.

DAFTAR ACUAN

Alimuddin, Mubinun, Sant ika, A., Charman, O., Faizal, I., & Sumant adinat a, K. (2011). Ident ificat io n o f Majalaya co mmo n carp st rains resist ant t o KHV infect io n using Cyca-DAB1*05 allele as t he marker. Indonesian Aquacult ure Journal, 6(2), 157-163. Anderso n, E.D., Mo urich, D.V., & Leo ng, J.C. (1996).

Ge n e t ic im m u n iz a t io n o f r a in b o w t r o u t (Oncorhynchus mykiss) against infect io us hemat o -po iet ic necro sis virus. M ol. M ar. Biol. Biot echnol., 5, 114–22.

Ariyan t o , D., Syahp ut ra K., & Him awan , Y. (20 1 5). Naskah akademik pelepasan variet as unggul ikan m as Rajad an u t ah an p en yakit ko i h e rp e sviru s (KHV). Balai Penelit ian Pemuliaan Ikan. Sukamandi, 90 hlm (Unpublish).

Chio u, P.P., Che n , M.J., Lin , Ch un -Me an ., Kh o o , J., Larso n, J., Ho lt , R., Leo ng, Jo -An n., Tho rgarrd , Gambar 5. Det eksi KHV pada ikan mas t ransgenik F-2 dan no n-t ransgenik (Majalaya) yang mat i

set elah uji t ant ang KHV; M= marker DNA; (+ )= ko nt ro l po sit if KHV; (-)= ko nt ro l negat if; 1-4= t ransgenik; 5-9= no n-t ransgenik

Figure 5. KHV det ect ion in dead fish of F-2 t ransgenic common carp and non-t ransgenic (M aj alaya) aft er KHV challenge t est ; M = DNA marker ; (+ )= posit ive cont rol of KHV; (-)= negat ive cont rol; 1-4= t ransgenic; 5-9= non-t ransgenic

M + 1 2 3 4 5 6 7 8 9

100 bp 500 bp

G., & Chen , T.T. (2014). Pro d uct io n o f ho m o zy-go us t ransgenic rainbo w t ro ut wit h enhanced dis-ease resist ance. M ar. Biot echnol., 16, 299-308. De vlin , R.H., Ye saki, T.Y., Do n aldso n , E.M., & He w,

Choy-Leo ng. (1995). Transmissio n and pheno t ypic effect s o f an ant ifreeze/GH gene co nst ruct in co ho salmo n (Onchorhynchus kisut ch). Aquacult ure, 137, 161-169.

Dunham, R.A., Warr, G., Nicho ls, A., Duncan, P.L., Ar-gue, B., & Middlet o n, D. (2002). Enhanced bact e-rial disease resistance o f transgenic channel catûsh (Ict alarus punct at us), po ssessing cecro pin genes. M ar. Biot echnol., 4, 338–344.

Dunham, R.A. (2009). Transgenic fish resist ant t o in-fect io us diseases, t heir risk and prevent io n o f es-cape int o t he enviro nment and fut ure candidat e genes fo r disease t ransgene manipulat io n. Com-par at ive Immunology, M icrobiology and Infect ious Diseases, 2, 139-161. t ransgenic fish germlines: In vivo evaluat io n of mo -saicism in ze brafish (Danio rerio) using a gre en fluo resncent pro t ein (GFP) and gro wt h ho rmo ne cDNA t ransgene co -inject io n st rat egy. Genet ic and M olecular Biology, 30(1), 31-36.

Gillad , O., Yu n, S., Adkiso n, M.A., Way, K., Willit s, N.H., Berco vier, H., & Hedrick, R.P. (200 3). Mo -lecular co mpariso n o f iso lat es o f an emerging fish pat ho gen, ko i herpesvirus, and t he effect o f wa-t er wa-t emp erawa-t u re o n mo rwa-t aliwa-t y o f e xperimenwa-t ally infect ed ko i. Journal of General Virology,84, 2661– 2668.

Gra y, W.L., Mu llis, L., LaPa t ra S.E., Gro ff, J.M., & Go o dwin, A. (2002). Det ect io n o f ko i h erpesvi-rus DNA in t issues o f infect ed fish. Journal of Fish Diseases, 25, 171-178.

Haenen, O.L.M., Way, K., Bergmann, S.M., & Ariel, E. (2004). The emergence o f ko i herpesvirus and it s significance t o Eu ro p ean aq uacu lt u re. Bull. Eur. t ion can pro t ect Cyprinus carpio against spring vire-mia o f carp virus. Vaccine, 24, 4927-4933.

Kim, H.C., Jo hnso n, M.C., Drennan, J.D., Simo n, B.E., Tho m an n , E., & Le o n g, Jo -An n.C. (20 0 0 ). DNA vaccines enco ding viral glyco pro t eins induce no n-spe cific im mu nit y and m x p ro t e in syn t h esis in fish. Journal of Virology, 74(15), 7048-7054. Ko bayashi, Snin-ichiro , Alimuddin., Mo rit a, T., Miwa,

M., Lu, J., Endo , M., Takeuchi, T., & Yo shizaki, G. (2007). Transgenic nile tilapia (Oreochromis nilot icus) o ver-expressing gro wt h ho rmo ne sho w reduced ammo nia excret io n. Aquacult ure, 270, 427-435. LaPat ra, S.E., Co rbeil, S., Jo nes, G.J., Shewmaker, W.D.,

Lo renzen, N., & Kurat h, G. (2001). Pro t ect io n o f rain bo w t ro ut against infect io us he mat ip o iet ic ne cro sis virus fo ur days aft e r spe cific o r sem i-specific DNA vaccinat io n. Vaccine, 19, 4011-4019. Lu, Y., & Sun, P.S. (2005). Viral resist ance in shrimp pat ibilit y (MH) class II B gene po lymo rphism. Fish & Shellfish Immunology, 26, 737-743. Japan. Bull. Fish. Res. Agen. Supplement, 2, 59-64. Sarmasik. A., Warr, G., & Chen, T.T. (2002). Pro

duc-t io n o f duc-t ransgenic medaka widuc-t h increased resis-t an ce resis-t o bacresis-t erial p aresis-t h o ge n s. M ar. Biot echnol., 4, 310–22.

Syah put ra, K., Himawan , Y., & Ariyant o , D. (20 14 ). Evalu asi ke t ah an an ikan m as (Cypr inus car pio) t ra n s ge n ik ya n g m e m b a wa g e n g lik o p r o t e in t erhadap Ko i Herpesvirus (KHV). Dalam Sugama, K., Kusnendar, E., Rachmansyah, Giri, N.A., Yuhana, M., Krist ant o , A.H., Imro n, Radiart a, I N., & Dewi, R.R.S.P.S (Eds.). Prosiding For um Inovasi Teknologi Akuakult ur. Pusat Penelit ian dan Pengemban gan Perikanan Budidaya. Jakart a, hlm. 1075-1081. Weifeng, M., Yaping, W., Wenbo , W., Bo , W., Jianxin,

F., & Zuo yan, Z. (2004). Enhanced resist ance t o Aeromonas hydrophila infect io n and enhanced ph-ago cyt ic act ivit ies in human lact o ferrin-t ransgenic

grass carp (Ct enopharyngodon idellus). Aquacult ure, 242, 93-103.

Zho ng, J., Wang, Y., & Zhu, Z. (2002). Int ro duct io n o f t h e h u m a n la ct o fe r r in g e n e in t o g r a s s ca r p (Ct enopharyngodon idellus) t o increase resist ance against GCH virus. Aquacult ure, 214, 93-101. Zho ng, C., So ng, Y., Wang, Y., Li, Y., Liao , L., Xie, S.,