DETEKSI FRAGMEN GEN NA PENGKODE NEURAMINIDASE VIRUS AVIAN INFLUENZA A SUBTIPE H5N1 DENGAN TEKNIK REVERSE
TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)
SYLVIA SANCE MARANTINA 0304040745
UNIVERSITAS INDONESIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM DEPARTEMEN BIOLOGI
DEPOK 2008
DETEKSI FRAGMEN GEN NA PENGKODE NEURAMINIDASE VIRUS AVIAN INFLUENZA A SUBTIPE H5N1 DENGAN TEKNIK REVERSE
TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)
Skripsi diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Oleh :
SYLVIA SANCE MARANTINA 0304040745
DEPOK 2008
SKRIPSI : DETEKSI FRAGMEN GEN NA PENGKODE NEURAMINIDASE VIRUS AVIAN INFLUENZA A SUBTIPE H5N1 DENGAN TEKNIK REVERSE
TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)
NAMA : SYLVIA SANCE MARANTINA NPM : 0304040745
SKRIPSI INI TELAH DIPERIKSA DAN DISETUJUI DEPOK, 17 DESEMBER 2008
dr. Fera Ibrahim, M.Sc., Ph.D., Sp.MK. Retno Lestari, M.Si. PEMBIMBING I PEMBIMBING II
Tanggal Lulus Ujian Sidang Sarjana:
Penguji l : Dr. Wibowo Mangunwardoyo, M.Sc. ………. Penguji ll : Dra. Setiorini, M.Kes. ………. Penguji lll : Dr. Abinawanto ……….
With love to Mom and Dad…
What this power is i cannot say; all i know is that it exists and it
becomes available only when a man is in that state of mind which
you know exactly what you want and is fully determined not to quit
until you find it
i
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala rahmat dan anugerah-Nya sehingga penulisan skripsi ini dapat diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada dr. Fera Ibrahim, M.Sc., Ph.D., Sp.MK. selaku Pembimbing l dan Retno Lestari, M.Si. selaku
Pembimbing ll, atas segala bantuan, bimbingan, dan nasehat berharga yang telah diberikan selama penelitian berlangsung hingga penulisan skripsi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Wibowo
Mangunwardoyo, M.Sc., Dra. Setiorini, M.Kes., dan Dr. Abinawanto selaku penguji, atas segala masukan berharga yang telah diberikan dalam penelitian dan penulisan skripsi. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dra. Titi Soedjiarti, S.U. selaku Pembimbing Akademik, seluruh
dosenDepartemen Biologi FMIPA-UI yang telah memberikan ilmu yang bermanfaat, karyawan Departemen Biologi FMIPA-UI, serta teman-teman BALIVEAU’04 yang telah membantu penulis selama menjalani perkuliahan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ketua Pembina dan
Pengurus beserta segenap anggota Yayasan Institute of Human Virology and Cancer Biology of the University of Indonesia (IHVCB-UI), atas kesempatan yang telah diberikan kepada penulis untuk melakukan penelitian di
Laboratorium IHVCB-UI dengan segala fasilitas yang telah disediakan. Penulis mengucapkan terimakasih juga kepada dr. Budiman Bela, Sp.MK.,
ii
drh. Silvia Tri Widyaningtyas, M.Biomed., Aroem Naroeni, Ph.D., Muhareva Raekiansyah, M.Biomed., dan drh. Sofy Melanie atas segala bantuan dan masukan yang telah diberikan selama penelitian berlangsung.
Keluarga merupakan bagian terpenting dalam hidup penulis, yang selalu memberikan kasih sayang yang tulus kepada penulis. Terima kasih penulis sampaikan kepada Papa, Mama, Adik Fhizyel dan Kak Resa tersayang yang selama ini selalu memberi dukungan dan doa yang tulus. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kak Amin Suprayitno dan keluarga, serta Ibu Christine dan keluarga, atas segala dukungan, doa, dan nasehat berharga yang selalu menjadi motivator bagi penulis untuk menjadi orang yang selalu berusaha memberikan yang terbaik untuk orang lain.
Persahabatan adalah hal terindah yang mampu memberikan semangat kepada penulis untuk menjalani kehidupan dengan tetap
tersenyum. Terima kasih kepada Lamtorogung Prayitno, Norvantina Murjito, Tetuko Dito Widarso, Mutiara Haridah, Mulyati Dewi Aisyah, Shilvana,
Wienda Ayu, dan Maryam Rosmilawati yang telah menjadi sahabat terindah dalam hidup penulis. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Elisabeth Ika, Angela Fuzairi, Maman Nurjaman, Yuliar Budi Hartanto, Hartiyowidi Yuliawuri, dan Aditya Perkasa yang telah menjadi teman seperjuangan di Laboratorium. Segala kebaikan yang telah teman-teman berikan akan selalu menjadi kenangan terindah.
Penulis 2008
iii
ABSTRAK
Penelitian deteksi fragmen gen NA virus avian influenza (AI) subtipe H5N1 telah dilakukan menggunakan 4 pasang primer NA yang dirancang oleh peneliti di Laboratorium IHVCB, yaitu NIF64 + NIR320, NIF306 + NIR537, NIF600 + NIR774, dan NIF757 + NIR975. Tujuan penelitian mengetahui spesifisitas dan sensitivitas primer yang telah dirancang dalam mendeteksi gen NA virus AI subtipe H5N1. Teknik two-step RT-PCR
digunakan untuk mendeteksi gen NA virus AI subtipe H5N1. Uji spesifisitas PCR keempat pasangan primer dilakukan menggunakan sampel virus influenza A/chicken/Indonesia/2005 (H5N1); A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1); A/chicken/Indonesia/2007 (H5N1); A/Indonesia/2007 (H3N2); A/Indonesia/2007 (H1N1); bakteri Streptococcus pneumonia, Neisseria
meningitidis, dan Haemophilus influenzae. Uji sensitivitas PCR dilakukan
dengan pengenceran bertahap terhadap cDNA virus influenza
A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1) dengan nilai konsentrasi 0,1 pg/µl-- 10 ng/µl. Hasil penelitian menunjukkan keempat pasangan primer memiliki spesifisitas tinggi terhadap virus AI subtipe H5N1, tidak pada subtipe H1N1 dan H3N2, serta tidak terjadi reaksi silang antara primer dan gen bakteri patogen saluran pernapasan. Pasangan primer NIF306 + NIR537
mempunyai sensitivitas PCR paling tinggi dibandingkan ketiga pasangan primer lainnya karena dapat mendeteksi gen NA dengan nilai konsentrasi
iv
cDNA terendah sebesar 1 pg/µl sehingga paling baik digunakan pada uji diagnostik AI dengan RT-PCR.
Kata kunci: avian influenza, neuraminidase, reverse transcription polymerase
chain reaction (RT-PCR), sensitivitas, spesifisitas.
x + 85 hlm; gbr; lamp; tab Bibliografi: 64 (1990--2008)
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR ... i
ABSTRAK ... iii
DAFTAR ISI ... v
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR TABEL ... ix
DAFTAR LAMPIRAN ... x
BAB I. PENDAHULUAN... 1
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 5
A. Virus Influenza. ... 5
B. Virus influenza tipe A ... 6
C. Avian influenza... 6
D. Patogenisitas avian influenza ... 8
E. Protein neuraminidase virus influenza ... 9
F. Uji diagnostik avian influenza ... 10
1. Kultur virus ... 10
2. Deteksi antigen ... 11
3. Deteksi antibodi spesifik... 11
4. Deteksi genom avian influenza dengan reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) ... 12
vi
H. Perancangan primer dan optimasi PCR... 16
I. Uji spesifisitas PCR ... 17
J. Uji sensitivitas PCR ... 18
K. Visualisasi hasil PCR dengan elektroforesis ... 19
L. Bakteri-bakteri penyebab penyakit saluran pernapasan... 20
1. Haemophilus influenzae ... 20
2. Neisseria meningitidis (meningococcus) ... 21
3. Streptococcus pneumonia (pneumococcus) ... 21
BAB III. BAHAN DAN CARA KERJA ... 23
A. Lokasi dan waktu penelitian ... 23
B. Bahan... 23
1. Sampel... 23
2. Bahan dan reagen... 23
C. Peralatan ... 24
D. Cara kerja ... 25
1. Sintesis cDNA ... 25
2. Purifikasi cDNA ... 26
3. Pengukuran konsentrasi cetakan cDNA... 26
4. Optimasi PCR ... 27
5. Uji spesifisitas PCR... 27
6. Uji sensitivitas PCR... 28
vii
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... 30
A. Kondisi optimal reaksi amplifikasi... 30
B. Analisis hasil uji sensitivitas PCR... 34
1. Analisis hasil uji sensitivitas PCR pasangan primer NIF64 + NIR320 ... 35
2. Analisis hasil uji sensitivitas PCR pasangan primer NIF306 + NIR537 ... 38
3. Analisis hasil uji sensitivitas PCR pasangan primer NIF600 + NIR774 ... 39
4. Analisis hasil uji sensitivitas PCR pasangan primer NIF757 + NIR975 ... 41
C. Analisis hasil uji spesifisitas PCR... 42
1. Analisis hasil uji spesifisitas menggunakan strain H5N1, H1N1, dan H3N2 ... 43
2. Analisis hasil uji spesifisitas menggunakan gen bakteri ... 44
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 47
A. Kesimpulan ... 47
B. Saran ... 47
viii
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Struktur dan genom virus avian influenza subtipe H5N1 ... 57
2. Aktivitas neuraminidase dalam infeksi virus AI ... 58
3. Struktur neuraminidase... 59
4. Prinsip dasar polymerase chain reaction (PCR) ... 60
5. Sintesis cDNA dengan omniscript reverse transcriptase ... 61
6. Haemophilus influenzae (A); Neisseria meningitidis (B); Streptococcus pneumonia (C) ... 62
7. Skema kerja penelitian... 63
8. Visualisasi produk PCR hasil optimasi untuk uji spesifisitas ... 64
9. Visualisasi produk PCR hasil optimasi konsentrasi MgCl2 untuk uji sensitivitas... 65
10. Visualisasi produk PCR hasil uji sensitivitas menggunakan pasangan primer NIF64 + NIR320 (a) dan NIF306 + NIR537 (b) ... 66
11. Visualisasi produk PCR pengulangan ke-4 (a) dan ke-5 (b) uji sensitivitas menggunakan pasangan primer NIF306 + NIR537 ... 67
12. Visualisasi produk PCR hasil uji sensitivitas menggunakan pasangan primer NIF600 + NIR774 ... 68
13. Visualisasi produk PCR pengulangan ke-2 (a) dan ke-3 (b) uji sensitivitas menggunakan pasangan primer NIF600 + NIR774... 69
14. Visualisasi produk PCR hasil uji sensitivitas menggunakan pasangan primer NIF757 + NIR975 ... 70
15. Visualisasi produk PCR hasil uji spesifisitas menggunakan pasangan primer NIF64 + NIR320 ... 71
ix
16. Visualisasi produk PCR hasil uji spesifisitas menggunakan pasangan primer NIF306 + NIR537 ... 72 17. Visualisasi produk PCR hasil uji spesifisitas menggunakan pasangan
primer NIF600 + NIR774 ... 73 18. Visualisasi produk PCR hasil uji spesifisitas menggunakan pasangan
primer NIF757 + NIR975 ... 74
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Primer untuk mendeteksi N1... 76 2. Hasil pengukuran konsentrasi cDNA virus Avian Influenza
A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1) ... 77 3. Hasil uji sensitivitas PCR masing-masing pasangan primer ... 78 4. Hasil uji spesifisitas PCR masing-masing pasangan primer ... 79
x
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Komposisi campuran reaksi sintesis cDNA dengan enzim omniscript
reverse transcriptase ... 81
2. Komposisi campuran reaksi Hot-Start PCR 2 mM MgCl2, 1 µM primer .. 81
3. Komposisi campuran reaksi Hot-Start PCR 4 mM MgCl2, 1 µM primer .. 82
4. Penghitungan volume larutan 25 mM MgCl2 yang harus ditambahkan
ke dalam campuran reaksi PCR ... 83 5. Penghitungan volume larutan 10 µM primer yang harus ditambahkan
