PENDAHULUAN
memilih bibit pejantan, teknik penampungan dan teknologi pengolahan semen yang baik . Melalui teknik IB materi genetik jantan unggul dapat diwariskan, schingga dapat menghasilkan keturunan yang unggul dan dapat ditingkatkan keberadaannya . Menurut Toelihere (198Ia), sekitar 90 % dari volume semen sapi terdiri atas plasma semen . Hal ini menyebabkan sifat lisik dan kimia semen sebagian besar ditentukan oleh plasma semen . Fungsi utama plasma semen adalah sebagai media pembawa sperma kedalam saluran reproduksi hewan betina, sebagai sumber makanan, sumber energi baik secara langsung seperti fruktosa, dan sorbitol, atau tidak langsung seperti gliscrilfosforikolin (Toelihere, 1981a) . Sperma sapi mempunyai ukuran panjang 70 pm (Salisbury dan VANDEMARK, 1985) . GARNER DAN HAFEZ (2000) membagi sperma terdiri dari bagian kepala, akrosom dan ekor . K epala sperma berukuran panjang 7,9-10,3 pm, lebar 4,3-5,5 pill dan tebal 1,2-2,4 µm (SALISBURY DAN VANDEMARK, 1985) . Kepala sperma
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
PEMISAHAN SPERMA PEMBAWA KROMOSOM X DAN Y SAPI
DENGAN KOLOM MEDIA PEMISAH ALBUMIN
ENOKMARDIYAH
Balai Penelitian Ternak Po . Box 221 Bogor 16002
RINGKASAN
Salah satu usaha dalam pengembangan bioteknologi inseininasi buatan (IB) adalah melalui pemisahan sperma pembawa sifat (kromosom) X dan Y . Sperma yang berkromosom X jika bertemu sel telur berkromosom X akan menghasilkan suatu individu yang mengandung kromosom XX, embrio berkelamin betina . Sedangkan sperma berkromosom Y bertemu dengan sel telur berkromosom X akan menghasilkan individu yang berkromosom XY, embrio berkelamin jantan . Berdasarkan perbedaan seks kromosom pada sperma ini diketahui balnva sperma X dan Y mempunyai sifat-sifat yang berbeda . Sperma X bentuknya lebih besar dan gerakannya (motilitas) lebih lambat, sementara sperma Y bentuknya lebih kecil dan gerakannya lebih cepat . Pemisahan sperma pembawa kromosom X dan Y dengan metoda kolom albumin didasarkan atas perbedaan motilitas sperma dimana sperma berkromosom Y mampu bergerak lebih cepat . Dari basil pengamatan, menunjukkan masing-masing untuk konsentrasi albumin 10 % pada fraksi atas dan 30 % pada fraksi bawah, mampu mengubah rasio perolehan sperma normal X :Y (51,50 : 48,50 %) mcnjadi 73,20 : 26,80 % pada fraksi atas dan 31,14 : 68,86 % pada fraksi bawah . Berdasarkan sifat tersebut sperma dapat dipisahkan, sehingga diharapkan dapat meningkalan peluang diemperoleh jenis kelamin ternak yang sesuai dengan keinginan. Kata kunci : IB, kromosom, motilitas, albumin, sperma, fraksi .
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
umumnya berbentuk oval, nucleusnya pipih berisi kromatin padat (GARNET DAN HAFEZ, 2000) . Menurut WANG et al ., (1988), akrosom merupakan lapisan yang menutup ujung arterior nukleus sperma, mengandung enzim hidrolitik untuk menembus dinding ovum saat fertilisasi . Salisbury dan VANDEMARK (1985), membagi ekor sperma atas empat bagian yaitu leher, bagian tengah, bagian utama dan ujung ekor . Karena sel telur merupakan sel haploid hanya mengandung kromosom jenis kelamin X, maka hanya ada dua kemungkinan kombinasi dari garnet dalam suatu fertilisasi yaitu 50% jantan dan 50% betina . Jenis kelamin tersebut ditentukan oleh kromosom pada sperma (KRYZANIAK DAN HAFEZ, 1987) . Skematik dari proses tersebut lihat Gambar 1 .
Berbagai usaha (penelitian) telah dilakukan dalam pemisahan sperma pembawa kromosom X dan Y, antara lain pengendapan sperma dalam media (susu bubuk, glisin, sodium sitrat, gliserol, kuning telur), kecepatan pengendapan, sentrifugasi gradient densitas, manipulasi hormon antigen H-Y, pemfokusan isoelektrik pemisahan dengan kandungan DNA, filtrasi
225 Salah satu bagian penting untuk
mendapatkan kualitas dan
kuantitas spermatozoa sebelum di laksanakannya program lB diantaranya adalah dengan
dengan sephadex dan kolom albumin
(HAFEZ DAN HAFEZ,2000) .
Tujuan kegiatan, diharapkan penggunaan kolom albumin dapat bermanfaat untuk memisahkan sperma pembawa kromosom X dan Y dalam menunjang program IB dilapangan terutama dalam pengembangan inovasi teknologi reproduksi ternak .
MATERI DAN METODA
Alat-alat dan bahan
A . 1 . Alat Penampungan sperms
1 . Satu set vagina buatan . 2 . Termos untuk air hangat . 3 . Termos untuk air panas . 4 . Tabung penampung.
5 . Vaselin atau Jelly .
6 . Thermometer yang berkapasitas 0-100°C . 7 . Gelas piala 800 ml .
8 . Serbet dan kertas tissu .
Tabel 1 . Bahan dan pembuatan media albumin
mati serta pengamatan morfometrik sperma .
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Permntan 2006
Sumber : Laboratorium Reproduksi Balai Penelitian Ternak
A . 2 . Alat Pemisah & Evaluasi sperms I . Mikroskop cahaya binokuler,
kontras .
2 . Gelas ukur, erlenmeyer + beaker gelas berbagai ukuran .
3 . Objek gelas + bilik hitung, penutup gelas, pemanas Bunsen .
4 . Timbangan elektronik . 5 . Counter, mikrometer .
6. Kolom pemisah atau spuit 10 ml 0 1,5 cm + standar pemegang tabung .
7 . Sentrifugasi + tabung .
B . 1 . Bahan dan Pembuatan media albumin 10% dan 30%
Bahan untuk pemisah sperma berupa bagian cair albumin telur ayam kampung dengan pelarut tris sitrat-kuning telur sebagai media pengencer. Untuk mendapat-kan konsentrasi media albumin 10% dan
30% lihat pada Tabel 1 .
fase
NaCI formalin untuk pengamatan tudung akrosom utuh dan perhitungan konsetrasi sperma .
Aquadest, alkohol 70%, minyak imersi . Bahan pengencer sperma, dapat dilihat pada Tabel 2 . Jumlah Bahan Konsentrasi medium 10% Konsentrasi medium 30% Tris hydroxyl methyl amine 2,422 gr 2,422 gr Asam sitrat 1,340 gr 1,340 gr
Fruktosa 1000 mgr 1000 mgr
Streptomycin 100 .000 ugr 100 .000 ugr Penicilin 100 .000 iu 100 .000 iu Kolesterol 40 mg 40 mg Kuning telur 20 ml 20 ml Putih telur 10 ml 30 ml Arc uadest 70 ml 50 ml 2 . .B .2 . Bahan evaluasi/pengamatan sperms
1 . Zat warna eosin
nigrosin untuk
3 . mengamati persentase sperma hidup dan
Tabel 2 . Bahan pengencer sperma
Semen sapi
Sapi jantan dewasa Frishian Holand (FH) dengan umur dibawah 3 tahun, berat badan berkisar 400-500 kg . Ternak dikandangkan dengan ukuran 2 x 3 m . Pakan berupa rumput gajah dan air minum diberikan secara ad libitum, , diberi konsentrat sebagai bahan tambahan secukupnya. Semen ditampung dengan alat vagina buatan dua kali seminggu .
Metoda pengamatan
Langkah-langkah dalam pengamatan meliputi beberapa tahapan, seperti terlihat pada gambar 2 .
A . Penyiapan kolom albumin
Albumin yang tclah dilarutkan dalam Tris sitrat-kuning telur, dimasukkan kedalam tabung pemisah . Untuk lapisan bawah sebanyak 2 ml dengan konsentrasi 30 % dan untuk lapisan atas sebanyak 2 ml dengan konsentrasi 10 % . Diusahakan agar kedua lapisan jangan sampai tercampur .
B . Penyiapan dan evaluasi semen
Semen sapi ditampung dengan menggunakan vagina buatan, hasil tampungan langsung dievaluasi . Evaluasi meliputi : volume, konsistensi, warna, gerakan massa, persentase hidup, konsentrasi dan tudung akrosom .
C. Pemisahan dan penentuan persentase sperma pembawa komosom X dan Y .
C .1 . Pemisahan sperma
Semen sapi yang sudah dievalusi dan mempunyai kualitas yang baik diencerkan dengan tris sitrat-kuning telur dengan
Tennu Teknis Nastonal Tenaga Fungsional Pertanian 2006
Sumber : Laboratorium Reproduksi Balai Penelitian Ternak
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
perbandingan I : 1 . Sampel semen sebanyak I ml dimasukkan dalam spuit yang berisi media pemisah tetes demi tetes dan dibiarkan selama 15 menit pada suhu ruang (27-28 °C) . Setelah 15 menit, 2 ml pertama ditampung kedalam tabung sentrifuge yang telah diisi masing-masing 4 ml larutan tris sitrat pencuci sebagai fraksi bawah, I ml berikutnya dibuang, kemudian 2 ml berikutnya ditampung sebagai fraksi atas . Hasil pena mpungan selanjutnya disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 1500 rpm . Supernatan dibuang, sehingga didapat endapan yang telah bersih dari media pemisahan . Endapan sperma lalu ditambah dengan 0,5 ml larutan pengencer, kemudian diukur volumenya dan dievaluasi mikroskopik .
C . 2 . Penentuan persentase sperma pembawa kromosom X dan V
Untuk mengukur persentase sperma pembawa kromosom X dan Y dilakukan dengan evaluasi morfometrik : mengukur luas kepala sperma dengan membuat preparat ulas (pewarna eosin negrosin) . Pengukuran bagian terpanjang dan bagian terlebar kepala sperma, dilakukan dengan mikroskop cahaya yang dilengkapi mikrometer pada pembesaran 10 x 100 . Jumlah sperma yang dihitung dari tiap-tiap fraksi adalah 50 sperma . Luas kepala sperma dihitung menggunakan metoda Integral Riemann (PURCELL DAN VARBERG, 1987) . Untuk mengetahui hubungan antara ukuran panjang dan lebar dengan luas kepala sperma, digunakan analisis regresi (STEEL DAN TORIE, 1995), dengan rumus
LKS = (0,8988 x P x L)-1,63 Keterangan : LKS = Luas Kepala Sperma
secara
2 2 7
Bahan Jumlah
Tris hydroxyl methyl amine 2,422 gr Asam sitrat 1,340 gr Fruktosa 1000 mgr Streptomycin 100 .000 ugr Penicilin 100 .000 iu Kolesterol 40 mg Kuning telur 20 ml Aquadest 80 ml
0,8988 = Faktor koreksi dari data integral untuk menentukan luas kepala sperma dari setiap satuan ukuran dan metoda regresi untuk menetukan hubungan ukuran panjang dan lebar dengan luas kepala sperma.
1,63 = Nilai konstanta regresi
P = Bagian terpanjang dari kepala sperma L = Bagian terlebar dari kepala sperma
HASIL DAN PEMBAHASAN Semen sapi ditampung dengan menggunakan vagina buatan dan semen basil ejakulasi ke dua diambil untuk pemisahan . Volume semen pada setiap ejakulat 1, 2, 3 dan 4 biasanya berbeda terutama pada ejakulat 2 Iebih tinggi dibandingkan ejakulat I dan 3, hal ini sesuai dengan basil penelitian SITUMORANG dkk, (2000) dan pengamatan E . MARDIYAfi dkk, (2001) . Parameter makroskopis yang diamati adalah volume, warna, dan konsistensi sedangkan untuk parameter mikroskopis adalah gerakan massa, konsentrasi, persentase hidup, TAU, persentase sperma pembawa kromosom X dan Y . Dari delapan kali pengamatan volume semen segar diperoleh basil rata-rata (Rataan ± SD) adalah : 7,13 + 1,56 dengan kisaran 5,57-8,69 ml . Perbedaan hasil volume pada setiap ternak bisa berbeda-beda, diduga disebabkan oleh perbedaan umur, pengaruh individu, berat badan, kondisi dan bangsa ternak seperti dilaporkan oleh (AMIN, 1998) dan
(TOELIHERE 1981b) . Hal ini dapat pula disebabkan oleh faktor makanan, suhu, frekuensi ejakulasi, libido dan psikis
(TOELIHERE, 1981) . Warna semen segar yang diperoleh rata-rata berwarna krem keputih-putihan, dengan konsistensi berkisar agak kental sampai kental . Hal ini tergolong baik dan sesuai dengan pendapat HAFEZ
(2000). Warna semen dapat juga dipergunakan untuk memprediksi konsen-trasi secara cepat . Dalam keadaan normal, semakin kental semen, maka konsentrasi sperma semakin tinggi .
Pengamatan konsistensi memperli-hatkan adanya hubungan dengan konsentrasi spermatozoa dan warna semen . Hasil evaluasi menunjukkan konsistensi semen dari agak kental sampai kental . Semakin
Tenuw Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
kental semen berarti konsentrasi sperma-tozoa semakin tinggi dan warna semen semakin pekat . Gerakan massa spermatozoa merupakan cerminan dari motilitas atau gerakan individu spermatozoa . Penilaian gerakan massa yaitu : + (kurang aktif), ++ (aktif) dan +++ (sangat aktif) . Hasil pengamatan diperoleh gerakan massa +++ sangat aktif , semakin banyak spermatozoa yang bergerak kedepan motilitas semakin besar dan pergerakannya semakin cepat, gerakan massa semakin balk (TOELIHERE
1985) . Pada pengamatan ini perbandingan persentase motilitas sperma segar (sebelum pemisahan) dengan motilitas sperma setelah mengalami pemisahan pada fraksi atas dan fraksi bawah berturut-turut adalah 79,00 ; 72,50 ; 63,75%, sedikit mengalami penurunan dan ini umum terjadi secara alami karena daya hidup sperma yang menurun, waktu prosesing semen dan daya pergerakan sperma . Hasil pengamatan semen segar sebelum dan sesudah pemisahan diperlihatkan pada Tabel 3 .
Motilitas sperma pada fraksi atas Iebih tinggi dibandingkan dengan fraksi bawah hal ini mungkin dipengaruhi oleh penggunaan energi saat pergerakan sperma menempuh konsentrasi media albumin dari fraksi atas ke bawah . Konsentrasi media albumin pada fraksi bawah lebih tinggi dibandingkan fraksi atas, sehingga sperma Iebih banyak mengeluarkan energi untuk menembus fraksi bawah dan motilitasnya menurun bahkan pergerakannya lemah atau tidak bergerak . Konsentrasi semen segar sebelum pemisahan berkisar 1222-2018 juta sperma per ml dengan rata-rata (Rataan ± SD) 1620 + 398 juta per ml . Hal ini mendekati rataan konsentrasi semen segar yang dilaporkan oleh Hafez (2000), yaitu berkisar antara 1000-2000 juta sperma per ml semen . Konsentrasi semen setelah mengalami proses pemisahan dengan kolom albumin pada fraksi atas adalah 427,50 ± 189,89 dan fraksi bawah adalah 335,63 ± 130,40 juta sperma per ml . Total sperma yang diperoleh rata-rata 11.687,50 + 418 juta sperma per ejakulat dengan kisaran 11 .269,50-12 .105,50 juta sperma per ejakulat, sedangkan total sperma pada fraksi atas dan bawah masing-masing adalah 7244,00 ± 955,53 dan 473,07 ± 327,66 . Bila
diperhatikan perbandingan konsentrasi, total semen segar sebelum dan sesudah pemisahan ada penurunan, hal ini disebab-kan adanya sperma yang tertinggal di kolom dan ada sebagian lagi yang terbuang pada saat pembuangan media di antara fraksi atas dan bawah . Konsentrasi sperma dan total sperma pada fraksi atas lebih besar dari pada fraksi bawah, hal ini menunjukkan bahwa sperma yang bermigrasi dari fraksi atas ke fraksi bawah semakin berkurang . Menurut
DIXON et al (1980) jumlah sperma yang masuk kedalam suatu fraksi semen akan berkurang sejalan dengan meningkatnya konsentrasi Bovine Serum Albumin (BSA) yang dapat meningkatkan viskositas pengencer dan hanya sperma yang betul-betul motil dapat menembus media .
Tabel 3 .
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
Persentase sperma hidup (% H) rata-rata dari pengamatan ini cukup tinggi, yaitu 90,38% dengan kisaran 86,8-93,96% lebih tinggi dari standar WHO (1992) yaitu 75% sperma hidup . Persentase hidup mempunyai keterkaitan dengan besarnya motilitas spermatozoa, semakin besar motilitas, persentase hidup spermatozoa juga semakin tinggi . Persentase sperma hidup pada semen segar, fraksi atas dan bawah berturut-turut 90,38 ; 84,13 dan 82,25% ada penurunan terutama setelah mengalami pemisahan, hal ini disebabkan ada sejumlah sperma yang tidak dapat bertahan hidup pada saat perlakuan . Demikian pula terjadi pada perlakuan pemisahan dengan media albumin ada sperma mati setelah menempuh jarak dan terlalu banyak mengeluarkan energi saat melalui media pemisah .
Evaluasi semen secara makroskopis dan mikroskopis, sebelum dan sesudah pemisahan .
Keterangan
' tevaluasi semen gerakan massa dilakukan sebelum pemisahan .
2)
nilai gerakan massa yaitu + = kurang aktif, ++ = aktif, +++ = sangat aktif
Keutuhan tudung akrosom (TAU) sperma mengandung enzim, diperlukan untuk kelangsungan hidup sperma dan keberha-silan dalam membuahi atau memasuki sitoplasma sel telur saat fertilisasi . Pen gama-tan persentase TAU semen segar, fraksi atas dan bawah yang diperoleh berturut-turut adalah 81,87 ; 82,87 dan 88,25% tidak menunjukkan perbedaan nyata, sedangkan persentase sperma TAU pada fraksi bawah lebih tinggi dari pada fraksi atas . Persentase
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
sperma TAU yang diperoleh lebih tinggi dari pada SHARMA et al (1992) dan SAILI (1999) yaitu 74,05 dan 74,51 % . Pengamatan sperma terhadap perolehan sperma berkromosom X dan Y melalui evaluasi morfometrik sperma yaitu mengukur panjang dan bagian terlebar dari kepala sperma dan diamati dibawah mikroskop cahaya dengan bantuan alat micrometer . Untuk menentukan luas kepala sperma sapi digunakan rumus metoda
2 2 9
Penilaian
Sebelum pemisahan Setelah pemisahan Nilai (Rataan ± SD) Nilai (Rataan ± SD) Makroskopis '~ Volume (ml) Warna Konsistensi 7 .13 ± 1,56 Krem keputih-putihan
Agak kental - kental
-Mikroskopis
Fraksi atas Fraksi bawah
Gerakan Massa2) +++
-Motilitas (%) 79,00 ± 4,30 72,50
f
5,30 63,75f
7,40 Konsentrasi sperma (juta/ml) 1620,00 ± 398 427,50t
189,89 335,63f
130,40 Sperma hidup (%) 90,38f
3,58 84,13t
4,50 82,25t
5,70 Sperma dengan TAU (%) 81,87t
13,29 82,87f
10,45 88,25t
4,50 Sperma pembawa kromosom X (%) 51,50 73,20 31,14 perma pembawa kromosom Y (%) 48,50 26,80 68,86integral Riemann (Purcell dan Varberg, 1987) . Rata-rata persentase sperma X dalam semen segar adalah 51,5% dengan kisaran 46,52-56,48%, sedangkan rata-rata sperma Y adalah 48,5% dengan kisaran 43,52-53, 48%, hal ini masih mendekati rasio normal X : Y = 50 : 50% . Setelah mengalami perlakuan pemisahan dengan media kolom albumin rasio persentase sperma X : Y pada fraksi atas yaitu 73,20 : 26,80% dan fraksi bawah yaitu 31,14 : 68,86% .
Untuk rnendapatkan spermatozoa X lebih banyak (73,20%) digunakan fraksi atas dan untuk mendapatkan spermatozoa Y lebih banyak (68,86%) digunakan fraksi bawah . Hal ini didukung oleh penelitian Dhalia (2005) yang melakukan penambahan jumlah kolom media pemisah albumin dapat meningkatkan persentase sperma Y pada fraksi bawah dari 66% menjadi 71,33% . Penelitian yang dilakukan ' oleh PANCAHASTANA (1999) tentang pemisahan spermatozoa dengan putih telur diperoleh persentase spermatozoa Y pada lapisan atas adalah 36,80 ± 8,06% . Dan untuk lapisan hawah yaitu 77,20 f 4,09% . JASWANDI
(1992) melakukan pemisahan pada sperma sapi dengan menggunakan BSA 6% (fraksi atas 3 ml) dan 10% (fraksi bawah 3 ml) menghasilkan inseminasi dengan fraksi bawah mcmperoleh 62 .5% jantan dan 37,5 betina sedangkan pada fraksi atas diperoleh 22,2% jantan dan 77,8% betina . QUINLIVAN
et al., (1982) melaporkan bahwa pemisahan sperma dengan metoda kolom albumin, dapat meningkatkan perolehan sperma Y men jadi 74% dari 25% sebelum pemisahan . Hasil ini diikuti penurunan motilitas men'njadi 74% dari 85 . Hasil evaluasi semen segar baik secara makroskopik dan mikroskopik memberikan gambaran yang normal dan berkualitas baik, selanjutnya dapat diproses lebih lanjut untuk pembekuan semen dan dapat dipergunakan untuk inseminasi buatan .
RESIM PULAN
Spermatozoa X dan Y dapat dipisahkan berdasarkan motilitas .
Dari hasil pengamatan menggunakan konsentrasi albumin 10% pada fraksi atas dan 30% pada fraksi bawah, mampu
Tenm Teknis Nasional Tenaga Fungsional Perianian 2006
mengubah rasio perolehan sperma normal X Y 51,50 : 48,50% menjadi 73,20 :26,80% pada fraksi atas dan 31,14 : 68,86% pada fraksi bawah .
Pemisahan X dan Y sperma dengan kolom albumin diharapkan dapat mening-katkan peluang memperoleh jenis kelamin ternak yang sesuai dengan keinginan .
DAFTAR BACAAN
AMIN, M .R ., (1998) . Efektivitas Plasma Semen Sapi dan berbagai Pengencer dalam Meningkatkan Kualitas Semen Beku Kerbau Lumpur (Bubalus bubalis) . Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
DIXON, K .E ., A . SONGY, Jr . D . M . THRASER and J .L . KREIDER .1980 . Effect of Bovine Serum Albumin on The Isolation of Boar Spermatozoa and Their Fertility . J. Theriogenology . 13
437 .
SITTI DHALIA, P .K ., (2005) . Pengaruh Penambahan Jumlah Kolom Media Pemisah Albumen dalam Meningkat-kan Keberhasilan Pemisahan Sperma X dan Y Sapi serta Kualitas Sperma setelah Pembekuan, Skripsi . Program Studi Biologi . Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam . Universitas Pakuan Bogor .
E . MARDIYAH ., I . S UARIDA ., I .K . PUSTAKA DAN R . HERNAWATI . 2001 . Penampungan dan Evaluasi Mutu Semen Sapi Dengan Vagina Buatan . Prosiding Temu Teknis Fungsional Non Peneliti . hal : 138-145 .
HENDRI . 1992 . Usaha Mengubah Rasio Sperma X dan Y dengan Metoda Kolom Menggunakan Larutan Bovine Serum Albumin (BSA) dan Penilaian Angka Kebuntingan serta Perbandingan Jenis Kelamin Anak pada Kambing . Tesis . Program Pascasarjana . Institut Pertanian Bogor . hlm . 62-63 .
HERMAN, R . DAN A . TJOKRONEGORO .1982 . Pemisahan Sperma X dan Y dengan Albumin Gradient untuk Inseminasi
Buatan guna mempunyai anak Laki-laki . Medika . 2(8) : 107-110 .
GARNER, D .L . AND E .S .E . HAFEZ, 2000 . Spermatozoa and Seminal Plasma . In Hafez and E .S .E . Hafez ed . Reproduction in Farm Animals 7 5d ed. B . Lea and Febiger, Philadelphia . pp . 96-99 .
HAFEZ, F .S .F . AND 13 . HAFEZ, 2000 . X and
Y Chromosome Bearing
Spermatozoa . In B . Hafez and E .S .E . Hafez ed. Reproduction in Farm Animals 7" ed. Lea and Febiger, Philadelphia . pp . 390-393 .
JASWANDI . 1992 . Penggunaan Lapisan Suspensi Bovine Serum Albumin 6 dan 10% Dalam Kolom Untuk Memisahkan Sperma Sapi Pembawa Kromosom X dan Y Guna Mengubah Rasio Seks pada Pedet . .Tesis .
Program Pascasarjana . Institut Pertanian Bogor. him . 28-33 .
KRYZANIAK, L .T . AND HAFEZ, 1987 . X and
Y Chromosome Bearing
Spermatozoa . In E .S .E . 1-lafez ed. Reproduction in Farm Animals5`"ed. Lea and Febiger, Philadelphia . pp . 498-506 .
PARTODIHARDJO, S . 1987 . Ilmu Reproduksi Hewan . Mutiara Sumber Widya . Jakarta. him . 73 .
PURCELL, E .J . AND D . VARBERG, 1987 . Kalkulus Jan Geonretri Analisis . Terj . I .Y . Susila, B . Kartasasmita dan Rawuh . Erlangga . Jakarta . him . 35-38 .
QUINLIVAN . W .L .G ., K . PRECIADO, T .L . LONG AND H . SULLIVAN . 1982 . Separation of Human X and Y Spermatozoa by Albumin Gradient and Sephadex Chromatography . .1. Fertility and Sterility. 37 : 104-149 . SAILI, T . 1999 . Efektivitas Penggunaan
Albumen Sebagai Medium Separasi dalam Upaya Mengubah Rasio Alamiah Spermatozoa Pembawa Kromosom X dan Y pada Sapi . Tesis . Program Pascasarjana . Institut Pcrtanian Bogor . him . 9-42 .
Tennr Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
Pusat Penelitian (/(In Pengembangan Peternakan
SALISBURY, G .W . AND N .L . VANDEMARK, 1985 . Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi Buatan pada Sapi . Terj .R .
Djanuar . Gadjah Mada University Press . Yogyakarta. Him . 447-480 . SHARMA, M .L., G . MOHAN AND K .L . SAHNI .
1992 . A Study on Acrosomal Damage on Cryopreservation of Cross Bred Bull Semen Indian . J. 1'eterinary . 69 : 962-964 .
SITUMORANG, P., E . TRIWULANINGSIH, A . LUBIS ., T. SUGIARTI DAN CAROLINE W . (2000) . Pengaruh Pemberian beberapa Substrat yang didapat tinggi pada Epididymis dan Antioxidant terhadap Daya hidup Spermatozoa yang disimpan dalam suhu 5 °C (Chilling Semen) . Laporan Akhir T .A . 2000 . Balai Penelitian Ternak . STEEL, R .G .D . AND J .1-l . TORIE, 1995 .
Prinsip dan Prosedur Statistika. Terj . B . Sumantri . P .T . Gramedi a Pustaka Utama . Jakarta . him . 168 - 205 . SUMNER, A .T. AND J .A . ROBINSON . 1976. A
Difference in Dry Mass Between the Heads of X and Y Bearing Human Spermatozoa . J. Reprod. Fert . 8 :
9-14 .
TOELIHERE, M .R .1981 . Fisiologi Reproduksi pada Ternak . Angkasa . Bandung . him 64-127 .
TOELIHERE, M .R . 1981a. Fisiologi Reproduksi pada Ternak . Angkasa .
Bandung . him 46-62 .
TOELIHERE, M .R . 1981b . Inseminasi Buatan pada Ternak . Angkasa . Bandung . him 92-115 .
WANG, C ., S .Y . CHAN . M . NG, W .W . So, W .L . TsOI, T . LO AND A . LEUNG . 1988 . Diagnostic Value of Sperm Function Tests and Routine Semen Analysis in Fertile and Infertile Men . J . Androl . Fert . 9 : 384-388 .
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) . 1992 . Laboratory mannual for the Eaxamination of Human Semen and Semen Cervical Mucus Interaction . In Semen analysis . A . D . Agostini . 2003 . Geneva University Hospital .
