PEMBAHASAN
Proses ekstraksi daun ambalun dilakukan dengan metode maserasi. Ekstraksi awal dilakukan dengan pelarut n-heksana yang bersifat nonpolar. Tujuan penggunaan pelarut ini adalah untuk mendapatkan senyawa-senyawa yang bersifat nonpolar. Ekstraksi dengan etil asetat yang bersifat semipolar dilakukan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang bersifat semipolar sedangkan metanol untuk mengekstraksi senyawa-senyawa polar (Harborne 1987).
Perlakuan dengan ekstrak methanol-partisi menyebabkan kematian serangga uji sampai 100%, sehingga ekstrak tersebut diuji lebih lanjut pada enam taraf konsentrasi. Ekstrak n-heksana, n-heksana-partisi, dan etil asetat tidak diuji lebih lanjut karena untuk meningkatkan kematian serangga uji akan diperlukan konsentrasi ekstrak yang lebih tinggi. Penggunaan ekstrak di lapangan pada konsentrasi lebih besar dari 0.5% untuk ekstrak pelarut organik biasanya kurang layak secara ekonomi maupun ekologi, seperti fitotoksik dan dapat beracun terhadap musuh alami (Prijono 1999).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa senyawa aktif ekstrak daun ambalun memiliki sifat penghambat perkembangan yang kuat terhadap serangga. Gejala peracunan yang teramati dalam penelitian ini serupa dengan yang dilaporkan Prijono et al. (2000) dan Syahputra (2001). Gejala peracunan berupa kegagalan ganti kulit mencerminkan bahwa senyawa aktif ambalun mengganggu fungsi hormon yang terlibat dalam pengaturan proses ganti kulit serangga (Prijono
et al. 2000). Proses pergantian kulit dan metamorfosis serangga melibatkan
sedikitnya tujuh jenis hormon, yaitu hormon protorasikoptorik, hormon juvenil, ekdison, hormon pemicu ekdisis, hormon eklosi, bursikon, dan crustacean
cardioactive peptide (Chapman 1998).
Setiap jenis hormon tersebut memiliki fungsi yang berbeda. Terganggunya fungsi salah satu hormon tersebut dapat berdampak pada fungsi sistem hormon secara keseluruhan (Chapman 1998). Adanya gangguan pada fungsi hormon yang mengendalikan perkembangan C. pavonana akan mengakibatkan serangga umumnya mati menjelang atau pada saat ganti kulit (Prijono et al. 2000). Gejala peracunan yang tampak pada penelitian ini serupa dengan pengaruh azadiraktin
32
dari tanaman mimba (Prijono et al. 2001). Mordue et al. (1998) melaporkan bahwa azadiraktin bekerja sebagai ecdysone blocker yang menghambat serangga untuk memproduksi dan melepas hormon-hormon yang terlibat dalam proses metamorfosis. Perry et al. (1998) juga melaporkan bahwa racun azadiraktin bekerja mengganggu proses fisiologi seperti mengganggu nafsu makan atau pertumbuhan serangga. Senyawa aktif yang bekerja mengganggu sistem hormon serangga karena spesifisitasnya yang tinggi akan lebih aman bagi organisme bukan sasaran, sehingga memiliki peluang yang baik untuk dikembangkan lebih lanjut (Syahputra 2001).
Secara umum tingkat kematian larva meningkat dengan semakin tingginya konsentrasi. LC50 danLC95 ekstrak daun ambalun terhadap instar 2+3 lebih rendah
dibandingkan dengan larva instar 2. Hal ini menunjukkan masih terjadi peningkatan kematian yang nyata pada instar 3. Kecenderungan tersebut memperkuat dugaan bahwa senyawa aktif ambalun bekerja sebagai penghambat perkembangan serangga yang kuat, sehingga walaupun hanya instar 2 yang diberi makan daun perlakuan, pengaruh ekstrak tersebut masih terlihat sampai instar 3. Prijono et al. (2000) melaporkan bahwa ekstrak etanol kulit batang ambalun yang sebelumnya diidentifikasi sebagai Aglaia angustifolia dapat menyebabkan gangguan ganti kulit pada larva C. pavonana. Aktivitas yang sama juga terdapat pada ekstrak mimba yang memiliki senyawa aktif azadiraktin (Prijono dan Hassan 1993). Senyawa aktif tersebut mengakibatkan gangguan pada pengaturan perkembangan dan reproduksi serangga.
Nilai LC50 ekstrak daun ambalun pada penelitian ini lebih tinggi
dibandingkan LC50 ekstrak bagian tumbuhan yang lain seperti kulit batang,
ranting, dan tangkai daun. Prijono et al. (1999) melaporkan bahwa LC50 ekstrak
etanol kulit batang ambalun sebesar 112 ppm. Pada penelitian lain, Aliyah et al. (2001) melaporkan bahwa ekstrak kloroform ranting ambalun memiliki LC50
sebesar 108 ppm. Selain itu, LC50 ekstrak daun ambalun pada penelitian ini lebih
tinggi daripada LC50 ekstrak daun ambalun yang dilaporkan oleh Syahputra
(2001). Rendahnya aktivitas ekstrak daun kemungkinan disebabkan rendahnya kandungan senyawa aktif yang terdapat pada daun tersebut dibandingkan kandungan senyawa aktif pada kulit batang dan ranting. Faktor lain yang
33
menyebabkan perbedaan LC50 ekstrak daun pada penelitian ini kemungkinan
disebabkan oleh perbedaan kondisi daun ambalun pada saat pengambilan sampel akibat perbedaan kondisi cuaca dan kesuburan tanah. Leatemia dan Isman (2004) melaporkan bahwa ekstrak biji srikaya (Annona squamosa) dari Namlea, Buru, yang sampel bijinya diambil pada tahun berbeda memiliki aktivitas yang beragam terhadap larva Spodoptera litura.
Fraksi 7 dan 8 yang diperoleh dari hasil fraksionasi ekstrak metanol daun ambalun memiliki aktivitas insektisida paling kuat di antara 10 fraksi yang diperoleh. Nilai LC50 fraksi 8 lebih rendah daripada LC50 fraksi 7, sedangkan LC50
fraksi 7 lebih rendah daripada LC50 ekstrak daun ambalun. Namun LC50 dan LC95
kedua fraksi tersebut tidak jauh berbeda dengan ekstrak metanol-partisi sedangkan rendemen fraksi 7 dan 8 masing-masing hanya 5.92% dan 3.71% (Tabel 4). Hal tersebut menunjukkan bahwa aktivitas insektisida ekstrak kasar bukan hanya disumbangkan oleh kedua fraksi tersebut tetapi juga oleh fraksi lain dan campuran berbagai komponen dalam ekstrak kasar kemungkinan bersifat sinergis.
Minyak mimba digunakan sebagai pembanding positif ekstrak dan fraksi daun ambalun. Hasil uji pendahuluan dengan metode residu pada daun menunjukkan bahwa mimba pada konsentrasi 0.5% dapat mematikan serangga uji 100%. Nilai LC50 dan LC95 mimba terhadap larva C. pavonana lebih kecil
dibandingkan nilai LC50 dan LC95 ekstrak dan fraksi daun ambalun. Hal ini
kemungkinan karena toksisitas senyawa aktif dalam minyak mimba, yaitu azadiraktin lebih tinggi daripada senyawa aktif dalam ekstrak ambalun atau kandungan senyawa aktif dalam ekstrak ambalun lebih rendah daripada kandungan azadiraktin dalam minyak mimba yang digunakan.
Pemeriksaan fitokimia pada serbuk daun dan ekstrak daun ambalun bertujuan mendeteksi keberadaan golongan senyawa alkaloid, flavonoid, triterpenoid, steroid, tanin, dan kuinon pada sampel awal daun ambalun sebelum tahap ekstraksi dan uji pada ekstrak kasar dilakukan untuk mengevaluasi efektivitas pelarut dalam mengekstrak senyawa-senyawa tersebut. Uji alkaloid memberikan hasil positif terhadap serbuk daun dan ekstrak metanol langsung, meskipun secara kuantitatif jumlahnya sedikit. Hasil uji alkaloid ini sesuai dengan penelitian Ismail et al. (2009a) yang melaporkan bahwa daun ambalun memiliki
34
kandungan senyawa alkaloid. Uji triterpenoid memberikan hasil positif untuk serbuk daun, ekstrak n-heksana, n-heksana partisi, metanol, metanol langsung, dan metanol-partisi. Hasil ini sesuai dengan hasil penelitian Ismail et al. (2009b) yang melaporkan kandungan triterpenoid pada daun ambalun. Kandungan senyawa lain yang terdeteksi di antaranya flavonoid pada serbuk daun, ekstrak etil asetat, metanol, metanol langsung, dan metanol-partisi serta steroid pada ekstrak
n-heksana, etil asetat, metanol langsung, dan metanol-partisi.
Hasil analisis dengan GC-MS dan FTIR hanya mendukung dugaan bahwa senyawa aktif yang bersifat insektisida dalam daun ambalun termasuk golongan steroid. Hasil spektrum massa yang dihubungkan dengan GC menunjukkan bahwa fraksi 8 menghasilkan beberapa puncak dengan waktu retensi yang berbeda-beda. Satu puncak yang berhasil diidentifikasi adalah puncak dengan waktu retensi 23.56 menit, karena memiliki kelimpahan yang lebih besar dibandingkan puncak-puncak yang lainnya. Puncak ion molekul (M+) spektrum massa pada puncak tersebut adalah pada m/z 414 (Lampiran 8). Hal ini mengindikasikan bahwa senyawa pada puncak tersebut mempunyai bobot molekul 414.
Pola pemenggalan dari spektrum massa senyawa pada puncak dengan waktu retensi 23.56 menit juga menunjukkan adanya pemenggalan H2O, yaitu pada m/z
396 (M+-H2O) yang mengindikasikan senyawa sterol yang mengandung satu
gugus 3β. Adanya pemenggalan pada m/z 329 (M+-85) dan m/z 303 (M+-111)
(Lampiran 7), mengindikasikan senyawa sterol dengan ikatan rangkap pada posisi C5 (Goad & Akihisa 1997). Berdasarkan database Wiley 7 dan 8, senyawa turunan sterol yang mengadung satu gugus hidroksil pada posisi 3β dan mempunyai ikatan rangkap pada C-5 adalah (23S)-etilkolest-5-en-3β-ol (Gambar 8).
Spektrum FTIR dari fraksi 8 menunjukkan adanya beberapa gugus fungsi. Berdasarkan pengukuran dengan FTIR, dapat terlihat pada daerah sekitar 3600-3100 cm-1 yang memperlihatkan regangan OH, yaitu pada 3445.61 cm-1. Puncak
pada 2942.98 cm-1 menunjukkan uluran simetri metilena (-CH
2-) atau –CH alkana
alifatik. Selain itu, adanya serapan pada 1455.92 cm-1 dan 1379.50 cm-1 menunjukkan vibrasi -CH ke dalam bidang dan spesifik untuk gem dimetil yang terdapat pada fraksi 8 (Pavia et al. 1996).
35
HO
H H
H
Gambar 8 Struktur senyawa (23S)-etilkoles-5-en-3β-ol
Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan Sugita et al. (2000) yang mengisolasi senyawa steroid dari ekstrak Hopea mengerawan yang memiliki aktivitas terhadap rayap Cryptotermes cynochephalus. Sementara itu, Céspedes et al. (2005) melaporkan bahwa beberapa senyawa sterol memiliki aktivitas insektisida dan menghambat perkembangan larva Spodoptera frugiperda dan Tenebrio molitor. Senyawa kimia yang mempunyai potensi sebagai insektisida botani khususnya melindungi tanaman dari serangga pemangsa atau infeksi mikrob umumnya senyawa dengan kerangka terpenoid atau steroid (Harborne 1987).
