ABSTRAK
PENENTVAN KONSENTRASI MINIMAL
(NFUSA DAUN SALAM (Syzigiumpolyanthum IWightl Walp.) SEBAGAI ANTIBAKTERI
DENGAN METODE MINIMAL BACTERICID CONCENTRA TION (MBC) Retna Wulandari, 2004, Pembimbing I : Philips Onggowidjaja, S.Si, M.Si
Pembimbing [( : Diana Krisanti Jasaputra, dr, M.Kes Meskipun terdapat pengobatan modem, beberapa orang cenderung mengandalkan obat altematif, salah satunya adalah tanaman obat seperti daun salam. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk menguji efek antibakterinya. Meskipun demikian, data dari efek antibakterinya dengan metode Minimal Bactericid Concentration ( lvtBC) terhadap Streptococcus pyogenes, Salmonella typhi, Shigella jlexneri, dan Bacillus suhtilis beJum tersedia. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi minimal infusa daun salam sebagai agen antibakteri dengan metode MBC. Penelitian ini bersifat laboratorium eksperimental. Tiga tetes suspensi kuman diteteskan kedalam tabung-tabung yang mengandung campuran nutrient hroth dan infusa daun salam dengan bebcrapa konsentrasi. Campuran tadi diinkubasi selama semalam pada suhu 37°C, lalu ditanam dalam media tertentu. Biakan tadi kembali diinkubasi selama semalam pada suhu 37°C. Hasil ditentukan dari positif atau negatif berdasarkan adanya pertumbuhan. Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi minimal efek bakterisidal terhadap Streptococcus pyogenes, Salmonella typhi, dan Shigellaflexneri berturut-turnt adalah 2 %, 10 %, dan 15 %. Daun salam tidak memberikan efek bakterisidal terhadap Bacillus subtilis. Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa infusa daun salam mempunyai efek bakterisidal terhadap Streptococcu~' pyogenes, Salmonella (vphi, dan Shigella jlexneri, tetapi tidak terhadap Bacillus !wbtilis. Penelitian lcbih lanjut bisa dilakukan dengan menggunakan konsentrasi yang lebih presisi lagi.
Kata kunci : daun salam, agen antibakteri, Minimal Hactericid Concentration
AB..\TRACT
DETERMINA TlON of ,"'([N!J\.JAI. CONCENTRA TlON of INDONESIAN BA Y LEAF INFUSION
( Syzigium polYCl1lthum fWightfWalp.) AS AN ANTIBACTERIAL AGENT
USING MINIJUAL BACTERICID CONCENTRA TION (JUBC) METHODE Retna WuLandari, 2()(){ rt Tutor: Philips Onggowdjaja, S.Si, MSi
1st Tutor: Diana Krisanti Jasaputra, dr, A4.Kes
Despite the modern medication, some people tend to rely on alternative medicine. One of them is the use of herbal medicine, like Indonesian bay leaf Some researches have been per.f()rmed to test its antihacterial e.ffect. However, the data of its antibacterial effect against StreptococCWi pyogenes, Salmonella typhi, Shigella flexneri, and Bacillus subtilis with A{inimal Bactericid Concentration (MBC) have not been available. This research was to determine the mimmal infl/sion concentration of Indonesian bay leaf as an antibacterial agent using MBC methode. The research was laboratoricaL experiment. As much a.'"3drops of germ su...pension was dropped into tubes containing nutrient hroth mixed with some infusion concentrations. The mixtures were incubated 37°Cj()r a night, then were cultured on certain media. The cultures were incubated 3rc for another night. The results were determined as positive or negative based on the presence of growth. They showed the minimal concentrations which bactericidal ejfect against Streptococcus pyogenes, Salmonella typhi, and Shigella flexneri were 2 %, 10%, and 15% respectively. The herb injilsion did not give bactericidal effect against Bacillus subti/is. Ihe conclusions are that Indonesian bay leaf have bactericidal effect against StreptococCllS pyogenes, Salmonella (vphi, and Shigella flexneri, but not against Bacillus subtilis. Further research can be performed
using more precision concentrations.
Keywords : Indonesian bay lecif: antihacterial agent, !vlinimal Bactericid ('oncentrat ion
DAFT AR ISI
LEMBAR PERSETUJUAN
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 11SURAT PERNYATAAN
. . . .. . . .. ... ... ... . .. ... ... ... ... .., ... ... .., ... ... .. . IIIABSTRAK... ... ... .,. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
'" ... ... .., ... ...
iv
ABSTRACT... ... ... .., ... ... ...
v
PRAKATA... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...vi
DAFTAR IS1
... ... ...viii
DAFTAR TABEL... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .xi
DAFTAR GAMBAR... ... ... ... ... xii
DAFTAR BAGAN... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
... ... ... ... .., ... ... ... ... ... ... xivBAB I PENDAHULUAN... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
'" ... ... ... 1 1.1 Latar Balakang.. . ... .. . ... . .. . . . ... .. . ... ... ... . . ... ... . .. ... . . ..
I
1.2 Idcntifikasi Masalah... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
2
1.3 Maksud dan Tuj uan... .., ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...2
1.4 Kegunaan Pene1itian... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .., ... ...
2
1.5 Kerangka Pemikiran... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 2 1.6 Metodc Pcnelitian... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...3
1.7 Lokasi dan Waktu Pcnclitian ... ...
3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
'" ... ... ... 4 2.1 Daun Salam... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 4
2.1.1 Taksonomi Daun Salam dan Beberapa Nama Lain... ... ... ... 4
2.1.2 Tempat Tumbuh... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
'" ... ... ... '" ...4 2.1.3 Morfologi... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
5
2.1.4 Identifikasi... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ."6
2.1.5 Manfaat Daun Salam... ... ... ... ... ... ...
6
2.2 Kandungan Kimia ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .,. ... ... ... 6
2.2.1 Flavonoid ... ... ... ... ... ... ... .,. ... ... 6
2.2.1.1 Flavonoid Secara Umum... ... 6
2.2.1.2 Sifat Flavonoid 7
2.2.2 Tannin 7
2.2.2.1 Tannin Secara Umum... 7
2.2.2.2 Sifat Tannin 8
2.2.3 EugenoL 9
2.2.4 Citral ... . .. ... ." ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .9 2.3 Bakteri-bakteri Patogen... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
10
2.3.1 Streptococcus pyogenes... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... 10
2.3.1.1 Mortologi dan Identifikasi 10
2.3.1.2 Sifat Pertumbuhan... ... ... ... .., ... .., ... ... ... ...
10
2.3.1.3 Daya Tahan Kuman
11
2.3.1.4 Patogenitas... ... ... ... ... ... ... ... .,. ... ... ... ... ... ... ... . 11
2.3.1.5 Gambaran Klinik... ... ... ... ... ... ...
11
2.3. 1.6 Pengobatan... . . ... . .. .. . . .. ... . . . .. . . .. . .. ... . .. .. 12
2.3.2 Shigellaflexneri 12
2.3.2. I Morfologi dan Identifikasi... .., ... ... ... ... ... ... ... ... 12
2.3.2.2 Sifat Pertumbuhan... ." ... ... ... ... ... ... ." ... ... 12 2.3.2.3 Daya Tahan Kuman... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
12
2.3.2.4 Patogenitas... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
13
2.3.2.5 Gambaran Klinik .. 13
2.3.2.6 Pengobatan 13
2.3.3 Salmonella typhi.. . ... .. . .. . . .. .. . . .. ... ... ... ... ... .. . .. . . .. . .. .. . .. .. .. .14
2.3.3.1 Morfologi dan Identifikasi 14
2.3.3.2 Sifat Pertumbuhan... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...14
2.3.3.3 Daya Tahan Kuman 14
2.3.3.4 Patogenitas 14
2.3.3.5 Gambaran Kli ni k... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... .. . ... .. . ... ... ..
15
2.3.3.6 Pengobatan... .. . .. . ... ... ... ... ... ... .. . .. . .. . .. . .. . .. . ... ..
15
2.3.4 Bacillus subtilis ... ..16
2.3.4.2 Sifat Pertumbuhan... ... ... ... ... ... .., ... ... ... .,. .,. ... '" ...16
2.3.4.3 Daya Tahan Kuman ... ... ... 17
2.3.4.4 Patogen itas. . . .. . .. . ... ... ... .. . .. . ... .. . . .. ... ... ..
I7
2.3.4.5 Gambaran Klinik 17
2.3.4.6 Pengobatan 17
BAB III ALA T, BAHAN, DAN METODE PENELITIAN... ... ... ... ... 18
3. 1 Alat -alat... .. . .. . .. . ... ... .. . .. . . .. .. . . .. . .. .. . .. . .. . . .. ... ... ... ... ... ... . .. .. . ..18 3.2 Bahan... ... ... ... ... ... .. . .. . ... .. . ... .. . ... ... ... ... ...
'" ... ... .., ... .. . ... ... ..19
3.3 Metode Penelitian... ... ... ... ... ... ... ... ... .., ... ... ... ... ... ... ... ... ...
21
3.3. I Desai n Pene Ii tian... .. . . .. ... ... ... .., .. . ... ... ... .. . ... ... .. . .. . .. . .. . ... ...
2 I
3.3.2 Prosedur Kerj a... ... . . .. .. . ... ... .., .. . ... ... .. . ... ... .. . . .. . .. . .. .. . .. . ...
2 1
3.3.2.1 Persiapan 21
3.3.2.2 PeneIitian 22
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 24
4.1 Hasil... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .., ... ... ... 24 4.2 Pembahasan... ... .. . ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... .. .
'" ... . .. .. . ... ... ... ...
29
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
30
5.1 Kesimpulan ... ... ... ... ... ... .. . .. ... .. . ... ... .. . .. . ... ... .. . ...
30
5.2 Saran... .. . ... ... . .. . .. .. . .. . . .. . ... .. . ... ... .. . .. . .. . .. . ... ... ... .. . . . .. . ... ..
30
DAFTAR PUSTAKA 31
LAMPIRAN 34
RIWA YAT HIDUP... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 47
Tabel 4. I
Tabel4.2
Tabel4.3
Tabel 4.4
DAFT AR T ABEL
Konsentrasi Minimal Efek Bakterisidal lnfusa
Daun Salam terhadap
Streptococcus pyogenes...
_... ... .24
Konsentrasi Minimal Efek Bakterisidal Infusa
Daun Salam terhadap Shigella flexneri... ... .. . ... ... ... ... .25
Konsentrasi Minimal Efek Bakterisidal Infusa
Daun Salam terhadap Salmonella typhi. _. _.. ..__._... ... ...27
Konsentrasi Minimal Efek Bakterisidal Infusa
Daun Salam terhadap Bacillus subtilis... ... ... ... ... .28
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Daun Salam.. . ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... .. . ... ..5
Gambar 4.1 Pertumbuhan Biakan Streptococcus pyogenes Dipaparkan
terhadap Beberapa Konsentrasi Infusa Daun Salam... ... ... ... ... ..25 Gambar 4.2.1 Pertumbuhan Biakan c\'higellajlexneri Dipaparkan terhadap
Beberapa Konsentrasi Infusa Daun Salam... ... ... ... ... ... .26 Gambar 4.2.2 Pertumbuhan Biakan c')'higellajlexneri Dipaparkan terhadap
Beberapa Konsentrasi Infusa Daun Salam ( Kontrol Negatif)... ..26 Gambar 4.3 Pertumbuhan Biakan Salmonella typhi Dipaparkan terhadap
Beberapa Konsentrasi lnfusa Daun Salam... .,. ... ... ... ...
'" ... ... .27 Gambar 4.4 Pertumbuhan Biakan Bacillus subtilis Dipaparkan terhadap
Beberapa Konsentrasi Infusa Daun salam... ... ... ... ... ... ... ... ... ..28
Bagan
3. t
DAFT AR BAGAN
Cara Kerja Secara Umum... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...21
DAFT AR LAMPIRAN
Lampiran 1 Studi Pendahuluan 1... ... ... ..' ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...35 Lampiran 2 Studi Pendahuluan II... ... ... ... .., ... ... ... ... ... ..37
Lampiran 3 Tes Resistensi Streptococcus pyogenes, Shigella jlexneri. Salmonella typhi. dan Bacillus subtilis
terhadap Beberapa Antibiotik Tertentu
... ... ... ... ... ... ... ... ... ...41Lampiran 4 Foto-foto Tabung Pemaparan [nfusa Daun salam... ... ... ... 44
BARf
PENDAHlILUAN
1.1 Latar Belakang
Penyakit-penyakit infeksi yang disebabkan terutama oleh baktcri terus meningkat dengan semakin majunya teknologi dan kehidupan pada masa kini, mcskipun penemuan obat-obat modem juga ikut bcrkembang pesat. Perkembangan itu mengalami beberapa kendala, diantaranya biaya yang cukup mahal untuk mendapatkan obat tersebut serta efek samping yang cukup berbahaya. Oleh karcna itu, beberapa orang cenderung mengandalkan kepada pengobatan altematif, salah satunya adalah pengobatan tradisional dari tumbuh-tumbuhan yang murah dan mudah didapat, misalnya daun salam.
Sclama ini diketahui bahwa daun salam lebih sering digunakan sebagai bumbu penyedap masakan. Saat ini mulai dikembangkan penggunaan daun salam sebagai obat tradisional. Tidak hanya daunnya saja yang bermanfaat sebagai obat, tetapi akar, buah, dan kulit kayu pohon salam juga ( Anonim 1, 2002 ).
Daun salam
telah diketahui dapat mencegah dan mengobati beberapa penyakit, misalnya diare, kencing manis, tukak lambung, mabuk akibat alkohol, dan kudis ( Anonim 1, 2002 ). Daun salam juga dapat digunakan untuk menurunkan tekanan darah
tinggi, kadar kolesterol dan asam urat tinggi, serta eksim ( Anonim 2, 2003
).Beberapa penelitian telah dilakukan untuk menguji efek antibakteri daun salam terhadap beberapa bakteri patogen penyebab diarc ( Beni, 1990 ). Selama ini data aktivitas antibakteri daun salam dengan metode Minimal Bactericid Concentration ( Ac1BC) terhadap beberapa bakteri patogen seperti S'treptocoCCliS pyogenes, Bacillus subtilis, S'higella flexneri, dan Salmunella typhi masih belurn
tersedia. Oleh karena itu, penelitian dilakukan untuk menguji aktivitas antibakteri infusa daun salam terhadap beberapa bakteri patogen.
2
1.2 Identifikasi Masalah
Berapa konsentrasi minimal infusa daun salam yang clapat membunuh Streptococcus pyogenes, Bacillus suhtili.\', Shigelfajlexneri, dan c,,'ulmonelfu IJphe
1.3 Mak..liud dan Tujuan
Maksud penelitian adalah untuk mempclajari efek antibakteri infusa daun salam terhadap beberapa bakteri patogen. Tujuan penelitian adalah untuk menentukan konsentrasi minimal infusa daun salam sebagai antibakteri dengan metode Minimal Bactericid Concentration ( AfHC ).
1.4 Kegunaan Penelitian
Kegunaan akademik penelitian ini ialah untuk meningkatkan pengetahuan tentang obat tradisional, khususnya daun salam. Kegunaan praktis penelitian ini ialah agar masyarakat dapat memanfaatkan daun salam sebagai obat alternatif antibakteri ( komplementer ).
1.5 Kerangka Pemikiran
Daun salam mengandung tlavonoid, tannin, dan minyak atsiri yang tcrdiri dari eugenol dan sitral ( Midian Sirait., E.Looho., R.Bambang Sutrisno., Sunarto Prawirosujanto., M.Bambang Lesmono., Boediman Poerdhirejo., dkk, 1980 ). Flavonoid, tannin, dan eugenol diketahui memiliki efek antibakteri ( Bruneton,
memiliki efek antibakteri terhadap Streptococcus PJ;,ogene.\', Bacillus suhlilis, Shigella jlexneri, dan Salmonella typhi.
1.6 Metode Penelitian
Penelitian bersifat eksperimental laboratorium dengan menggunakan metode Alinimal Baclericid Concentration ( MRC ).
1.7 Lokasi dan Waktu Penelitian
BABV
KESIMPl1LAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa infusa daun salam memiliki etek bakterisidal terhadap Streptococcus PJ/ogenes, ,')'afmonellu typhi, dan Shigella jlexneri dengan konsentrasi minimal berturut-turut 2 %, 10 %, dan 15 %, tetapi
tidak terhadap Bucillus suhtilis hingga konsentrasi 100 %.
5.2 Saran
Saran-saran yang dianjurkan adalah, sebagai berikut :
a. Masyarakat dapat menggunakan daun salam sebagai obat altematif (komplementer) dalam mengatasi infeksi beberapa bakteri.
b. Pada penelitian selanjutnya dapat dilakukan pada konsentrasi yang lebih presisi lagi dan secara in vivo untuk mcngetahui lama pengobatan.
c. Untuk Racilfu.,,' subtilis dapat dilakukan pada konsentrasi yang lebih tinggi lagi.
OAFTAR PUSTAKA
Aidilfiet Chatim., Agus Sjahrurachman., Amin Soebandrio W.K., Anis Karuniawati., A.U.S. Santoso., B.M. Hasrul Harun., dkk. I993.Mikrohiologi kedokteran.Jakarta: BinarupaAksara. 112-120,126,165-167,168-173.
Anonim I. 2002. Tanaman ohat Indonesia. Sentra lntormasi lPTEK. Available at . http://www.iptek.net.id/ind/cakra obatltanamanobat. php?id=97. March 18th, 2004.
Anonim 2. 2003. Salam, mengobati diabetes, mengusir diare. PT. Cyberindo
Adhitama. Available at
htt :I/c
bermed.cbn.net.id/carikiri.as
?kate tori=natural&newsno=7I.
October 20th, 2004.Anonim 3. 2004. Eugenol. National Toxicology program. Available at: http://ntp-server. niehs. nih. gov/htdocs/Results status/ResstatE/ 10468-1. html. March
18th, 2004.
Anonim 4. 2004. Citral. National Toxicology program. Available at : httD://nto-server.niehs.nih.gov/htdocs/Results status/ResstatC/ 10251-N. html. March
18th, 2004.
Anonim 5. 1999. RRLTMSensi-Disc Antimicrobial S'usceptibility Test Discs ( Brochure ). Maryland, USA: Becton Dickinson and Company.
Anonim 6. 200 I. fvlaterial safety data sheet-infectious substances : Viability. Population and Public Health Branch. Available at : http://www.hc-sc.gc/calpphb-dgspsp/msds-ftss/msds 134e.html. October 20t\ 2004.
Anonim 7. 2004. Bacillus subtilis. Farlex. lnc. Available at . http//encyclopedia.thefreedictionary. com/Bacill us%20subtilis. October 20th, 2004.
Anonim 8. 2004. Specific classification. Farlex. lnc. Available at http://encvclopedia.thefreedictionarv.com/Bacillus. October 20th, 2004.
Anonim 9. 2004. Racillus subtilis. WARD'S Natural Science. Available at : h ://wardsci.com/ roduct.as ? n=850228&sid=OVERTURE&EID=OVOO 6832. October 20th, 2004.
32
Anonim 10. 2004.('omparison of' antibiotics againts Gram-positive,
Gram-negalive and sporef()rmers.Available at
http//www.arches.uga.eduJ~jtestonJantibiotic2.html. October 201\ 2004.
Anonim 11. 2004. S'alam leaves. Google. Available at http://www.makantime.com/cookbook/images/salam leaves. jpg. January 2005.
rd
,) ,
Anonim 12. 2003. fr..,,'/)A Database jhr the flavonoid\' content of selective f()od. Maryland: UFDA. November 6th, 2004.
Arif Aliadi., R. Broto Sudibyo., Ojoko Hargono., Farouq., Sidik., Sutaryadi., dkk. 1996. Salam Tanaman obat pilihan. Jakarta: Yayasan Sidowayah.223.
Bcni Warman. 1990. (lji mikrobiologi ehtrak Eugenia polyanthajhlium terhadap bakteri penyebah diare secara in vivo ( Skripsi ). Padang : JF FMIPA UNAND.
Gemot Katzer. 2001. Indonesian bay-leaf (Fugenia polyantha Wight): ,)ynonims.
Available at
http://www-an .kfuni az.ac.atJ~katzer/en II eneric frame.html?Eu e I.html. March 18 ,2004.
Goossens Herman and Sprenger 1.W. Marc. 1998. Community Acquired Infections and Bacterial Resistance : Streptococcus pyogenes. Available at : http:www.tindarticles.com/p/articles/mi_m0999/is_n7159 _ v3l7/ai_2115970 4. November 12u" 2004.
Jean Bruneton. 1999. Pharmacogn().\~v phytochemistry medicinal plants : Flavonoid~'. Tannins. 2ml edition. Paris: Lavoisier Publishing [nc. 310, 321, 324,370-372,386,388,555.
K. Heyne. 1987. Tumhuhan berguna Indonesia. Jilid [[I. Jakarta: Yayasan Sarana Wana Jaya. 1521.
Lorie Kramer. 2004. The Bacillus subtilis
St02'" Available at http://www.rense.com/genera1l4/bac.htm. October 201 ,2004.
33
Midian Sirait., E. Looho., R. Bambang Sutrisno., Sunarto Prawirosujanto., M. BambangLesmono., Boediman Poerwodhirejo., dkk. 1980. Materia medika Indonesia: f>o(vunthifo/ium. Jilid 4.Jakrta : Departemen Kesehatan Rl.ll3.
Miller, Alan. L. 1996. Antioxidants jluvonoid... : ,\,'tructure, function, and clinicul usage. Available at : http://www.thome.com/altmedrev/fulltextlt1avonoids 1-2html. March 18th, 2004.
Pattnaik S., Subramanyam VR., Bapaji M., Kole CR. 1997. Antihacterial and antifungal activityof aromatic, constituent (?l essential oils. Available at : h ://www.ncbi.nlm.nih. yov/entrez/ ue .fc'i?cmd=Retrieve&db=Pubmed &dopt=abstract7list uids=9218354. March 18th, 2004.
R. Bambang Sutrisno. 1998. Taksonomi .\permatophyta untuk farmasi. Edisi r. Jakarta: Fakultas Farrnasi Universitas Pancasi1a. 152,156.