PENGENALAN DAN PENERAPAN HPLC DALAM ANALISIS INDUSTRI DAN LINGKUNGAN

(1)

PENGENALAN DAN PENERAPAN

HPLC DALAM ANALISIS INDUSTRI

DAN LINGKUNGAN

(2)

“I call such a preparation a chromatogram

and the corresponding method the

chromatographic method.” — M.S. Tswett

(3)

KROMATOGRAFI

FASE GERAK (mobile phase)

UJI

PREPARATIF UJI

(4)

Kategori interaksi

1. Adsorbsi

Senyawa diserap oleh permukaan padatan dan terjadi

keseimbangan jumlah solut pada fasa diam dan fasa gerak

2. Partisi

Lapisan cairan sebagai fasa diam yang diembankan pada

suatu padatan akan mendistribusi senyawa yang akan

dipisahkan dan membentuk keseimbangan dengan fasa

gerak

3. Molekular eksklusi/permeasi gel/gel fltrasi

Pemisahan berdasarkan ukuran molekul, dimana pada

keadaan ideal tidak ada keterikatan senyawa pada fasa diam

4. Penukaran ion

Senyawa ion dengan muatan berlawanan akan terikat pada

fasa diam melalui gaya elektrostatik

5. Afnitas

(5)

Kromatograf kolom

Gambar kolom kromatograf

Kolom terbuat dari gelas diisi dengan fase diam berupa serbuk penyerap (seperti selulosa, silika gel, poliamida). Fase diam dialiri (dielusi) dengan fase gerak berupa pelarut.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatograf kolom adalah:

• fase diam yang digunakan

• kepolaran pelarut (fase gerak), ukuran kolom (diameter dan panjang kolom)

(6)

Kromatografi

KolomiTerbuka

iii

Color

Sistem pemasukan sampel: manual, tidak

volumetrik  Injector

Waktu analisis lama, mengandalkan gaya

gravitasi dan kapiler  pompa

Hasil pemisahan kurang baik  pengemasan

kolom

Kesulitan pengamatan hasil pemisahan untuk

analit tidak berwarna  Detektor

(7)

Komponen HPLC

POMPA ( PENDORONG FASA GERAK)

TEMPAT INJEKSI (AUTO SAMPLER)

KOLOM (FASA DIAM)

(8)

Komponen HPLC

• Sistem pengalir fasa gerak

Mendorong/memompa fasa gerak sehingga bisa

mengalir ke seluruh sistem instrumen dengan laju alir

konstan (0,1-2 mL/menit)

• Injektor/autosampler

Memasukkan sampel ke dalam sistem aliran fasa gerak

• Kolom

Tabung stainless steel yang diisi fasa diam berfungsi

untuk memisahkan komponen-kompone dalam sampel

• Detektor

Sensor optik yang akan mendeteksi perubahan secara

karakteristik solven yang melalui

• Data system

(9)

Pompa untuk optimasi

• _{Butuh 2 pompa tekanan}

tinggi dan pengatur

gradien (mahal)

• _{Dibatasi oleh sistem}

dua pelarut

• _{Laju alir yang berbeda}

(10)

Pompa untuk optimasi

• _{Sistem pelarut yang}

lebih banyak dg

kekuatan dan

selektivitas yang

berbeda (lebih feksibel)

• _{Perubahan laju alir}

teratasi

• _{Hanya butuh 1 pompa}

(murah)

• _{Pelarut disemprotkan}

(11)

Klasifkasi HPLC

1. Partisi (liquid-liquid chromatography)

2. Adsorpsi (liquid-solid

chromatography)

3. Pertukaran ion (ion chromatography)

4. Size exclusion chromatography

5. Afnity chromatography

6. Chiral chromatography

Separation mechanism

Type of stationary

(12)

Normal phase

Fasa gerak (polar)

Triethylene glycol

Water

Hexane

Propyl ether

Hydrocarbon

(13)

Typical application of High

Performance Partition

chromatography

Field Typical mixture separated

Pharmaceutical Antibiotics, steroids, analgesics

Biochemicals Amino acids, proteins, carbohydrates, lipids Food products Artifcial sweeteners, antioxidants, afatoxins,

additives

Industrial chemicals _Condensed

_aromatics

_{, surfactants,} propellants, dyes

Pollutants Pesticides, herbicides, phenols, PCBs Forensic chemistry Drugs, poisons, blood alcohol, narcotics

Clinical medicine Drugs metabolits, urine extracts, estrogens, bile acids

(14)

Fase diam

Fase diam Mekanisme sorpsi Kerakteristik

Silika yg tidak dimodifkasi

Adsorpsi, fase normal Polar, waktu retensi bervariasi karena ada air yg diserap

Fase terikat (ODS,

okta desil silan) Partisi, fase terbalik Non polar, mampu memisahkan sejumlah besar solut

Fase terikat

aminopropil Partisi yang dimodifkasi Polar, memisahkan senyawa karbohidrat

Fase terikat asam

sulfonat Penukar kation Tranfer massa lambat, puncak melebar

Fase terikat amin

kuarterner Penukar anion -Fase terikat silika dg

porositas terkendali Eklusi ukuran Fase gerak organik Polimer Partisi, eklusi,

pertukaran ion

(15)

(16)

Fase

(17)

• N-heksana

• Sikloheksana

• Tetraklorometa

na

• Triklorometana

• diklorometana

• _{Metil benzene}

• _{Tetrahidrofura}

(18)

GENERAL

TYPES

Mengukur perubahan sifat fsika fasa gerak + solut secara keseluruhan

Sensitif hanya terhadap beberapa

sifat solut

Bulk property (general detectors)

Solute property (selective detectors)

Karakteristik solut Sensitivitas dan

(19)

(20)

(21)

Detektor

Yang umum dipakai



Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS) :

untuk senyawa yang dapat menyerap

sinar UV-Vis



Detektor Fluorescence (RF) : komponen

yang keluar dari kolom dikenai sinar UV

dan akan berfuorosensi



Detektor Konduktivitas (CDD) : untuk

senyawa ionik



Detektor Refraktive Indeks (RID) : setiap

senyawa memiliki indek bias spesifk

(22)

Refractive Indeks

UV-Vis Fluorescence MS

Response Universal Selective Selective Selective

Sensitivity 4 microgram 5 nanogram 3 picogram 1 picogram

Linear Range 10 10 10 10

Flow Sensitive Yes No No Yes

Temperature sensitive

(23)

Rs : nilai resolusi

Ukuran kemampuan kolom untuk memisahkan dua

(24)

(25)

Kelebihan HPLC

• _{Dapat digunakan untuk senyawa non}

volatile dan senyawa dengan BM tinggi

• _{Biasanya digunakan pada suhu kamar}

sehingga aman bagi senyawa yang tidak

tahan panas

• _{Fase gerak dapat diubah dengan mencapur}

berbagai pelarut dengan berbagai

komposisi

• _{Dapat digunakan untuk menganalisis}

(26)

• _{Sulit mengidentifkasi senyawa jika tidak}

memiliki larutan standar



harus

dihubungkan dengan MS

• _{Jika campuran sangat komplek maka}

resolusi yang baik sulit diperoleh

(27)

Bidang aplikasi HPLC

• _{Obat-obatan dan farmasi (parasetamol,}

amoksilin)

• _{Bahan pengawet (formalin)}

• _{Zat aditif (sakarin, asam benzoat)}

• _Antioksidan

• _{Zat-zat aktif pada produk makanan}

(kafein)

• _{Produk perawatan (senyawa fenolik)}

• _{Pestisida (residu pestisida diazinon pada}

(28)

Gambar senyawa fenolik dalam produk perawatan (personal care products)

(29)

(30)

(31)

Contoh kromatogram analisis obat dalam

urin

Tetrahidrokanabi

nol (THC) : zat

aktif dalam

(32)

(33)

Pengujian Campuran Zat

Aktif Obat Menggunakan

(34)

Penentuan Kondisi Metode

HPLC

1. Penentuan kesesuaian sistem

Rasio fase gerak, laju alir, panjang gelombang,

2. Pembuatan kurva kalibrasi

3. Validasi metode

• _{Kecermatan atau ketepatan (Akurasi)}

• _{Keseksamaan atau ketelitian (Presisi)}

• _Linieritas

(35)

(36)

(37)

(38)

Penentuan Kondisi Metode

HPLC

1. Penentuan kesesuaian sistem

Uji ini menggunakan pengulangan injeksi sebanyak

6 kali larutan standar 0.2 mg/L dilanjutkan

penghitungan nilai waktu retensi dan AUC (Area

Under the Curve) dan penentuan RSD

2. Pembuatan kurva kalibrasi

3. Validasi metode

• _Kecermatan

• _Keseksamaan

• _Linieritas

• _LOD

(39)

Kondisi Pengujian

• Metode elusi isokratik

• Optimasi pelarut

–

Air deionisasi

–

Air deionisasi panas (60-70°C)

–

_{Air deionisasi:asetonitril (9:1)}

–

Air deionisasi:asetonitril (8:2)

• Optimasi fase gerak (eluen)

–

Air deionisasi (100 v/v)

–

Air deionisasi:asetonitril (90:10 v/v)

–

Air deionisasi:asetonitril (80:20 v/v)

• Laju alir optimum  injeksi larutan standar dengan

konsentrasi tertentu pada variasi kecepatan 0.2 – 1

mL/menit

(40)

Kromatogram zat aktif obat dalam sampel

Kromatogram zat aktif obat standar (1mg/mL) dalam matriks

(41)

Pengujian Linieritas

(42)

(43)

PENGUJIAN PESTISIDA

(44)

Preparasi

pelaru

t

(45)

(46)

Kromatogram pestisida

Chlorpyrifo

s

(47)

Data Hasil Validasi

Parameter

Chlorpyrifos

Prophenofos

Linearity range (n=6)

0.01-1.5

Regression

Y= 8141879x-14225

Y= 90697x-7971

Correlation coefcient

(r)

0.990

0.990 Intra-day precision

(n=9)

0.99-1,02

0.4-1.25

Inter-day precision

(n=9)

0.89-1.3

0.47-1.25

Repeatibility

1.66

1.51 Specifcity

Specifc

LOD (μg/mL)

0.00053

0.00094

LOQ (μg/mL)

0.0016

0.0028

Recovery (%) ±SD

(48)