EFEK KOMBINASI ASAM VALPROAT DAN NANO KITOSAN KUMBANG
TANDUK (
Xylotrupesgideon
) TERHADAP VIABILITAS DAN
SITOTOKSISITAS SEL KANKERLIDAH (HSC-3)
Komariah Komariah1), Abdining Ageng2), Indra Kusuma3) 1, 2)Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Trisakti
3)Fakultas Kedokteran Universitas Yarsi
E-mail: komariah@trisakti.ac.id; aningprtkn@gmail.com; indralenycahaya@gmail.com Abstrak
Kanker lidah merupakan salah satu kanker terbanyak dengan mortalitas tertinggi di dunia. Radioterapi dan kemoterapi pada kanker relatif terbatas karena toksisitasnya yang tinggi dan efek samping yang ditimbulkan. Pengembangan asam valproat dan nano kitosan Xylotrupes gideon merupakan strategi baru untuk terapi antikanker berbahan alami yang diharapkan meminimalkan efek samping terapi standar yang ada. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh paparan kombinasi asam valproat dan nano kitosan yang berasal dari X. gideon terhadap viabilitas dan sitotoksisitassel HSC-3. Penelitian menggunakan kultur sel HSC-3 yang terbagi dalam empat kelompok perlakuan, yaitu dengan pemberian kombinasi asam valproat dan nano kitosan dengan perbandingan 1:1, 1:2, 1:3, dan tanpa paparan kombinasi asam valproat dan nano kitosan (kontrol). Penelitian dilakukan untuk melihat viabilitas dan sitotoksisitassel HSC-3 menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 450nm. Hasil uji viabilitas dan sitotoksisitas paparan kombinasi memperlihatkan perbedaan signifikan dibandingkan dengan tanpa paparan kombinasi asam valproat dan nano kitosan (p<0.05). Hasil penelitian memperlihatkan semakin tinggi paparan kombinasi asam valproat dan nano kitosan memperlihatkan penurunan viabilitas serta peningatan sitotoksisitas sel HSC-3.
Kata kunci: sel HSC-3, asam valproat, nano kitosan, Xylotrupes gideon Pendahuluan
Kanker rongga mulut merupakan salah satu kanker yang paling umum terjadi di dunia dan sering menyebabkan kematian (Sharma dkk. 2010). Berdasarkan laporan International Agency for Research Cancer (IARC), dalam dekade terakhir telah terjadi peningkatan pada prevalensi kanker mulut, terutama pasien kanker lidah dengan kejadian tahunan lebih dari 300.000 kasus terdiagnosa dan 140.000 menunjukkan kematian (Rivera, 2015). Angka insiden kanker rongga mulut yang terjadi di Indonesia adalah sekitar 5.329 jiwa, dan angka mortalitas sebesar 2.250 jiwa (IARC, 2012).Seiring dengan berjalannya waktu, karena ketersediaan rokok tembakau dan alkohol yang mudah ditemukan, insidensi kanker lidah meningkat dan meluas kepada individu yang lebih muda. Namun variasi tingkat prevalensi juga dapat berhubungan dengan faktor genetik dan cara hidup orang di daerah geografis tertentu (Gaddikeri dkk, 2016).
Sampai saat ini, penatalaksanaan kanker lidah masih dilakukan dengan cara pembedahan yang disertai dengan radiasi dan kemoterapi (Sianipar dkk, 2016). Namun, tindakan pembedahan serta pemberian radiasi dan kemoterapi sering menyebabkan berbagai efek samping terhadap jaringan normal, dengan berbagai gejala, seperti mual, muntah, anoreksia, diare, mukositis oral, dan mati rasa (Ohnishi dkk, 2015). Berdasarkan efek samping yang ditimbulkan pasca operasi dan terapi, serta biaya yang relatif mahal,
maka sampai saat ini masih terus dilakukan penelitian terapi kanker yang diperoleh dari sumber alamidan obat sintesis yang relatif murah dengan efek sitotoksisitas minimal ke sel normal. Salah satu bahan antikanker adalah nano kitosan dan asam valproat.
Asam valproat merupakan obat antikonvulsan, yang berperan dalam modifikasi histon (Komariah dkk, 2017). Modifikasi histon diperankan oleh dua enzim utama yaitu histon asetilasi (HAT) dan histone deacetylase (HDAC) (Komariah dkk, 2018). Keseimbangan antara asetilasi dan deasetilasi protein histon dapat menentukan suatu gen aktif atau nonaktif (Sang dkk, 2016).
Kitosan merupakan turunan kitin yang banyak terdapat pada kurtikula kerang, udang, dan terdapat pada serangga, seperti kumbang tanduk (Komariah dan Astuti, 2012; Liu dkk, 2012).Xylotrupes gideon merupakan salah satu kumbang tanduk yang merugikan dan banyak tersebar luas di Asia Tenggara termasuk Indonesia (Komariah dan Astuti, 2012). Kitosan sebagai biomaterial multiguna dengan sifatnya yang biokompatibel, biodegradable, tidak beracun dan adsorptif Kitosan diketahui memiliki berbagai aktivitas biologis seperti efek peningkatan imuno, antijamur, aktivitas antimikroba, antitumor dan agen kemoterapi kanker (Babu dan Ramesh, 2016). Modifikasi fisik kitosan menjadi nanopartikel dapat meningkatkan aktifitas kerja kitosan dengan stabilitas dan daya serap yang lebih baik (Ganzhu, 2013).
Sampai saat ini penelitian menggunakan asam valproat maupun nano kitosan sebagai bahan antikanker masih terus dikembangkan. Oleh sebab itu penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian asam valproat dan nano kitosan X. gideon terhadap pertumbuhan sel kanker lidah (HSC-3), dengan melihat tingkat viabilitas, kemampuan inhibitor bahan, proliferasi serta migrasi sel kanker lidah secara in vitro. Studi Pustaka
a. Kitosan Kumbang Tanduk (Xylotrupes gideon)
Kumbang tanduk (Xylotrupes gideon) merupakan salah satu jenis kumbang dengan ukuran besar dan tersebar luas di Asia Tenggara, termasuk Indonesia (Pracaya, 2008). Kumbang tanduk X. gideon ini memiliki panjang mencapai 3.5-7cm. Kumbang jantan memiliki tanduk yang umumnya lebih panjang daripada kumbang betina (Kumar dkk, 2011).
Kitosan dengan rumus kimia (C6H11NO4)n merupakan senyawa yang diperoleh
dari deasetilasi kitin, dikarenakan kitin tidak mudah larut dalam pelarut umum (Arrouze dkk, 2017). Kitin tersebar luas di alam, dan merupakan polisakarida terbanyak setelah selulosa. Kitosan ditemukan sebagian besar pada eksoskeleton kerang, seperti udang, lobster, juga pada krustasea, dan kumbang (Azuma dkk, 2017). Pembuatan kitosan kumbang tanduk meliputi proses demineralisasi, deproteinasi, dekalorisasi dan deasetilasi (Komariah, 2013).
Kitosan dalam bentuk nano partikel mempunyai ukuran 10-1000nm ini memiliki banyak keuntungan karena dapat digunakan secara efektif, mempunyai stabilitas yang lebih baik, sitotoksisitas rendah, serta metode persiapan yang sederhana dan ringan (Ganzhu, 2013). Persiapan untuk mengubah kitosan ke dalam bentuk nanopartikel meliputi berbagai metode seperti metode emulsi, metode gelasi ionik, metode misel terbalik, metode self-assembling (Zhao dkk, 2011).
b. Asam Valproat
Asam valproat merupakan asam lemak berantai pendek dan bercabang, yang berasal dari asam valeric (tanaman Valeriana officinalis) (Sebastian, 2010),digunakan sebagai obat antikonvulsan pada tahun 1962 (Gurvich dkk, 2004). Baru-baru ini, asam valproat diklasifikasikan ke dalam inhibitor histone deacetylase (HDAC) karena berperan langsung dalam aktivitas seluler, menyebabkan kerusakan DNA dan terjadinya respon hiperasetilasi yang mengaktifkan protein p53 yang akan menghambat fase G1 dan S pada
siklus sel yang berkaitan dengan diferensiasi, perbaikan DNA, penghambatan proliferasi, dan apoptosis sel (Sebastian, 2010). Asam valproat efektif terhadap beberapa jenis sel kanker. Pemakaian asam valvroat ini digunakan bersamaan dengan bahan lain dikarenakan sifatnya yang kurang kuat ketika digunakan sendiri, sehingga harus dikombinasi untuk hasil yang maksimal (Gurvich dkk, 2004).
c. Kanker Lidah (sel HSC-3)
Kanker merupakan salah satu penyebab kematian utama dunia dan terhitung sekitar 7,6 juta (13%) angka ditahun 2008. Kanker merupakan keadaan dimana sel mengalami pertumbuhan yang tidak normal dan tidak terkendali dan memiliki kemampuan untuk merusak jaringan yang ada di sekitarnya. Sel-sel yang tumbuh abnormal ini akan meluas dan menyebar ke organ lain dengan cara masuk ke dalam pembuluh darah atau sistem limfatik. Kanker rongga mulut dapat mengenai bibir, lidah, gingiva, mukosa pipi, palatum, dan lidah. Kanker lidah sebagian besar terletak pada 2/3 palatum lidah dan posterior lidah (Khandeka DKK, 2006).
Pada stadium awal, kanker lidah secara klinis dapat ditemukan dalam berbagai bentuk, dapat berupa bercak bewarna putih, terjadi penebalan, dan biasanya terlihat dalam berbentuk ulkus. Karsinoma sel skuamosa oral (KSS) masuk dalam peringkat 10 besar keganasan di seluruh dunia, dan termasuk tumor bibir, lidah, gingiva, dasar mulut, dan kelenjar ludah. Karsinoma sel skuamosa mempunyai tingkat keganasan yang sangat merusak yang dikembangkan dari sel epitel. Karsinoma yang paling sering ditemukan di lidah adah sel HSC-3. Sel HSC-3 merupakan cell line kanker manusia yang biasa digunakan dalam penelitian di laboratorium (Ribeiro dkk, 2017).
Metodologi Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratorium in vitro. Pada penelitian ini menggunakan kitosan kumbang tanduk, dan dilakukan modifikasi fisik menjadi nano partikel. Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap, yaitu :
a. Penelitian tahan pertama
Pembuatan nano kitosan kumbang tanduk dengan derajat deasetilasi 93% menggunakan metode gelasi ionik sehingga menghasilkan nano kitosan dengan konsentrasi 3000ppm dan berukuran nanopartikel. Pembuatan larutan (nano kitosan dan asam valproat) pada beberapa konsentrasi yang dilakukan dalam laminar flow. Pengencaran dilakukan dari larutan stok nano kitosan dan asam valproat (3000ppm), kemudian diencerkan menjadi 200, 400, dan 600ppm dan pencampuran nano kitosan dan larutan asam valproat dengan perbandingan 1:1, 1;2, dan 1:3.
b. Penelitian tahap kedua
Pembuatan media kultur menggunakan sel fibroblas pada scaffold campuran kolagen dan nanokitosan. Medium kultur dibuat dengan DMEM tambahan 10% FBS dan 1% antibiotik antimikotik. Subkultur sel HSC-3 pada suhu 37°C dalam water bath. Resuspensi lagi dengan media kultur dan hitung jumlah sel yang ada. Kemudian sel ditanam ekspansi dengan menggunakan T-flush dan diinkubasi selama 24 jam selama 7 hari dan dapat diberikan perlakuan.
Uji viabilitas sel dilakukan dengan jumlah sel yang ditanam adalah sebanyak 3000 sel/well dan uji sitotoksisitas 20.000sel/well menggunakan plate 96 well. Dengan menambahkan reagent CCK-8 (cell counting kit 8) pada well yang telah didiamkan selama 24 jam. Pengukuran viabilitas dan sitotoksisitas dengan melihat kepekatan warna sel dengan menggunakan Microplate reader dengan panjang gelombang 450nm.
Hasil dan Pembahasan
Hasil Rerata viabilitas sel HSC-3 yang diberikan paparan kombinasi asam valproate dan nano kitosan dengan konsentrasi 1:1, 1:2, dan 1:3 dibandingkan dengan
tanpa pemberian kombinasi asam valproate dan nano kitosan memperlihatkan perbedaan signifikan (p<0.05), dengan persenta sepenurunan viabilitas sel HSC-3 pada pemberian kombinasi asam valproate dan nano kitosan 1:1, 1:2, dan 1:3 berturut-turut sebesar 3.93%, 6.86%, dan 11.02% (Tabel 1).
Tabel 1. Hasil rerata uji viabilitas sel HSC-3
Hasil rerata viabilitas sel HSC-3 yang diberikan kombinasi 1:2 dan 1:3 dibandingkan dengan kombinasi 1:1 menunjukan penurunan viabilitas sel HSC-3 sebesar 3.05% dan 7.38%. Hasil rerataviabilitas sel HSC-3 yang diberikan paparan kombinasi 1:3 yang dibandingkan dengan 1:2 menunjukan penurunan viabilitas sel HSC-3 sebesar 4.46%. Viabilitas sel HSC-3 pada media kultur yang telah diberikan perlakuan asam valproate dan nano kitosan dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Uji viabilitas sel HSC-3 setelah 24 jam; A) kontrol; B) kombinasi asam valproat dan nano kitosan 1:1; C) kombinasi asam valproat dan nano kitosan 1:2; D) kombinasi
asam valproat dan nano kitosan 1:3.
Hasil vibilitas sel HSC-3 yang terpapar kombinasi asam valproate dan nano kitosan memperlihatkan terjadi penurunan viabilitas dibandingkan dengan sel HSC-3 yang tidak terpapar, semakin tinggi kombinasi asam valproate dan nano kitosan memperlihatkan penurunan viabilitas yang tinggi. Hal ini diduga kemampuan nano kitosan selain sebagai anti kanker jugabekerja sebagai drug delivery untuk asam valproat yang juga memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan sel kanker. Hasil penelitian ini didukung oleh Naji dkk (2016), yang menyatakan asam valproate dapat penurunan kemampuan hidup dari sel kanker payudara MCF-7, dengan menghentikan siklus sel dalam fase G1, dan menghentikan proliferasi sel. Selain itu menurut Luca dkk (2009), asam valproate memiliki kemampuan memblokir pertumbuhan sel, dan menginduksi apoptosis pada kelangsungan hidup sel kanker usus besar.
Hasil rerata sitotoksisitas dari paparan kombinasi asam valproate dan nano kitosan X.gideon dengan konsentrasi 1:1, 1:2, dan 1:3 terhadap sel HSC-3 dibandingkan dengan tanpa pemberian kombinasi asam valproate dan nano kitosan memperlihatkan perbedaan yang signifikan (p<0.05), dengan persentase peningkatan sitotoksitas sel HSC-3 berturut-turut sebesar 72.56%, 127.HSC-36%, dan 20HSC-3.41%.
Perlakuan Konsentrasi n Mean±SD P-value
Kontrol - 5 94.86±1.64a 0.000
Kombinasi 1:1 5 91.13±0.74b
1:2 5 88.35±0.22c
Hasil rerata sitotoksisitas dengan kombinasi 1:2 dan 1:3 dibandingkan dengan kombinasi 1:1 terhadap sel HSC-3 menunjukan peningkatan sitotoksisitas sebesar 30.85% dan 75.82%. Hasil rerata sitotoksisitas paparan kombinasi 1:3 yang dibandingkan dengan 1:2 terhadap sel HSC-3 menunjukan peningkatan sitotoksisitas sebesar 33.45%.Hasil rerata sitotoksisitas sel HSC-3 dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil rerata uji sitotoksisitas sel HSC-3
Hasil sitotoksisitas paparan kombinasi asam valproate dan nano kitosan kumbang tanduk terhadap sel HSC-3 selama waktu pengamatan menunjukkan adanya korelasi antara konsentrasi larutan uji dengan efektoksik yang ditimbulkan. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa efek sitotoksik meningkat seiring peningkatan kombinasi yang memperlihatkan semakin banyak jumlah sel yang mati. Hal ini diduga kombinasi asam valproate dan nano kitosan tersebut menyebabkan gangguan pada membrane maupun siklus sel HSC-3. Nano kitosan mempunyai kemampuan untuk langsung menyerang sel kanker melalui interaksi dengan membrane sel melalui suatu reseptor tertentu atau, melalui proses endositosis. Sedangkan, kerja asam valproate menurut Eckschlager dkk (2017) melalui aktifitas HDAC inhibitor memperlihatkan peningkatan kerusakan DNA pada sel kanker yang menyebabkan kematian.
Kesimpulan
Kombinasi asam valproate dan nano kitosan Xylotrupesgideon mampu menurunkan viabilitas dan meningkatkan sitotoksisitas sel HSC-3, dengan semakin tinggi konsentrasi yang diberikan.
Daftar pustaka
Arrouze F, Essahli M, Rhazi M, Desbrieres A, Tolaimate, 2017, Chitin And Chitosan: Study of the Possibilities of Their Production by Valorization of The Waste Of Crustaceans And Cephalopods Rejected In Essaouira. Journal of Materials and Environmental Sciences. Vol 8 no 7, 2251-2258.
Azuma K, Osaki T, Minami S, Okamoto Y, 2017, Anticancer and Anti-inflammatory Properties of Chitin and Chitosan Oligosaccharides. Journal of Biomaterials, vol 6, 33-34. Babu A, Ramesh R, 2017, Multifaceted Applications of Chitosan in Cancer Drug Delivery and Therapy. Marine Drugs, vol 15 no 4, 96.
Eckschlager t, Plch j, Stiborova M, Hrabeta J, 2017, Histone Deacetylase Inhibitors as Anticancer Drugs, International Journal of Molecular Sciences, vol 18 no 1414, 1-25.
Gaddikeri, Kavitha, Deepak D. Bhorgonde, 2016, Oral Squamous Cell Carcinoma Of Tongue In Young Patient – A Rare Case Report And Review Of Literature. annals of Int Med and Dent Res. Vol 3 no 1, 1-6.
Ganzhu F, 2013, Enhanced Immune Response And Protective Effects Of Nano-Chitosan-Cased DNA Vaccine Encoding T Cell Epitopes Of Esat-6 And FL Against Mycobacterium Tuberculosis Infection. PLos ONE, vol 8 no 4, 1-7.
Perlakuan Konsentrasi n Mean±SD P-value
Kontrol - 5 5.14±1.64d 0.000
Kombinasi 1:1 5 8.87±0.744c
1:2 5 11.65±0.22b
Gurvich, Nadia, Oxana M, Meinkoth J, Klein P, 2004, Histone Deactylase Is A Target Of Valproic Acid-Mediated Cellular Differentiation. Cancer Research.Vol 64 no 3,1079-86. International Agency for Research on Cancer. Globocan 2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality And Prevelance Worldwide In 2012. France: International Agency for Research on Cancer.
Khandekar S, Badgey P, Tiwari R, 2006, Oral Cancer And Some Epidemiological Factors: A Hospital Based Study. Indian J Community. Vol 31 no 3, 157-159.
Komariah, Luki A, 2012, Preparasi Dan Karakterisasi Kitin Yang Terkandung Dalam Eksoskeleton Kumbang Tanduk Rhinoceros Beetle (Xylotrupes gideon L) dan Kutu Beras (Sitophilus oryzae L). Seminar Nasional IX Pendidikan Biologi FKIP UNS, 648-654
Komariah, 2013, Karakterisasi Kitin Dan Kitosan Yang Terkandung Dalam Eksoskeleton Kutu Beras (Sitophilus oryzae). Prosiding Seminar Nasional Pendidikan Biologi FKIP UNS, 144-153.
Komariah, Kiranadi B, Winanto A, Manalu W, Handharyani E, 2017, Pemberian asam valproat pada induk tikus bunting menghambat sintesis insulin pada sel otak anak tikus. Majalah Kedokteran Bandung, vol 49 no.3, 124-132.
Komariah, Manalu W, Kiranadi B, Winarto A, Handharyani E, Roeslan M.O, 2018, Valproic Acid Exposure Of Pregnant Rats During Organogenesis Disturbs Pancreas Development In Insulin Synthesis And Secretion Of The Offspring.Toxicological Res, vol 2, 173-182.
Kumar R, Rajkhowa G, Dhar N, Rajan R, 2011, A new Record Of Xylotrupes gideon (Linnaeus) (Coleoptera: Scarabaeidae) On Persia Bombycina, Kost. From India. Munis Entomology & Zoology, vol 6 no 1, 173-175.
Liu, Shaofang, Jie Sun, Lina Yu, Chushu Zhang, Jie Bi, Feng Zhu, Mingjing Qu, Chen Jiang, 2012, Extraction And Characterization Of Chitin From The Beetle Holotrichia Parallela Motschulsky.Molecules. Vol 17 no 4, 4604-4611.
Luca M, Cleris L, Magistroni V, Piazza R, Boschelli F, Formelli F, Passerini CG, 2009, Valproic Acid Enhances Bosutinib Cytotoxicity In Colon Cancer Cells,Int. J. Cancer, vol 124, 1990–1996.
Naji T, Zakeri Ghaderi, Erfani M, 2016, The Effects of Valproic Acid on Viability of MCF-7 Cell Line, Proceedings of 2016 International Conference on Cellular & Molecular Biology and Medical Sciences, vol 21 no 22, 1-7.
Ohnishi, Shunsuke, Takeda S, 2015, Herbal Medicines For The Treatment Of Cancer Chemotherapy-Induced Side Effects.Frontiers in Pharmacology, vol 6, 6:14.
Pracaya, 2008, Hama dan penyakit tanaman. Penebar Swadaya. Jakarta
Ribeiro I, Rodrigues J, 2017, Cytogenetic, Genomic, And Epigenetic Characterization Of The HSC-3 Tongue Cell Line With Lymph Node Metastasis. Journal of Oral Science. Vol 1, 70-81.
Rivera C. 2015, Essentials Of Oral Cancer. Int J Clin Exp Pathol,vol 8 no 9, 11884-94.
Sang Z, Sun Y, Ruan H, Cheng Y, Ding X, Yu Y, 2016, Anticancer Effects Of Valproic Acid On Oral Squamous Cell Carcinoma Via Sumoylation In Vivo And In Vitro. Experimental And Therapeutic Med. Vol 2, 3979-3987.
Sebastian C, 2010, Molecular And Therapeutic Potential And Toxicity Of Valproic Acid. Journal Of Biomed And Biotech, 1-18.
Sharma P, Saxena S, Aggarwal P, 2010, Trends In The Epidemiology Of Oral Squamous Cell Carcinoma In Western UP: An Institutional Study. Ind J Dent Res, vol 21,316-19. Sianipar, Fronika N, Purnamaningsih R, Rosiana R, 2016, Pengembangan Tanaman Keladi Tikus ( Typhonium Flagelliforme Lodd.) asal indonesia sebagai obat antikanker. ETHOS.Jurnal Penelitian dan Pengabdian. 65-74.
Zhao L, Lu-E Shi , Zhi-Liang Zhang , Jian-Min Chen , Dong-Dong Shi , Jie Yang, Zhen-Xing Tang, 2011, Preparation And Application Of Chitosan Nanoparticles And Nanofibers. Brazilian Journal of Chemical Engineering. vol 28 no 3, 353-362.
