UJI DAYA ANTIOKSIDAN SENYAWA FLAVONOID DAUN
Plantago
major
L.
THE DETERMINATION OF ANTIOXIDANT POTENCY OF FLAVONOIDS FROM Plantago major L. LEAVES
Oleh:
Triana Hertiani *), Suwijiyo Pramono *) dan Supardjan A.M **).
*) Lab. Fitokimia, Fak. Farmasi Universitas Gadjah Mada **) Lab. Sintesis Obat, Fak. Farmasi Universitas Gadjah Mada
ABSTRAK
Telah dilakukan pengujian daya antioksidan senyawa flavonoid daun Plantago major L. Isolasi flavonoid dilakukan dengan menggunakan kromatografi kertas preparatif dengan fase gerak air suling.
Isolat yang diperoleh diuji daya antioksidannya menggunakan metode asam tiobarbiturat yang dimodifikasi dengan kuersetin sebagai pembanding positif.
Hasil isolasi menunjukkan bahwa terdapat setidaknya 3 isolat yang aktif sebagai antioksidan dengan daya antioksidan sebagai berikut: isolat A 41,08% 4,96%; isolat B 24,88% 5,39%; isolat C 21,08% 6,52% sedangkan kuersetin menunjukkan potensi sebesar 33,86% 8,32%.
Kata kunci: uji daya antioksidan, flavonoid, Plantago major L. ABSTRACT
A research has been done to determine the antioxidant potency of flavonoids substances from Plantago major L. leaves. Isolation was done using a preparative paper chromatography with aquadestilata as a mobile phase.
The isolates have been examined the antioxidants potencies using the modification of a thiobarbituric acid method with quercetin as a reference.
The result has shown that there were at least three active isolates with potencies (%) as followed i.e. isolate A 41,08 4,96; isolate B 24,88 5,39; isolate C 21,08 6,52 while quercetin has shown its potency of 33,86 8,32.
PENDAHULUAN
Peningkatan pengetahuan dalam bidang kesehatan telah menyadarkan masyarakat mengenai pentingnya suplemen antioksidan untuk pencegahan berbagai penyakit degeneratif. Antioksidan sintetik seperti BHA (butylated hidroxy aniline) dan BHT (butylated hidroxy toluen) telah diketahui memiliki efek samping yang besar antara lain menyebabkan kerusakan hati. Di sisi lain alam menyediakan sumber antioksidan yang efektif dan relatif aman seperti flavonoid, vitamin C, beta karoten dan lain-lain. Hal tersebut mendorong semakin banyak dilakukan eksplorasi bahan alam sebagai sumber antioksidan (Kikuzaki dan Nakatani, 1993).
Flavonoid seperti kuersetin, rutin, diketahui sebagai antioksidan yang potensial. Aktivitas sebagai antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan adanya gugus hidroksi fenolik dalam stuktur molekulnya. Ketika senyawa-senyawa ini bereaksi dengan radikal bebas, mereka membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik (Cuvelier et al., 1994).
Daun Plantago major L. diketahui mengandung senyawa flavonoid yang aktif sebagai antioksidan (Hertiani dan Pramono, 1999), tetapi belum pernah dilakukan isolasi senyawa flavonoid tersebut dan uji potensinya sebagai antioksidan. Hal tersebut mendorong dilakukannya penelitian tentang isolasi dan uji daya antioksidan senyawa flavonoid daun
Plantago major L. menggunakan modifikasi dari metode asam tiobarbiturat oleh Ottolenghi (Kikuzaki dan Nakatani, 1993) dengan kuersetin sebagai kontrol positif.
METODOLOGI
Peralatan yang dipergunakan adalah spektrofotometer uv-sinar tampak Hitachi, peralatan gelas, neraca Chyo Yupiter C3-100, inkubator 40C, mikropipet Socorex 2-50l dan 200-1000l, termometer, centrifuge model DSC 158, bejana pengembang kromatografi kertas dan lampu uv 366 nm.
Bahan yang dipergunakan adalah daun Plantago major L. yang dikumpulkan pada bulan September 1998 dari BPTO Tawangmangu dan dideterminasi di laboratorium Farmakognosi bagian Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UGM, etanol absolut, asam 2-tiobarbiturat, asam fosfomolibdat (E Merck) asam linoleat (Sigma) sebagai pereaksi dan kuersetin sebagai pembanding.
CARA KERJA Skema kerja:
Infus serbuk daun kering Uapkan sampai kental
Tambahkan etanol sampai endapan sempurna dan disentrifuge Filtrat diuapkan
Kromatografi kertas
Semprot dengan asam fosfomolibdat dalam aseton Diikuti dengan penambahan uap amoniak Isolasi bercak yang positif (biru abu-abu )
dengan Kromatografi kertas Uji potensi antioksidan
Uji potensi antioksidan dengan metode asam 2-tiobarbiturat yang dimodifikasi: (Ottolenghi
cit Kikuzaki dan Nakatani, 1993).
Ke dalam vial bertutup ulir (50 ml) dengan diameter 38 cm dan tinggi 75 mm dimasukkan campuran sampel (2 mg) dalam 4 ml etanol, lalu ditambahkan 4,1 ml 2,53% asam linoleat dalam etanol ditambah 8 ml dapar fosfat 0,5 M (pH 7) dan akuades 3,9 ml. Campuran tersebut diinkubasi pada 40 C dalam gelap. Asam linoleat akan mengalami reaksi autooksidasi menjadi TBArs (Asam 2-tiobarbiturat reacting substance). Reaksi autooksidasi tersebut akan dihalangi oleh senyawa reduktor yang diperkirakan terdapat dalam sampel sehingga akan menurunkan jumlah TBArs yang terbentuk.
Setiap 24 jam campuran diatas diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan pereaksi asam 2-tiobarbiturat (selanjutnya disebut TBA) dipanaskan di atas penangas air mendidih selama 10 menit dan setelah dingin disentrifugasi pada 3200 rpm selama 20 menit. Senyawa
berwarna merah jambu. Filtrat dibaca absorbansinya pada 534,2 nm. Aktivitas antioksidan ditentukan berdasarkan absorbansi pada hari akhir.
Penetapan potensi antioksidan menggunakan rumus sebagai berikut (Yen dan Hsieh, 1997):
Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi sampel
% penghambatan = x 100%
Absorbansi kontrol negatif
Daya antioksidan dinyatakan sebagai % penghambatan untuk bobot sampel 1 mg.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat 3 bercak yang positif sebagai antioksidan dengan metode asam fosfomolibdat seperti ditunjukkan oleh data kromatogram pada tabel I. Metode asam fosfomolibdat merupakan metode pendahuluan untuk mengetahui aktivitas senyawa antioksidan secara kualitatif (Ranganna, 1978). Prinsip kerjanya adalah reaksi oksidasi-reduksi sebagaimana dijelaskan sebagai berikut:
2 MoO3 MoO2.MoO3
Pada reaksi tersebut Mo(IV) dari H3(P(MO3O16)4) direduksi dengan adanya senyawa
antioksidan menjadi Mo(IV) yang berupa campuran oksidan yang berwarna biru abu-abu (Jork et al., 1990).
Untuk uji secara kuantitatif dilakukan dengan metode TBA. Metode ini mudah dan murah serta banyak digunakan untuk uji antioksidan. Metode ini memiliki kerugian yaitu waktu pengujian relatif lama (Wu dan Brewer, 1993).
Tabel I. Data kromatogram fraksi non musilago dengan pelarut etanol, fase diam kertas Whatman no. 1, fase gerak akuades.
Kode Bercak hRf Sinar tampak UV 366 Tanpa perlakuan Uap Amoniak Asam fosfomolibdat Tanpa perlakuan Uap amoniak
D 96 Coklat Kuning - Kuning hijau Hijau
C 80 - Kuning cerah + Biru gelap Hijau
B 50 - Kuning cerah + Biru terang Biru hijau
A 5 Kuning coklat Kuning cerah + Coklat gelap Coklat gelap Keterangan: - : tidak terdeteksi; +: bercak biru abu-abu.
Data kromatogram di atas menunjukkan bahwa terdapat 4 bercak yang kemungkinan merupakan flavonoid. Jika mengacu pada Mabry et al.(1970), dan Markham (1982), tentang hubungan antara warna bercak dengan struktur flavonoid maka kemungkinan sruktur flavonoid dari masing-masing bercak tersebut adalah seperti tercantum pada tabel II sebagai berikut:
Tabel II. Kemungkinan struktur flavonoid bercak kromatogram pada tabel 1. Kode
bercak
Warna bercak flavonoid
Kemungkinan type flavonoid UV 366 nm NH3/UV366 nm
A Coklat gelap Coklat gelap Flavon atau flavonol dengan 3-OH tersubsitusi dan 5-OH bebas; atau isoflavon, dihidroflavonol, biflavonil dan flavanon dengan 5-OH
B Biru terang Biru hijau Flavon atau flavanon dengan 5-OH bebas atau flavonol tanpa 5-OH bebas dengan 3-OH tersubstitusi.
C Biru gelap Hijau Flavon atau flavanon dengan 5-OH bebas atau flavonol tanpa 5-OH bebas dengan 3-OH tersubstitusi.
D Kuning hijau Hijau Flavonol dengan 3-OH bebas dan atau tanpa 5-OH bebas.
Struktur umum flavonoid adalah sebagai berikut:
O O 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6'
Isolat hasil kromatografi preparatif yaitu isolat A,B,C dan kuersetin sebagai kontrol positif diuji daya antioksidannya dengan metode TBA yang dimodifikasi. Pemilihan kuersetin sebagai senyawa pembanding karena senyawa ini telah diketahui memiliki aktivitas yang tinggi sebagai antioksidan. Hal tersebut kemungkinan disebabkan adanya gugus ortho-dihidroksi pada posisi 3’ dan 4’, gugus OH pada posisi 3,5 dan 7 (Foti et al., 1996)
Pada awal uji dilakukan penentuan panjang gelombang serapan maksimal, waktu operasional dan masa inkubasi. Hasil penentuan panjang gelombang serapan maksimal adalah pada panjang gelombang 532,4 nm.
Penentuan waktu operasional sampai dengan jam ke-5 menunjukkan bahwa pengujian pada jam ke-1 memberikan hasil yang relatif stabil sehingga untuk pengujian selanjutnya waktu operasional ditentukan antara 1 – 1 ½ jam setelah sentrifugasi untuk menyamakan kondisi percobaan.
Penentuan masa inkubasi dilakukan pada kontrol negatif memberikan data seperti ditunjukkan oleh grafik pada gambar 1. Pada gambar tersebut terlihat adanya peningkatan absorbansi pada hari ke-0 sampai dengan hari ke-8 yang menunjukkan proses autooksidasi masih berlangsung. Terlihat bahwa mulai hari ke-8, absorbansi relatif stabil, sehingga penelitian dilakukan pada hari ke-8 dari masa inkubasi. Diharapkan pada hari ke-8 itu semua asam linoleat pada kontrol negatif telah mengalami autooksidasi membentuk TBArs. Dengan demikian TBArs yang terbentuk sudah maksimal.
Gambar 1. Penentuan masa inkubasi kontrol negatif
Prinsip kerja dari metode ini adalah proses autooksidasi dari asam linoleat menghasilkan senyawa TBA-reacting substance (TBArs) seperti misalnya malondialdehida yang dengan adanya asam 2-tiobarbiturat (TBA) akan membentuk senyawa berwarna merah jambu yang kemudian diukur absorbansinya pada 532 nm. (Kikuzaki dan Nakatani, 1993). Proses autooksidasi tersebut dapat dihalangi oleh senyawa antioksidan, sehingga TBArs yang terbentuk akan lebih sedikit daripada tanpa penambahan senyawa antioksidan.
Data pengujian daya antioksidan isolat dan kontrol positif ditunjukkan pada tabel 3 dan diilustrasikan pada gambar 2.
Tabel III. Data hasil pengujian daya antioksidan
Sampel Daya antioksidan (%)
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hari ke-Absorbansi
A 43,46 44,39 35,38 41,08 4,96
B 33,13 23,98 23,62 24,88 5,39
C 18,21 28,55 16,49 21,08 6,52
Kuersetin 38,21 24,36 39,00 33,86 8,32
Keterangan: I,II,III : replikasi ke-1, ke-2 dan ke-3; SD : standar deviasi
atau diilustrasikan pada gambar 2 sebagai berikut:
0 10 20 30 40 50
Isolat A Isolat B Isolat C Kuersetin
Sampel Daya
Antioksidan (%)
Gambar 2. Data hasil pengujian daya antioksidan
Hasil pengujian daya antioksidan di atas menunjukkan harga standar deviasi yang besar. Hal tersebut kemungkinan disebabkan sampel belum merupakan senyawa murni, sehingga jumlah senyawa aktif yang bereaksi sebagai antioksidan dalam tiap replikasi sampel tidak sama.
Hasil statistika dengan uji t taraf kepercayaan 95% menunjukkan bahwa isolat A berbeda bermakna dengan isolat B dan C dan kuersetin dan menunjukkan daya antioksidan yang paling tinggi.
KESIMPULAN
Dalam daun Plantago major L. setidaknya terdapat 3 senyawa flavonoid yang aktif sebagai antioksidan menurut metode asam 2-tiobarbiturat yang dimodifikasi (Ottolenghi, 1959 cit Kikuzaki dan Nakatani, 1993). Isolat A memiliki daya antioksidan tertinggi yaitu sebesar 41,08%.
UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian ini terlaksana dengan bantuan dana URGE dari Dirjen DIKTI, Depdiknas RI.
DAFTAR PUSTAKA
Cuvelier, M.E., Richards, H., and Besset, C., 1994, Comparison of The Antioxidative Activity of Some Acid Phenols: Structure-Activity Relationship, Biosci. Biothech. Biochem.,
56(2), 324 – 325.
Foti, M., Piatelli, M., Baratta, M.T., and Ruberto, G., 1996, Flavonoids, Coumarins, and Cinnamic Acids as Antioxidants in a Micellar System. Structure-Activity Relationship, J.Agric. Food. Chem., 44(2), 497-500.
Hertiani, T., dan Pramono, S., 1999, Uji Pendahuluan Kandungan Antioksidan dalam Infus Daun Plantago major L., Makalah, Seminar Biologi Menuju Milenium III, Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta.
Jork, H., Funk, W., Fischer, W., and Wimmer, H., 1990, Thin Layer Chromatography, Reagents and Detection Methods, Physical and Chemical Detection Methods: Fundamentals, Reagents I, Vol. Ia, VCH, New York.
Kikuzaki, H., and Nakatani, N., 1993, Antioxidant Effects of Some Ginger Constituents, J. Food Sci., 58(6), 1407
Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic Identification of Flavonoids, Springer-Verlag, New York.
Markham, K.R., 1982, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., 1988, Penerbit ITB, Bandung.
Ottolenghi, A., 1959, Interaction of Ascorbic Acid and Mithocondrial Lipids, cit Kikuzaki, H., and Nakatani, N., 1993, J. Food Sci., 58(6), 1407.
Ranganna, S., 1978, Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products, Tata Mc Graw-Hill Publishing Company Limited, New Delhi.
Wu, S., and Brewer, S., 1993, Screening Antioxidative and Prooxidative Activity in A Solid Medium Model System, J. Food Biochem., 17(1), 2.
Yen, G. and Hsieh, C., 1997, Antioxidant Effects of Dopamine and Related Compounds,
