123
PEMBAHASAN UMUM
Pada manusia, kolesterol umumnya dikaitkan dengan aterosklerosis yang dapat meningkatkan kejadian penyakit jantung koroner (PJK). Menurut Bush et al. (1987), faktor risiko dapat meningkatkan keadaan konsentrasi kolesterol plasma dan kolesterol-LDL yang disertai menurunnya kolesterol-HDL, sehingga terjadi aterosklerosis yang mengarah ke PJK. Clarkson et al. (1996) dan Antony et al. (1997) melaporkan penelitian adanya kejadian aterosklerosis arteri koronaria pada monyet ekor panjang yang diberi pakan aterogenik yang mengandung kolestrol tinggi (35%).
Aterosklerosis merupakan kelainan degeneratif pada pembuluh darah besar dan sedang, yang dicirikan oleh adanya penebalan dinding pembuluh darah yang berisi sel busa. Sel busa merupakan sel makrofag yang berisi kolesterol maupun kolesterol ester. Hal ini disebabkan makrofag secara berlebihan mengambil LDL teroksidasi. Penyebab utama aterosklerosis adalah meningkatnya lipoprotein yang beredar di dalam darah. Hiperkolesterolemia merupakan salah satu faktor risiko untuk terjadinya aterosklerosis, dan lesi awal ditandai dengan terbentuknya garit lemak (Fuller and Jialal 1994). Menurut Kaplan & Aviram (2001), selain kolesterol pada lesi atereosklerosis, terdapat juga protein, karbohidrat, komponen seluler termasuk sel otot polos, makrofag, dan limfosit.
Hansson (2009) menyatakan bahwa aterosklerosis merupakan penyakit inflamasi, dan aterosklerosis dimulai saat LDL terakumulasi di intima sehingga akan mengaktifkan endotel, meningkatkan pengambilan monosit dan limfosit T. Monosit berdiferensiasi membentuk makrofag yang dapat menangkap LDL terakumulasi, yang pada akhirnya membentuk sel busa. Sedangkan sel limfosit T pada lesi akan mengenali antigen lokal yang selanjutnya berkontribusi pada pembentukan plak aterosklerosis.
Perkembangan pengetahuan tentang alternatif pengobatan dan kemajuan teknologi membawa nuansa baru untuk lebih memahami pentingnya arti kesehatan. Obat-obat tradisional saat ini semakin banyak dikembangkan, dan sampai kini belum dilaporkan bahwa produk obat tradisional memiliki efek
124 sampingan yang membahayakan. Produk-produk antioksidan sudah banyak dijual di pasaran dan harganya cukup mahal. Pemahaman akan antioksidan perlu dipaparkan lebih luas kepada masyarakat. Antioksidan terdapat di alam dengan jumlah yang cukup berlimpah. Antioksidan banyak terkandung di dalam buah-buahan, sayur-sayuran, jenis kacang-kacangan maupun berbagai rimpang temu-temuan.
Penelitian ini dilakukan untuk mengkaji peranan kurkuminoid ekstrak temu mangga dalam menghambat oksidasi lipid ditingkat seluler. Parameter-parameter yang diamati adalah tingkat penghambatan oksidasi LDL, penghambatan pembentukan sel-sel busa, serta ekpresi molekul adhesi seperti VCAM-1 dan ICAM-1. Penelitian ini penting untuk dilakukan mengingat banyaknya kejadian aterosklerosis yang berujung pada PJK dan kematian.
Temu mangga (Curcuma mango)
Temu mangga (Curcuma mangga) merupakan salah satu jenis kunyit atau kurkuma yang merupakan kerabat temu-temuan. Sejak dahulu, kunyit telah digunakan sebagai bahan ramuan obat tradisional. Akan tetapi mekanisme kerjanya sebagai obat sampai saat ini masih belum jelas diketahui. Senyawa aktif yang terkandung dalam kunyit adalah diferuloil-metana atau lebih lazim dikenal dengan kurkumin. Kurkumin merupakan derivat (turunan) kurkuminoid dan mempunyai kemampuan biologis yang cukup luas seperti antiradang, antikarsinogenik (Moon et al. 2005, Tonnesen et al. 1987), antirematik (Deodhar et al. 1980), antihepatoksik, antioksidan (Kiso et al. 1983, Rao 1995, Shetty 1997), dan anti hiperkolesterolemia (Nurfina et al. 1995; Pendurthi et al. 1997, Quiles et al. 2002). Sebagai senyawa antioksidan, kurkumin mampu melindungi LDL dari proses oksidasi sehingga pengambilan LDL teroksidasi oleh makrofag dapat dicegah (Quiles et al. 2002, Ruby & Lokesh 1995, Sreejayan et al. 1997). Kurkumin dapat juga mengeliminasi radikal hidroksi, radikal superosida, nitrogen dioksi, dan nitrogen monooksida, serta mencegah turunan dari radikal superoksid (Rao 1995; Ruby & Lokesh 1995; Sreejayan et al. 1997).
Kurkuminoid ekstrak temu mangga dalam penelitian ini diperoleh dengan cara mengektraksi rimpang temu mangga dengan menggunakan metode maserasi
125 dengan pelarut air dan etanol. Untuk memisahkan fraksinasi kurkuminoid dilakukan dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) seperti yang dilakukan oleh Quiles et al. (2002). Hasil ekstraksi kurkuminoid dari temu mangga diperoleh rendemen sebanyak 1,84%. Fraksinasi terhadap kurkuminoid diperoleh tiga terunan kurkuminoid yang terdiri atas 6,2% kurkumin sebanyak, 2,3% demetoksi-kurkumin, dan 3,0% bis-demetoksi kurkumin. Quiles et al. (2002) dan Nurfina et al. (1995) menyatakan bahwa kurkuminoid hasil isolasi dari jenis temu-temuan, seperti temu lawak (curcuma longa), terdiri atas kurkumin, demetoksi-kurkumin, dan bis-demetoksi-kurkumin.
Struktur kurkuminoid memiliki gugus fenolik yang cukup esensial sebagai scavenger (penangkap) superoksid (radikal bebas), dan gugus orto metoksi yang ada pada gugus fenolik mampu meningkatkan aktivitas kurkumin. Gugus fenolik juga diduga berfungsi sebagai antibakteri. Sedangkan Vareed et al. (2008) menyatakan bahwa, substansi fenolik yang terdapat pada tanaman obat mempunyai aktivitas sebagai antioksidan, antiradang, antikanker, maupun antimutagenik.
Dalam percobaan ini kurkuminoid ekstrak temu mangga mampu menghambat oksidasi LDL yang dilkukan oleh sel makrofag mencit dan beruk. Kurkuminoid yang diisolasi dari curcuma longa mampu menghambat oksidasi LDL secara invitro (Quiles et al. 2002). Kurkumin turunan dari kurkuminoid yang diisolasi dari tanaman temu lawak mampu menghambat oksidasi LDL (Sreejayan & Rao 1997; Rao 1995). Selain itu, kurkuminoid juga mereduksi respon ekspresi molekul ICAM-1 pada permukaan sel endotel yang diinduksi dengan LDL. Kurkuminoid yang berasal dari temu lawak mempunyai efek terhadap metabolime kolesterol (Velena 1995). Nurfina et al. (1995) menyatakan bahwa kurkumin mempunyai kemampuan menghambat aktivitas enzim lipoksigenase berperan dalam proses peroksidasi lipid. Posisi dan jumlah gugus subtitusi metoksi dan subtitusi hidroksi yang ada pada kurkumin memegang peranan penting dalam menentukan aktivitas lipoksigenase. Menurut Vareed et al. (2008), kurkumin dapat menghambat terekspresinya mRNA dari enzim
126 siklooksigenase, lipooksigenase, metaloproteinase, dan sintase nitrit oksid pada proinflamasi yang merupakan awal terbentuknya lesi aterosklerosis.
Respon Sel Makrofag terhadap Reaksi oksidasi Ion Cu2+, LDL dan LDL
Teroksidasi
Proses oksidasi lipoprotein merupakan suatu mekanisme abnormal dalam seluler, yang dapat digunakan sebagai indikator terjadinya stres oksidatif pada sel dan jaringan. Oksidasi lipid akan menghasilkan berbagai senyawa, seperti malonaldehida (MDA). Malonaldehida merupakan dialdehida tiga karbon sebagai hasil samping dari peroksidasi asam lemak tak jenuh (Janero 1990), dan sintesis prostaglandin (Marnette 1999). MDA dapat bereaksi dengan asam tiobarbiturat membentuk senyawa berwarna merah dan dapat diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 523 nm. Selain spesies reaktif radikal bebas, molekul LDL juga dapat dioksidasi oleh ion logam transisi, lipoksigenase maupun mieloperoksidase. Ion logam Cu2+ memegang peranan penting dalam pembentukan oksidan yang dapat menginisiasi peroksidasi.
Dalam percobaan ini, sel makrofag mencit dan makrofag beruk diinkubasikan dengan ion Cu2+, LDL, dan LDL teroksidasi, selama 4 jam dan 6 jam. Untuk perlakuan dengan ekstrak temu mangga, masing-masing kelompok dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid ekstrak temu mangga selama 48 jam. Adapun tujuan pemberian kurkuminoid ekstrak temu mangga, supaya sel makrofag dapat menggunakan kurkuminoid sebagai antioksidan yang menghambat reaksi oksidasi lipid yang dilakukan oleh sel.
Makrofag mencit lebih responsif terhadap kurkuminoid temu mangga dibandingkan dengan makrofag beruk. Dalam percobaan ini, kolesterol (LDL) yang digunakan berasal dari kolesterol monyet ekor panjang (MEP). Kondisi ini membuat makrofag beruk kurang berpengaruh terhadap reaksi oksidasi LDL. Disamping itu, metode yang digunakan untuk mengisolasi makrofag mencit berbeda dengan beruk. Pada isolasi makrofag mencit, mencit dipaksakan untuk memproduksi sebanyak mungkin makrofag, melalui injeksi secara peritoneal yang menggunakan asam tioglikolat. Makrofag beruk diperoleh dari sel darah putih yang dipisahkan dari sel darah merah dengan menggunakan Lymphocite
127 Separation Medium (LSM). Berdasarkan pengamatan dari hasil perecobaan, makrofag beruk diinkubasi dengan LDL yang berasal dari MEP hanya memberikan oksidasi lipid yang minimal jika dibandingkan dengan makrofag mencit.
Dalam percobaan ini, LDL yang diinkubasi dengan ion Cu2+ dapat terjadi oksidasi LDL. Produk oksidasi LDL dan lipid berbentuk MDA. Laju oksidasi LDL ditunjukkan dengan cara mengukur konsentrasi MDA menggunakan metode TBAR. Demikian juga oksidasi lipid yang terbentuk setelah sel makrofag diinkubasi dengan ion Cu2+ diukur MDA-nya dengan metode yang sama. Sel makrofag yang diinkubasi dengan ion Cu2+ dapat menghasilkan MDA juga. Hal ini menyebabkan sel makrofag melepaskan radikal bebas yang kemudian merangsang makrofag untuk mengoksidasi LDL, dan pada akhirnya akan terjadi akumulasi LDL teroksidasi di dalam makrofag sehingga membentuk sel busa. Namun demikian, peningkatan oksidasi lipid dan oksidasi LDL dapat dihambat dengan pemberian kurkuminoid ekstrak temu mangga sebesar 8 ppm (P<0,01).
Peningkatan konsentrasi MDA terhadap makrofag mencit dan makrofag beruk yang diinkubasikan dengan LDL teroksidasi cukup tinggi. Akan tetapi peningkatan konsentrasi MDA ini dapat diturunkan dengan pemberian ekstrak kurkuminoid 2 ppm, 6 ppm, dan 8 ppm (P<0,01). Efek kurkuminoid terhadap panghambatan proses oksidasi LDL di dalam makrofag mencit sebesar 13,07% dan pada beruk sebesar 24,28%. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa kurkuminoid ekstrak temu mangga memberikan efek yang dapat menghambat reaksi oksidasi LDL.
Kurkumin mempunyai kemampuan dalam mencegah perluasan penyakit seperti, menurunkan kerentanan LDL terhadap oksidasi, mencegah proliferasi sel-sel otot polos pembuluh darah, mempunyai efek antitrombik, efek hipotensif sementara, dan mencegah agregasi platelet secara in vivo. Kurkuminoid mampu menghambat oksidasi LDL manusia, mencegah peroksidasi lipid plasmatik, serta menghambat peroksidasi lipid pada hemogenat hati dan otak tikus yang mengalami udema. (Srejevan et al. 1997; Quiles et al. (2002).
Penghambatan kecepatan proses oksidasi lipid dan LDL di dalam sel makrofag mencit yang diinkubasi dengan kurkuminoid pada konsentrasi 8 ppm
128 sebesar 13,07% (p<0,01), dengan lama masa inkubasi 4 jam. Sedangkan pada masa inkubasi 6 jam, penghambatan oksidasi lebih rendah yaitu 4,19%. Nilai ini masih lebih tinggi jika dibandingkan dengan sel makrofag yang tidak diberi kurkuminoid ekstrak yang penghambatan oksidasinya hanya sebesar 3,73%. Lama waktu inkubasi 4 jam jika dibandingkan dengan 6 jam tidak menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan (P>0,05).
Pola yang sama juga terjadi pada sel makrofag beruk. Kurkuminoid ekstrak temu mangga 8 ppm dapat menghambat oksidasi lipid di dalam sel makrofag (P<0,01). Hal ini ditandai dengan adanya penghambatan oksidasi lipid, baik pada inkubasi 4 jam maupun 6 jam. Penghambatan oksidasi lipid oleh kurkuminoid ekstrak temu mangga sebesar 24,28%. Sedangkan untuk kontrol (makrofag + LDL oksidasi tanpa ekstrak kurkuminoid), diperoleh hasil yang lebih rendah, yakni sebesar 8,93%. Dari uraian ini, dapat disimpulkan bahwa kurkuminoid ekstrak temu mangga dapat menghambat oksidasi LDL pada makrofag mencit dan beruk. Dapat dikatakan juga bahwa, peningkatan hambatan oksidasi LDL terjadi seiring dengan pemberian dosis kurkuminoid ekstrak temu mangga yang meningkat. Jayaprakasa dkk (2005) menyatakan bahwa gugus hidroksil dan metoksil pada cicin fenil dan subtituen 1,3 diketon memiliki peran penting yang sangat signifikan dalam kemampuan kurkumin sebagai antioksidan.
Secara in-vivo, kurkumin yang berasal dari Curcuma longa diberikan sebanyak 500 mg/hari secara oral selama 7 hari, mampu menghambat peroksidasi lipid yang diukur pada plasma manusia (Srejevan et al. 1997). Kurkuminoid Curcuma longa yang diteliti oleh Quiles et al. (2002) mampu menghambat peroksidasi lipid secara in-vitro pada makrofag dengan dosis 4-9,6 mg/L, sedangkan secara in-vivo dosis kurkuminoid sebanyak 1,33 mg/kg bb juga dapat menghambat peroksidasi lipid pada kelinci. Penggunaan 500 mg kapsul kurkumin 98% murni yang diberikan pada manusia selama 7 hari tidak memperlihatkan efek toksisitas (Soni & Kuttan 1992). Menurut Rao (1995), kurkumin dapat menghambat peroksidasi lipid pada hemogenat hati dan otak tikus yang mengalami udema. Kurkumin mempunyai kemampuan untuk mencegah perluasan penyakit seperti menurunkan kerentanan LDL terhadap oksidasi, mencegah proliferasi sel-sel otot polos pembuluh darah, mempunyai efek antitrombik, efek
129 hipotensif sementara dan mencegah agregasi platelet in vivo. Fuhman et al. (2000) menyatakan modifikasi oksidatif dari LDL memegang peranan penting di dalam pathogenesis atherosclerosis, kondisi ini dapat dihindarkan dengan mengkonsumsi makanan yang kaya akan antioksidan fenolik. Selanjutnya dikatakan bahwa, 76% antioksidan fenolik yang berasal dari jahe dapat menurunkan biosintesa kolesterol seluler pada makrofag peritoneal mencit.
Respon Ekspresi Molekul Adhesi pada Permukaan Sel Endotel terhadap Reaksi Oksidasi LDL.
Molekul adhesi seperti VCAM-1 dan ICAM-1 adalah molekul protein yang dapat terekpresikan ke permukaan sel endotel apabila terjadi disfungsi endotel. Gangguan dapat disebabkan oleh berbagai faktor risiko seperti: hiperkolesterolemia, diabetes, merokok, hipertensi toksin, dan senyawa kimia lainnya yang dihasilkan oleh sel itu sendiri. Faktor risiko dapat memicu pembentukan lesi awal aterosklerosis yang dapat menimbulkan penyakit jantung koroner (Libby 2000; Packard & Libby 2008). Faktor risiko juga menyebabkan perubahan struktur permukaan sel endotel, sehingga sel akan menghasilkan berbagai poduk yang dapat diekspresikan ke permukaan sel, seperti VCAM-1 dan ICAM-1. Produk-produk yang dihasilkan ini dapat digunakan untuk medeteksi terjadinya proses radang.
Hasil percobaan terhadap ekspresi molekul VCAM-1 dengan berbagai pelakuan pada kultur sel endotel, menunjukkan hasil yang negatif, meskipun telah dilakukan pewarnaan imunohistokimia yang direaksikan dengan antibodi antiVCAM-1 dan divisualisasikan dengan 3,3-diaminobenzidin tetrahydro chloride (DAB). Sedangkan kultur sel endotel yang diwarnai dengan antibodi anti ICAM-1 menunjukkan molekul ICAM-1 terekspresikan pada permukaan sel setelah divisualisasikan dengan DAB. Sebelum kultur sel endotel inkubasi dengan Cu2+, LDL, atau LDL teroksidasi, pada kelompok perlakuan telah dipra-inkubasikan terlebih dahulu dengan kurkuminoid 2 ppm dan 8 ppm selama 48 jam. Kurkuminoid ekstrak temu mangga yang diinkubasikan ke dalam kultur diharapkan mampu mencegah/menghambat reaksi oksidasi yang dilakukan oleh sel.
130 Pengaturan ekspresi molekul VCAM-1 dan ICAM-1 dapat dirangsang oleh ion Cu2+ maupun LDL teroksidasi (Packard & Libby 2008). Ion Cu2+ yang diinkubasikan ke dalam kultur sel endotel, merangsang pembentukan radikal bebas yang akan dikeluarkan ke dalam medium pertumbuhan. Hal yang sama juga terjadi pada kultur sel endotel yang diinkubasikan dengan LDL maupun LDL teroksidasi. Radikal bebas yang terbentuk, memicu terekspresinya molekul adhesi maupun sel-sel radang sebagai penyebab awal terjadinya aterosklerosis. Libby (2002); Packard & Libby (2008) menyatakan bahwa, aterosklerosis dapat dipicu oleh radikal bebas, akibatnya sel akan memproduksi sitokina yang digunakan untuk mengekpresikan molekul adhesi sebagai respon pembentukan radang. Telah diuraikan sebelumnya bahwa, aterosklerosis merupakan suatu proses peradangan yang dapat membentuk plak aterosklerosis.
Secara spesifik adanya radikal bebas seperti ROS akan mengaktifkan sel endotel sehingga memproduksi sitokina yang selanjutnya akan menginduksi terbentuknya molekul adhesi (Libby dan Ridker 2006). Molekul adhesi ICAM-1 dilaporkan dapat terekspresi secara berlebihan melalui induksi pakan aterogenik pada hewan coba (Li 1993). Molekul LDL yang teroksidasi dapat meningkatkan ekspresi molekul adhesi pada sel endotel (Libby & Ridker 2006).
Radang berperan penting pada penyakit arteri koronoria dan manifestasi lain dari aterosklerosis. Secara normal sel endotel resisten terhadap molekul adhesi leukosit. Rangsangan awal pada peradangan, seperti diet tinggi asam lemak jenuh, hiperkolsterolemia, obesitas, resisten insulin, hipertensi, dan merokok, akan mentriger molekul adhesi seperti P-selektin, VCAM-1 dan ICAM-1, sehingga monosit dan limfosit yang ada di peredaran darah dapat menempel pada permukaan endotel (Packard & Libby, 2008). Menurut Hansson (2009) dan McGill (1968), peningkatan permebialitas sel endotel merupakan kelainan pertama akibat terjadi jejas arteri. Hal ini merupakan suatu respon non spesifik yang dapat disebabkan oleh virus, toksin, kompleks imun, produk-produk yang dilepaskan sel-sel darah putih, platelet-platelet teraktivasi, spesies radikal bebas (ROS), maupun stres fisik yang tidak lazim. Keadaan ini memicu sel-sel otot polos dan monosit akan masuk ke dalam sel endotel kemudian berproliferasi dan
131 akhirnya akan menumpuk dan menjadi sel busa sehingga terbentuk plak, akibatnya sel endotel menjadi kehilangan fungsi (disfungsi endotel).
Disfungsi endotel menyebabkan adhesi leukosit pada dinding sel endotel merupakan mekanisme utama yang merespon pembentukan radikal bebas dari spesies oksigen reaktif. Adhesi leukosit akhirnya akan menghasilkan oksidan sitotoksik dan mediator peradangan yang mengaktifkan sistem komplemen. Karakteristik proses aterosklerosis dimulai adanya gangguan fungsi endotel memunculkan molekul adhesi VCAM-1, ICAM-1 pada permukaan sel endotel dan merupakan tahap awal kejadian aterosklerosis (Packard & Libby, 2008).
Adam et al (1997) menyatakan bahwa, Nitrit oksid merupakan inhibitor terhadap molekul adhesi monosit pada sel endotel kelinci. Hasil yang sama terjadi juga pada monolayer sel endotel dari aorta babi yang dilakukan secara in vitro. Dalam percobaan ini, ekspresi molekul adhesi diinduksi dengan kolesterol sehingga terbentuk lesi aterosklerosis. Pada kelompok perlakuan yang tidak diberi NO, molekul adhesi ICAM-1, E selektin terekspresikan sedangkan molekul VCAM-1 tidak terekspresikan. Terkspresinya molekul adhesi ini menyebabkan aktivitas permukaan sel meningkat. Jadi jelas apabila ada gangguan pada permukaan sel, maka akan merangsang munculnya molekul adhesi yang merupakan panyebab awal terjadinya aterosklerosis.
Peningkatan aktivitas permukaan sel tidak hanya dipengaruhi oleh LDL teroksidasi, tetapi dapat juga disebabkan oleh molekul adhesi menempel pada permukaan sel memproduksi sitokina maupun radikal bebas. Pada Gambar 25-28, molekul ICAM-1 dapat diekspresikan setelah preparat diinkubasi dengan antibodi primer. Sel endotel yang diinduksi dengan LDL teroksidasi mampu mengekspresikan ELAM-1, ICAM-1 dan VCAM-1 sehingga akan meningkatkan perlekatan monosit.
Dalam penelitian ini, molekul ICAM-1 dapat terekpresikan setelah dilakukan pewarnaan imunohistokimia dan divisualisasikan dengan DAB. Ekspresi ICAM-1 ditandai dengan munculnya warna kuning kecoklatan pada permukaan sel. Hal ini menunjukkan reaksi antigen antibodi terhadap sel yang dikultur dan ekspresi ICAM-1 diinduksi dengan ion Cu2+, LDL maupun LDL
132 teroksidasi. Intensitas ekspresi ICAM-1 berwarna kuning kecoklatan terbentuk cukup tajam dibandingkan dengan preparat yang tanpa diberi antibodi primer.
Efek ion Cu2+ yang diinkubasidalam kultur sel berupa radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan pada komponen penyusun membran sel, seperti asam lemak tak jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid. Radikal bebas yang terbentuk pada sel endotel yang dikultur dapat merangsang pembentukan ICAM-1. Membran merupakan barier penting agar sel dapat berfungsi normal, demikian juga dengan sistem membran sel imun terhadap serangan berbagai benda asing (antigen). Dalam penelitian ini, molekul ICAM-1 dapat diekspresi ke permukaan sel sebagai akibat perlakuan ion Cu2+. Ion Cu2+ dapat menimbulkan stres oksidatif terhadap sel, sehingga sel memproduksi radikal bebas yang dapat merespon pembentukan radang. Kecuali itu, sel juga akan melepaskan sitokina yang akan memicu terekspresinya ICAM-1 sebagai penyebab awal terjadinya aterosklerosis. Dalam pecobaan ini juga, pada kelompok sel endotel yang diinkubasikan dengan LDL teroksidasi (LDL 200 μg + ion Cu2+ 5µM) selain terbentuk ICAM-1 juga terbentuk sel busa. Molekul LDL merupakan lipoprotein yang dapat mengalami oksidasi di dalam sel. Selama berlangsungnya proses oksidasi di dalam sel, maka aktivitas sel menjadi terganggu sehingga akan meningkatkan pembentukan radikal bebas.
Pewarnaan imunohistokimia, memperkuat hasil penelitan yang didapat. Terjadinya reaksi antigen-antibodi (ag-ab1) pada pewarnaan ini, menunjukan sel endotel yang dikultur dan diinduksi dengan LDL dapat mengekspresikan ICAM-1. Adanya biotinylated horse anti-mouse Ig G sebagai antibodi sekunder memperkuat ikatan antigen antibodi secara enzimatis. Ikatan antigen antibodi menyebabkan molekul ICAM-1 tervisualisasikan setelah diberi substrat avidin biotin kompleks horseradish peroksidase sebagai dan diwarnai dengan DAB. Sedangkan pada kontrol reagen, molekul VCAM-1 tidak tervisualisasikan meskipun telah diberi substrat avidin biotin kompleks horseradish peroksidase dan diwarnai dengan DAB (Danskey et al. 2002, Ramos 2005).
Ion Cu2+, LDL dan LDL teroksidasi yang diinkubasi pada kultur sel, merupakan senyawa kimia yang dapat mengoksidasi sel sehingga dapat merusak permukaan membran sel (Catarina et al. 2005; Liby & Ridker 2006). Selain
133 merusak permukaan sel, molekul tersebut dapat merangsang pembentukan radikal bebas. Bila dilihat dari hasil percobaan, kurkuminoid ekstrak temu mangga dengan dosis 2 ppm tidak cukup kuat untuk menahan laju oksidasi yang terjadi pada kultur sel endotel. Sedangkan kurkuminoid ekstrak temu mangga 8 ppm, mampu menurunkan reaksi oksidasi LDL terhadap sehingga terjadi reduksi ekspresi ICAM-1 (Gambar 26 & Gambar 27).
Kerusakan permukaan sel akan mengakibatkan perubahan struktur sel dan aktivitas sel menjadi terganggu. Kondisi sel yang demikian merangsang monosit yang beredar pada aliran darah menempel pada permukaan endotel dan berinfiltrasi ke dalam endotel. Monosit di dalam endotel akan berubah menjadi makarofag, dan pada waktu bersamaan limfosit sel T akan muncul kepermukaan endotel dan masuk ke dalam endotel (Pakard & Libby 2008, Hansson, 2009). Makrofag melalui reseptor svavenger akan mengambil LDL yang terakumulasi di dalam endotel dan akhirnya membentuk kumpulan sel - sel busa. Partikel LDL teroksidasi sebagai akibat dari reaksi oksidasi maupun reaksi enzimatis oleh pembuluh darah yang melepaskan fosfolipid yang dapat mengaktifkan sel-sel endotel dalam mengekspresikan molekul adhesi. Catarina et al. (2005) menyatakan bahwa molekul adhesi ICAM-1 secara normal dijumpai pada permukaan sel endotel, namun dapat terekspresi apabila terjadi peningkatan aktivatas yang diakibat oleh lipoprotein. Lipoprotein dapat menstimuli sitokina atau endotoksin dapat muncul ke permukaan endotel.
Dalam penelitian ini, molekul ICAM-1 dan kumpulan sel-sel busa terlihat sangat jelas. Semua ini terjadi setelah preparat sel endotel (sel line CPAE) direaksikan dengan antibodi anti ICAM-1, sehingga terbentuklah ikatan antigen antibodi. Reaksi antigen antibodi merupakan tanda awal ada gangguan pada permukaan sel yang dikultur. Antibodi primer (kit, anti-ICAM-1 antibody) yang digunakan berasal dari manusia bersifat monoklonal. Antara antigen dengan antibodi primer terjadi ikatan yang spesifik, ini karena epitop dari antibodi primer sesuai dengan paratop dari ICAM-1 antigen. Antibodi sekunder digunakan dalam pewarnaan imunohistokimia memperkuat ikatan antigen - antibodi secara enzimatis. Sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Ramos (2005), bahwa biotinylated horse anti-mouse Ig G merupakan antibodi sekunder yang akan
134 memperkuat ikatan antigen antibodi secara enzimatis. Selanjunya dikatakan bahwa, reaksi pewarnaan ini semakin jelas setelah diberi substrat avidin biotin kompleks horseradish peroxidase dan diwarnai dengan DAB.
Mekanisme dan rangkaian antioksidan yang bekerja dalam menangkap radikal bebas sampai saat ini belum diketahui dengan pasti. Namun salah satu peran penting dari antioksidan yaitu menghambat reaksi oksidasi yang dapat menyebabkan kerusakan membran sel. Kerusakan membran sel akan menyebabkan perubahan tekanan osmosis, dan sel menjadi menggelembung sehingga akhirnya sel menjadi mati. Radikal bebas juga merupakan mediator dari berbagai radang yang berkontribusi pada respon peradangan dan kerusakan jaringan. Untuk mencegah kejadian ini, maka antioksidan sangat diperlukan (Seikemeir et al, 2007, van Hoorn et al. 2003). Lipid yang teroksidasi dapat sebagai antigen dalam merangsang sel imun untuk mengekspresikan limfosit sel T sehingga terbentuk radang (Robertson & Libby, 2008). Sel Radang akan meningkatkan pengambilan LDL teroksidasi, sehingga monosit di dalam intima berubah menjadi marofag, sementara itu limfosit sel T masuk ke intima dan bergabung dengan makrofag. Makrofag yang berinteraksi dengan limfosit sel T dapat menyesuaikan diri dan mensekresikan berbagai produk seperti sitokina, oksigen reaktif dan spesies nitrogen, mengekspresikan faktor jaringan, mengambil LDL teroksidasi untuk pembentukan sel busa, mensekresikan protease dan kemonkina untuk migrasinya sel-sel (Hansson, 2009; Robertson & Libby, 2008)
Respon Sel Otot Polos terhadap Pelepasan Proteoglikan
Proteoglikan mempunyai berbagai fungsi yang sangat luas, seperti membentuk matriks ekstraseluler untuk menghubungkan dan komunikasi antar sel-sel, mengikat masuknya beberapa virus ke dalam sel, termasuk virus herpes simplek. Proteoglikan dapat disekresikan oleh sel-sel otot polos dan dapat berproliferasi di dalam bagian intima pembuluh arteri, sehingga memiliki afinitas yang tinggi terhadap apo B–100. Interaksi LDL-PG tersebut meningkatkan kemampuan LDL teroksidasi dengan cara menginduksi modifikasi struktur (terutama apo B-100) dan meningkatkan waktu tinggalnya di dalam dinding arteri.
135 Keadaan ini mengakibatkan terjadinya modifikasi hidrolitik dan oksidatif lebih lanjut. Proses penahanan dan oksidasi LDL ini akan meningkatkan pengambilan LDL oleh makrofag karena interaksi LDL teroksidasi-GAG meningkatkan afinitas lipoprotein dengan membran sel. Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan sel-sel busa pada makrofag (Kaplan & Aviram 2001).
Hasil respon sel otot polos terhadap pelepasan proteoglikan dalam penelitian ini tidak dapat ditampilkan, karena konsentrasi asam heksarunat yang dikonversikan sebagai proteoglikan tidak terdeteksi oleh KCKT. Kondisi ini kemungkinan disebabkan sel otot polos yang dikultur dalam medium pertumbuhan tidak memproduksi proteoglikan, sehingga tidak dilepaskan ke dalam medium. Kemungkinan lain, konsentrasi proteoglikan yang dihasilkan sangat kecil. Hal ini telah kami lakukan sesuai dengan prosedur penelitian terhadap proteoglikan.
Proliferasi sel otot polos merupakan salah satu tanda adanya gangguan pada pembuluh darah yang menyebabkan terbentuknya aterosklerosis. Sel otot polos mempunyai sifat mitogenik dan proliferatif. Secara normal maupun keadaan abnormal sel otot polos dapat menghasilkan proteoglikan. Proteoglikan merupakan salah satu faktor yang menunjang kejadian aterosklerosis.. Proteoglikan dapat diproduksi, namun bergantung pada seberapa besar gangguan atau hambatan yang ada.
