BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratoris dengan rancangan the post-test only control group design.
P S R
Gambar 4.1. Rancangan Penelitian
Keterangan :
P: Populasi K: Kontrol
S: Sampel
R: Randomisasi P1: Perlakuan dengan dosis 1
K: Kontrol P2: Perlakuan dengan dosis 2
P: Perlakuan P3: Perlakuan dengan dosis 3 O1: Observasi 1
O2: Observasi 2 O3: Observasi 3 O4: Observasi 4
4.2 Unit Analisis dan Rumus Jumlah Sampel 4.2.1 Unit Analisis
Unit analisis adalah soket dari gigi insisif kanan bawah tikus yang telah dilakukan pencabutan. K P1 P2 P3 O1 O2 O3 O4
4.2.2 Sampel
Sampel penelitian ini adalah tikus jantan (Rattus novergicus) Strain Wistar, umur 8-12minggu, dengan berat badan 200 – 300 gram, sehat yang diperoleh dari Laboratorium Biokimia FK Universitas Airlangga.
4.2.3 Rumus Jumlah Sampel
Jumlah sampel menggunakan rumus : (Lemeshow, 1991)
Keterangan :
n = jumlah sampel
Z1- = nilai tabel Z dari 1- ( = 0,05)
Z1- = nilai tabel Z dari 1- ( adalah power of test = 0,8)
0 - a = selisih rerata nilai kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan Setelah dilakukan menggunakan rumus diatas didapatkan hasil jumlah sampel untuk penelitian adalah sebanyak 6 ekor.
4.3 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 4.3.1 Klasifikasi variabel
1. Variabel bebas : gel getah batang pisang dengan dosis 15, 30 dan 60 mg
2. Variabel tergantung : Luas area serabut kolagen.
3. Variabel kendali : tikus jantan, usia 3 bulan, berat badan 200-300 g, kandang tikus, metode pencabutan, luka pencabutan, cara pemeliharaan luka, berat badan dan pemeliharaan tikus.
n = 2. 2
(Z1- + Z1-)2 (
µo
-µ
1) 24.3.2 Definisi Operasional
1. Soket gigi adalah luka pada jaringan penyangga gigi insisivus rahang bawah hewan coba akibat tindakan pencabutan.
2. Getah batang pisang ambon adalah jumlah cairan yang diperoleh menggunakan 200 gram batang pisang ambon ditambahkan 200 cc aquades steril. Hasil air kemudian dimasukkan dalam freeze dry untuk mendapatkan sediaan kering dan dibuatkan sediaan gel dengan dosis 15, 30 dan 60 mg dalam 4% HPMC.
3. Penyembuhan soket gigi adalah peningkatan pembentukan serabut kolagen pada jaringan soket gigi hari ke 7 setelah pencabutan dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400X yang dihubungkan dengan foto mikroskop dengan pengecatan Masson Trichome.
4. Luas area serabut kolagen adalah nilai persentase kepadatan serabut kolagen yang dihitung dengan membandingkan luas area serabut kolagen dengan luas area pengukuran.
5. Serabut kolagen pada pengecatan Masson Trichome digambarkan seperti serat yang bewarna biru.
6. Dosis optimum dalam penelitian ini adalah dosis yang paling baik untuk meningkatkan pembentukan luas serabut kolagen.
7. Luka yang cepat sembuh merupakan luka yang pada hari ke 3 sudah mulai menutup dan mengering, serta pada hari ke 7 luka sudah menutup dengan baik disertai adanya jaringan parut pada kulit.
4.4 Kriteria inklusi dan eksklusi
Pada penelitian ini menggunakan kriteria inklusi yaitu tikus jantan, usia 3 bulan, berat badan 200-300 g, waktu perdarahan 3 menit, pencabutan gigi, penjahitan luka pencabutan. Kriteria eksklusi meliputi waktu perdarahan lebih dari 3 menit, gigi patah pada saat pencabutan, jahitan terlepas sebelum pembedahan, berat badan turun hingga 10%, adanya luka pada anggota tubuh, binatang coba menjadi sakit.
4.5 Luaran Penelitian
Menghasilkan suatu bio-produk atau kandidat dari bahan alam getah batang pisang dalam penyembuhan luka, khususnya regenerasi jaringan periodontal setelah pencabutan gigi.
4.6 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah air getah batang pisang yang disiapkan di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Aquades, HPMC 4%, amonia, n-heksana, etil asetat, anisaldehida asam sulfat, etanol, butanol, asam asetat glasial, sitrat borat, NaCl 10%, kloroform, asam format, FeCl, KOH 0,5 N, ketamin, xylazine, asam formik, formalin 4%, parafin, xilol, ethanol, 3% H2O2, PBS, masson trichome,.
4.7 Alat Penelitian
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah corong bugner, pompa vakum (merk Gast, USA), kertas penyaring whatman no. 1, rotary evaporator,
timbangan analitik, mortar dan stamper, kandang tikus ukuran 40x35x15 cm, terbuat dari plastik ditutup kawat kasa dan dilengkapi tempat makan dan botol minum, botol kecil tempat jaringan, kertas label, benang jahit, jarum jahit, skalpel, tang cabut, vakum, mikropipet, autoklaf, sentrifuse, inkubator, lemari pendingin, freeze dry, gelas objek, rotary microtome, Nikon microscope OPTIHOT-2.
4.8 Tempat Penelitian
Penelitian ini menggunakan beberapa tempat laboratorium, seperti :
1. Unit hewan coba laboratorium Biokimia FK Universitas Airlangga untuk pemberian perlakuan.
2. Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Airlangga untuk membuat sediaan gel getah batang pisang ambon.
3. Institut Tropical Disease untuk mengeringkan getah batang pisang ambon.
4. Laboratorium Patologi Anatomi FK UNAIR untuk pembuatan preparat histologi.
5. Laboratorium Patologi Veteriner FKH UNAIR untuk pembacaan luas area serabut kolagen pada sediaan.
4.9 Pembuatan Jenis Sediaan Getah Batang Pisang Ambon
Untuk memperoleh getah dalam jumlah banyak, maka batang pisang ambon ditimbang seberat 200 gram, masukkan ke dalam blender dengan menambahkan 200 cc aquades steril. Blender campuran batang pisang dan air selama 5 menit hingga halus, kemudian dilanjutkan dengan penyaringan
menggunakan kertas saring Whatman no.1. Filtrat kemudian dikeringkan dengan cara menggunakan freeze dry (Budi, 2013).
4.10 Pembuatan Bentuk Sediaan Gel
Serbuk kering yang diperoleh dari berbagai jenis sediaan diatas, kemudian dibuatkan bentuk sedian gel dengan hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) agar kandungan senyawa aktif dengan mudah bisa melekat pada daerah luka dan cepat diabsorbsi (Budi, 2013).
4.11 Pemeriksaan Potensi Getah Batang Pisang Ambon terhadap Respon Penyembuhan
4.11.1 Pengelolaan Sampel (Budi, 2013)
a. Hewan coba dianestesi sesuai dengan berat badan (30 mg/kg thionembutal).
b. Dilakukan tindakan pencabutan pada gigi insisiv rahang bawah menggunakan tang cabut khusus.
c. Pada kelompok kontrol, setelah pencabutan pada socket hanya diberikan HPMC 4%. Kelompok perlakuan diberi gel getah batang pisang ambon dosis 1, 2 dan 3 dan HPMC 4% tiap perlakuan.
d. Daerah bekas pencabutan kemudian dijahit menggunakan 5-0 vicryl (Ethicon; Johnson & Johnson do Brasil, São Jose dos Campos, SP, Brazil). e. Binatang coba dilakukan pengamatan, yaitu hari ke 7 setelah pencabutan
f. Wistar dikorbankan dengan menggunakan eter untuk memudahkan pengambilan gingiva
4.11.2 Pembuatan Parafin Blok (Boenisch, 2001)
a. Membersihkan spesimen jaringan soket gigi dicuci dengan PBS 3-5 kali untuk menghilangkan dari kontaminan.
b. Kemudian difiksasi pada 4% formalin selama 24 jam. c. Melakukan dekalsifikasi dengan 10% asam formik
d. Melakukan dehidrasi menggunakan alkohol secara bertingkat 30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolute, masing-masing selama 60 menit.
e. Melakukan Clearing menggunakan xilol 2 kali masing-masing selama 60 menit.
f. Melakukan infiltrasi parafin lunak selama 60 menit pada suhu 480C. g. Melakukan blok dalam parafin keras pada cetakan dan didiamkan selama
sehari
h. Meletakan pada holder sehingga soket dapat dipotong secara longitudinal dengan semi-serial ketipisan 6μm dengan rotary microtome.
i. Melakukan mounting pada gelas objek dengan gelatin 5%.
4.11.3 Deparafinasi (Boenisch, 2001)
a. Gelas objek hasil blok parafin direndam dalam xilol 2 kali masing-masing selama 5 menit
b. Rehidrasi menggunakan alkohol berseri mulai dari absolute, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30% masing-masing selama 5 menit.
c. Membilas dengan dH20 selama 5 menit.
4.11.4 Pemeriksaan Pembentukan Serabut Kolagen
Pembentukan serabut kolagen pada proses penyembuhan luka, dapat diamati secara histopatologis jaringan, dengan menggunakan pengecatan Masson Trichome.
Pembacaan hasil menggunakan mikroskop cahaya biasa merk Nikon H600L yang dilengkapi dengan micrometer yang telah terkalibarasi, soft ware pengolah gambar Nikkon Image System dan digital camera DS Fi2 300 megapixel dengan pembesaran 400 kali dari satu sediaan. Kemudian dihitung luas area dari serabut kolagen. Luas area serabut kolagen merupakan persentase (%) densitas kolagen dihitung dengan cara membagi luas jaringan ikat serabut kolagen yang tebentuk pada pusat penyembuhan (healing center) dengan luas total area pengukuran. Luas jaringan ikat serabut kolagen dihitung menggunakan micrometer yang telah terkalibarasi, soft ware pengolah gambar Nikkon Image System dan digital camera DS Fi2 300 megapixel (Klopfleisch , 2013)
4.12 Analisis Data
Dari tabulasi diatas maka dilakukan uji statistik dengan uji SPSS (Statistical Product and Service Solutions) menggunakan ANOVA satu arah (one
way ANOVA), bila terdapat perbedaan yang bermakna maka digunakan uji Tuckey atau LSD.
4.13 Alur Penelitian
Hewan Coba (Tikus) Pencabutan Gigi Insisiv Bawah
Kelompok Perlakuan Kontrol
Diberi HPMC 4% Gel getah batang pisang ambon dosis 15mg + HPMC 4% Gel getah batang pisang ambonDosis 30mg + HPMC 4% Gel getah batang pisang ambonDosis 60mg + HPMC 4%
Tikus dikorbankan pada hari ke 7
Pengecatan Masson Trichome
Pengamatan Mikroskop
Analisis Data
Luka pencabutan dijahit mengunakan 5-0 vicryl
Pembuatan Parafin Blok dan deparafinisasi
