METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental, terhadap mencit sebagai hewan coba. Dipilihnya jenis penelitian ini karena dapat menghasilkan data dengan validitas yang tinggi dan perlakuan dapat diatur oleh peneliti (Sastroasmoro dan Ismael, 2011).
B. Hewan Uji
Hewan uji berupa 30 ekor Tikus putih jantan (Rattus norvegicus), dengan berat badan ± 150-230 gram, dan berumur 4-6 minggu. Tikus putihdiperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan Universitas Setya Budi, Surakarta. Bahan makanan mencit digunakan pakan mencit BR I.
C. Rancangan Penelitian
Penentuan besar sampel dengan menggunakan rumus Federer (Supranto, 2007) yaitu :
Dimana (t) adalah jumlah kelompok perlakuan, dan (n) adalah jumlah sampel per kelompok perlakuan. Dengan rumus tersebut diperoleh minimal sampel tiap kelompok adalah lim ekor tikus. Dalam penelitian ini kami menggunakan enam ekor untuk setiap kelompoknya.
Setelah diadaptasikan selama dua minggu tikus dikelompokkan menjadi lima kelompok, masing-masing enam ekor. Kelompok (i) kontrol, (ii) Ulkus DM, (iii) Ulkus DM+propolis topikal 2,5%, (iv) Ulkus DM+propolis topikal 5%, (v) Ulkus DM+propolis topikal 10%.
Setelahtikus dikorbankan jaringan kaki dikoleksi, untuk kemudian dilakukan pembuatan preparat histologis untuk dideteksi secara imunohistokimia.
1
n>4 (t - 1) (n – 1) > 15
berasal dari satu populasi, sehingga dapat dikembangkan rancangan eksperimental tanpa adanya pengukuran awal (pretest) tetapi hanya pengukuran akhir (post test)/post-test only control group design (Sastroasmoro dan Ismael, 2011).
D. Bagan Rancangan Penelitian
0 30 hari
Gambar 3.Bagan Rancangan Penelitian
Keterangan:
O1 : Observasi kelompok kontrol negatip setelah 30 hari O2 : Observasi kelompok kontrol positip(DM) setelah 30 hari
O3 : Observasi kelompok terapiI (DM+propolis topikal 2,5%) setelah 30 hari O4 : Observasi kelompok terapiII (DM+propolis topikal 5%) setelah 30 hari O5 : Observasi kelompok terapiIII (DM+propolis topikal 10%) setelah 30
hari
E. Kerangka operasional penelitian
O1 I O2 II III O3 36 ekor tikus putih jantan O4 IV O5 V
Rattus norvegicus jantan
Kelompok normal6 ekor
STZ dosis 65 mg/kgBB kadar glukosa darah ≥200 mg/dL
Gambar 4.Kerangka operasional penelitian F. Variabel Penelitian
Klasifikasi variabel diukur menurut tujuan penelitian dan digolongkan dalam beberapa variabel sebagai berikut:
1. Variabel bebas:
Rangsangan tikus Rattus norvegicus jantandengan cara memberikan injeksi STZ 65 mg/kgBB untuk induksi DM, kemudian dibuat luka pada kakinya. Variabel tersebut meliputi:
a. Propolis topikal salep 2,5%. b. Propolis topikal salep 5%. c. Propolis topikal salep 10%.
2. Variabel tergantung:
Variabel tergantung adalah variabel yang akan diteliti, yaitu perubahan a. Ukuran luka.
b. Ekspresi TGF-β. c. Ekspresi MMP-9.
lukapada dorsalis pedis electric shaver
Propolis Topikal 10% (6 ekor) Propolis Topikal 5% (6 ekor) Propolis Topikal 2,5% (6 ekor) Vaselin albumTopikal (6 ekor)
Ukuran luka,ekspresi TGF-β dan MMP-9
1. Hewan coba: jenis tikus, umur dan jenis kelamin, homogen.
2. Pemeliharaan dan bahan makanan, minuman, sanitasi kandang, kelembaban dikondisikan sama.
3. Injeksi: teknik injeksi pada tikus. 4. Pengambilan kulit.
5. Penghitungan ekspresi TGF-β dan MMP-9: teknik imunohistokimia.
G. Batasan Operasional 1. Hewan percobaan
Tikus putih jantan (Rattus norvegicus), dengan berat badan ± 150-230 gram, dan berumur 4-6 minggu.
2. Tikus sehat
Tikus dengan kondisi mata bersinar, bulu tidak kusam, aktif, nafsu makan baik (Kusumawati, 2004).
3. Hewan coba model kaki diabetes
Tikus putih diadaptasikan selama satu minggu, sebelum dilakukan perlakuan. Untuk membuat model DM, tikus diinjeksi STZ dosis 65 mg/kgBB dalam 0.02 M citrate saline buffer (Kim et al., 2006) (100 mM asam sitrat dan 100 mM Na sitrat pada pH 4.5) (Gurney and Howarth, 2009) secara i.p. Hanya tikus dengan kadar glukosa darah sewaktu (GDS) ≥200 mg/dL yang digunakan dalam penelitian ini.
Hewan coba dianestesi menggunakan campuran ketamine/xylazine (50 mg/kgBB ketamine dengan 50 mg/kgBB xylazine) secara i.p. Untuk kemudian pada dorsal pedis dibuat luka ukuran 0,5x0,5 cm menggunakan electric shaver. Luka ditutup dengan Tegaderm (3M Corporation, St. Paul, MN).Pada akhir perlakuan semua hewan coba dikorbankan menggunakan eter, untuk kemudian dikebumikan.
4. Propolis Lebah
Proses pembuatan ekstrak propolis lebah dilakukan dengan teknik maserasi. Propolis kering dibersihkan dan diblender hingga halus selanjutnya ditimbang
sebanyak 500 gram, kemudian dimasukkan ke dalam gelas beaker. Proses maserasi dilakukan dengan menambahkan 3,75 liter etanol 95% sebagai pelarut (Trusheva dkk., 2007). Campuran bahan disimpan selama tujuh hari pada ruangan yang tidak terkena sinar matahari dengan dikocok kuat atau pengadukan dengan spatula pengaduk sebanyak dua kali tiap hari (Susilo, 2007).
Tahap selanjutnya dilakukan penyaringan dengan corong buchner dan kertas saring untuk memisahkan filtrat dari ampas ke dalam labu erlenmeyer sehingga diperoleh fitrat. Hasil filtrasi (penyaringan) yang didapat dievaporasi dengan rotary evaporator pada suhu 45 oC dengan tekanan vakum (<1 atm) sehingga diperoleh
ekstrak propolis yang konsentrasinya kental (± 100 g). Selanjutnya ekstrak propolis diuapkan selama 24 jam di dalam gelas beaker sehingga kandungan etanolnya menguap (Mawardi dkk., 2002; Sabir, 2005). Selain itu untuk mengetahui kandungan etanol dalam ekstrak propolis benar-benar hilang, maka dilakukan metode uji bobot tetap terhadap propolis.
5. Pengukuran kadar Glukosa Darah
Kadar glukosa darah ditentukan menggunakan Blood Glucose Test Meter (Gluco Dr ), dengan range : 20 – 600 mg/dL, dari darah ekor tikus.
Tabel 2. Parameter dan definisi alat ukur penelitian
Parameter Definisi Alat ukur Satuan
Data Skal a Data Ukuran luka
Luka diukur pada hari 0 dan 30 pasca pembuatan luka. Persentase luka dihitung menggunakan rasio
mistar mm2
Dilakukan dengan standar
pembuatan luka, berdasarkan metode yang dilakukan Trousdale
et al.,2009. Lebar. Akhir penelitian dilakukan pengukuran ulang. Luas luka akhir dibanding kan dengan luas luka awal x 100% sehingga didapatkan nilai akhir dalam % Ekspresi TGF-β Ekspresi TGF-β1 penilaian positifitas pemeriksaan IHC menggunakan antibodi monoklonal terhadap TGF-β1. Cara ukur dinilai secara kuantitatif, visual dengan mikroskop cahaya pembesaran 400x terhadap 1000 sel makrofag sebagai sel yang mengekspresikan TGF-β1. Kemudian dihitung jumlah sel-sel tersebut yang imunoreaktif tercat coklat perak, pada membran sel. Jumlah semua sel immunoreaktif yang
ditemukan kemudian dijumlahkan dan selanjutnya dimasukkan sebagai data (bilangan dalam tabel untuk tiap hewan coba) (Tomino, 2000; Susilo, 2006). visual dengan mikroskop cahaya pembesar an 400x Per 100 sel makrofag Rasio
Ekspresi MMP-9 Ekspresi MMP-9 penilaian positifitas pemeriksaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi monoklonal terhadap MMP-9. Cara ukur dinilai secara kuantitatif, visual dengan mikroskop cahaya
pembesaran 400x
terhadap 1000 sel, yang terdiri PMN sebagai yang mengekspresikan MMP-9. Kemudian dihitung jumlah sel-sel tersebut yang imunoreaktif tercat coklat perak, pada membran sel. Jumlah semua sel
immunoreaktif yang ditemukan kemudian dijumlahkan dan
dimasukkan sebagai data (bilangan dalam tabel untuk tiap hewan coba) (Tomino, 2000; Susilo, 2006). visual dengan mikroskop cahaya pembesar an 400x Per 100 sel PMN Rasio
H. Prosedur Pelaksanaan Penelitian
Setelah mencit dikorbankan kulit dikoleksi untuk kemudian dibuat blok parafin. Selanjutnya dilakukan pemotongan jaringan untuk pembuatan preparat histologis. Preparat digunakan untuk pengukuran ekspresi TGF-β dan MMP-9 menggunakan imunohistokimia (IHC) sesuai dengan protokol yang sudah dianjurkan dari pabriknya (Pharmingen, San Diego, California, USA).
I. Tempat penelitian
Sebelas Maret sebagai tempat pemeliharaan hewan.
2. Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran untuk pemeriksaan IHC. J. Waktu
Waktu yang diperlukan dalam penelitian ini selama 5 bulan dengan jadwal penelitian sebagai berikut.
Tabel3. Jadwal penelitian
Jenis Kegiatan 1 2 Bulan ke-3 4 5
1. Persiapan : memesan bahan-bahan, mengumpulkan kepustakaan, diskusi, membuat log book
2. Pelaksanaan Penelitian: Induksi hewan
coba model kaki diabetik, hitung ekspresi TGF-β dan MMP-9, dan analisis data
3. Penyusunan Laporan Tesis
K. Biaya
Biaya penelitian ini diperkirakan ± Rp 35.000.000,-L. Analisis Data
Data disajikan dalam bentuk mean ± SD kemudian dianalisis menggunakan SPSS 22 for windows dengan nilai p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Apabila hasil uji normalitas data variabel untuk masing-masing kelompok sampel berdistribusi normal, maka uji variasi atau perbedaan beberapa mean dapat menggunakan alat uji statistik Analysis of
Variance (ANOVA) atau disebut juga Uji F. Dan apabila terdapat variasi rata-rata untuk ke enam kelompok sampel itu, analisis akan diteruskan dengan mencari perbedaan 2 mean masing-masing kelompok menggunakan uji lanjutan ANOVA yaitu Post Hoc Test. Namun apabila hasil uji normalitas data variabel menunjukkan bahwa distribusi data untuk masing-masing kelompok sampel adalah berdistribusi tidak normal maka uji variasi atau beda beberapa mean dapat menggunakan uji statistik non parametrik Kruskal Wallis. Penelusuran lebih lanjut untuk menguji beda mean masing-masing sampel kelompok dapat menggunakan analisis statistik non parametrik Mann-Whitney.
