DEGRADASI LIGNIN OLEH ISOLAT LOKAL ACTINOMYCETES PADA
SUBSTRAT LIMBAH JERAMI PADI
Heri Satria* dan Nurhasanah
Jurusan Kimia Universitas Lampung, Bandar Lampung, Indonesia 35145 *E-mail : satria_chemistry@unila.ac.id
ABSTRACT
Lignin polymer has connective effect between cell wall components that leads to less biological usefulness of ligo-cellulose substrate. In this study, it has aimed to explored ability some local Actinomycetes isolate to decomposition lignin in rice straw substrate. Eight isolates were tested to screen two best lignin decomposing isolates based on APPL performance. AcP-1 and AcP-7 showed lignin decomposition activity in solid fermentation culture were each determined as 2.33 and10.27% higher than others. The best fermentation performance was done in pH 7 and substrate: moisture level 1:3. Maximum APPL detected at 20 days fermentation in which ligninase activity optimum was reached at 15 days fermentation period.
Keywords : lignin, APPL, Actinomycetes, rice straw ABSTRAK
Polimer lignin memiliki efek penghubung antar komponen dinding sel yang menghasilkan substrat yang secara biologi kurang bermanfaat yaitu ligo-selulosa. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari kemampuan isolate Actinomycetes untuk menguraikan lignin dari jerami padi. Delapan buah isolate diuji untuk mengetahui isolat terbaik yang mampu menguraikan lignin berdasarkan hasil APPL. AcP-1 dan AcP-7 menunjukan kemampuan untuk menguraikan lignin pada kultur pada dengan aktifitas 2,33 dan 10,27% lebih tinggi dari isolat lain. Hasil fermentasi terbaik diperoleh pada pH 7, dengan kelembaban substrat 1:3. Nilai APPL maksimum yang terdeteksi diperoleh pada fermentasi selama 20 hari dimana aktifitas ligninase optimum diperoleh setelah fermentasi selama15 hari.
Kata kunci: lignin, APPL, Actinomycetes, jerami padi 1. PENDAHULUAN
Potensi limbah biomassa berlignosellulosa yang dihasilkan dari kegiatan pertanian di Indonesia mencapai 146,7 juta ton pertahun1). Propinsi Lampung menempati tujuh besar penghasil limbah pertanian dengan prosentasi 4,72% dari sekitar 71,45% limbah padat pertanian2). Biokonversi lignoselulosa dapat menghasilkan beberapa produk yang memiliki nilai ekonomi seperti sumber gula yang dapat dimanfaatkan untuk industri bioetanol, asam sitrat, furfural dan xilitol, atau dapat dimanfaatkan sebagai sumber pakan ternak bahkan pakan bagi manusia3). Pada industri etanol pemanfaatan lignoselulosa merupakan perkembangan teknologi generasi kedua dimana pada generasi pertama industri etanol menggunakan sumber gula dari gula tebu dan amilum dari biji-bijian (jagung, padi, gandum). Hal ini menjadi tidak efektif, mengingat dalam studi terakhir diprediksikan beresiko mengalami benturan dengan kepentingan pangan4).
Kendala dalam pendegradasian lignoselulosa untuk mendapatkan gula-gula yang dapat difermentasi lebih lanjut adalah keberadaan lignin. Lignoselulosa tersusun atas lignin, hemiselulosa, dan selulosa. Lignin terikat pada hemiselulosa dan selulosa yang membentuk struktur berlapis. Struktur ini menghalangi larutan atau enzim yang akan digunakan untuk menguraikan selulosa dan hemiselulosa menjadi gula-gula penyusunnya3). Oleh sebab itu diperlukan proses delignifikasi sebelum sakarifikasi5).
Proses delignifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan perlakuan kimia atau secara biologi. Perlakuan kimia menggunakan klorin, NaOH, hidrogen peroksida, bahkan ozon6) disamping kurang jika ditinjau secara ekonomis juga sangat memberi dampak pencemaran bagi lingkungan. Perlakuan biologi dengan menggunakan mikroorganisme penghasil enzim menjadi salah satu alternatif yang banyak digunakan 7).
Actinomycetes yang merupakan bakterial tanah juga memiliki kemampuan untuk menguraikan lignin. Beberapa strain yang dilaporkan adalah Streptomyces viridosporus T7A8), S. Badius9) Thermomonospora
mesophila10) dan Streptomyces spp.11,12). Kemampuan Actinomycetes dalam mendegradasi lignoselulosa bukan saja dapat dimanfaat untuk proses delignifikasi tetapi juga proses sakarafikasi karena genus ini memiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim-enzim hidrolitik ekstraselular13). Mikroorganisme yang selama ini diketahui memiliki kemampuan menghidrolisis selulosa dan hemiselulosa seperti Trichoderma reseei3) tidak memiliki kemampuan menghidrolisis lignin. Sebaliknya jamur pelapuk akar dari kelas Basidiomycetes mampu mendegradasi lignin tetapi tidak memiliki kemampuan menghidrolisis selulosa dan hemiselulosa14).
Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari proses hirolisis substrat jerami padi oleh isolat bakteri lokal Actinomycetes menggunakan teknik fermentasi padat (Solid State Fermentation; SSF)
2. METODE PENELITIAN
Bahan jerami padi yang digunakan berasal dari limbah pertanian di daerah Pringsewu Lampung dari varietas Ciherang, isolat Actinomycetes diperoleh dari koleksi Heri Satria yang berhasil diisolasi dari jerami padi, bahan kimia yang digunakan berkualifikasi pro-analisa kecuali jika disebutkan secara khusus.
2.1. Uji Kemampuan Isolat menghidrolisis Lignin
Untuk menseleksi isolat yang memiliki aktivitas lignolitik digunakan prosedur pengukuran Acid Precipitable Polymeric Lignin (APPL) dengan metode gravimetri. Inokulum dibuat dengan mengkultur dua loop isolat pada media YM cair dengan komposisi per-liter media : ekstrak khamir 4 g, ekstrak malt 10 g, glukosa 14 g. Inokulum dibiakkan selama 4 hari secara aerobik untuk mendapatkan jumlah sel yang cukup, lalu digunakan untuk memfermentasi media fermentasi dengan komposisi : 2 g jerami padi berukuran 40 mesh, 6 g ekstrak khamir, 5,3 g Na2HPO4 , 1,98 g KH2PO4, 0,2 g MgSO4.7H2O, 0,2 g NaCl, 0,05 g CaCl2.2H2O, 1 ml trace elemen. Derajat pH media dikondisikan pada 7,1-7,2. Isolat dikultur pada 37oC pada 100 rpm selama 7 hari. Untuk mengukur APPL, media fermentasi disaring dengan menggunkan kertas Whatman No.1, lalu filtrat diasamkan dengan penambahan 0,1 ml HCl 12M setiap 2 ml media. Endapan yang terbentuk dari pengasaman dipisahkan dengan sentrifugasi pada 16,000 g selama 30 menit, lalu dicuci dengan HCl encer dua kali dan dikeringkan pada 50oC selama 24-48 jam. Jumlah APPL yang terbentuk ditentukan dengan menggunakan metode gravimetri yaitu selisih berat tabung sentrifuge dan endapan kering ddengan berat tabung sentrifuge awal. Berat APPL yang diperoleh dikonversikan sebagai persentase penguraian lignin dengan membandingkan APPL dengan kandungan lignin jerami awal11).
2.2. Optimasi Solid State Fermentation
Prosedur ini dijalankan untuk memperoleh gambaran moisture dan pH yang akan digunakan selama fermentasi. Dua isolat yang memiliki aktivitas lignolitik terbaik ditumbuhkan pada media inokulum yang dibuat dengan mengkultur dua loop isolat pada media YM cair. Sebanyak 50 ml inokulum ditambahkan kepada media fermentasi yang telah disterilkan. Moisture yang digunakan adalah buffer phosfat dengan variasi perbandingan substrat:moisture sebesar 1:1, 1:2, dan 1:3 dan variasi pH 6,0–8,0 (4). Kultur dilakukan dengan menggunakan wadah kaca dengan memperhatikan sisa ruang diatasnya untuk memberikan suasana fakultatif aerobik selama 3 minggu. Parameter yang diamati dalam fermentasi adalah dekomposisi substrat jerami untuk menghasilkan lignin yang diukur sebagai APPL, dan kehilangan berat kering substrat jerami setelah fermentasi.
2.3. Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Isolat yang memiliki aktivitas lignolitik di fermentasi pada kondisi pH dan perbandingan substrat : buffer optimum yang diperoleh pada tahap sebelumnya. Sebanyak 10 ml inokulum ditambahkan kepada media fermentasi yang telah disterilkan yang berisi 10 g jerami berukuran 40 mesh. Fermentasi dilakukan selama 30 hari, setiap 5 hari secara periodik dilakukan pemanenan dengan menambahkan 100 ml 0.2 M buffer fosfat pH optimum, kemudian diaduk dan disaring dengan menggunakan kertas saring. Filtrat yang diperoleh digunakan untuk mengkuantifikasi APPL, dan aktivitas enzim12).
2.4. Aktivitas Ekstrak Kasar Ligninase
Ekstrak kasar enzim ligninase diperoleh dari fermentasi jerami padi yang dilakukan dengan menambahkan sebanyak 100 ml inokulum pada media fermentasi yang telah disterilkan, berisi 100 g jerami berukuran 40 mesh. Fermentasi dilakukan dengan mengguna-kan kondisi optimum yang diperoleh pada
pembuatan kurva pertumbuhan dan mengikuti prosedur SSF. Setelah itu dilakukan pemanenan dengan menambahkan sebanyak 1L 0.2M buffer fosfat pH optimum ke dalam media fermentasi, kemudian diaduk dan disaring dengan menggunakan kertas saring. Filtrat yang didapat merupakan ekstrak kasar enzim ligninase. 2.5. Pengukuran Aktivitas Enzim Ligninase
Aktivitas ligninase diujikan dengan melihat aktivitas peroksidase yaitu kemampuan enzim untuk mengoksidasi veratryl alkohol menjadi veratraldehid, dengan cara mengambil 1 ml volume akhir reaksi yang terdiri dari 0.2 ml enzim dan 0.8 ml campuran 2.0 mM veratryl alkohol, 0.4 mM H2O2 dan 0.2 mM buffer fosfat pH optimum. Reaksi diinisiasi oleh hidrogen peroksida dan pengukuran absorbansi dilakukan pada λ 310 nm setelah inkubasi 5 menit pada suhu 25ºC15). Satu unit lignin peroxidase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat mengubah 1µmol veratryl alkohol menjadi veratraldehid dibawah kondisi optimumnya. Untuk menentukan konsentrasi veratraldehid digunakan persamaan berikut:
Keterangan : A = Absorbansi
ε = Ekstensi molar veratraldehid (9300 M-1 cm-1) b = Tebal kuvet (1 mm)
c = Konsentrasi (M)
2.6. Metode Analitik Pengukuran Lignin
Lignin yang terdapat pada jerami padi diukur dengan menggunakan prosedur pengukuran lignin Association of Official Analytical Chemist (3). Sebanyak 1 g jerami ditimbang dan dimasukkan dalam Erlenmeyer kemudian ditambahkan 20 ml H2SO4 pekat. Selanjutnya didiamkan selama 2 jam dan dikocok perlahan-lahan. Sampel kemudian ditambahkan air suling sebanyak 250 ml, dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100ºC selama 3 jam. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring yang telah diketahui bobotnya (A). Erlenmeyer dan corong dibilas dengan air suling sebanyak 3 kali. Kertas saring beserta residu di panaskan pada suhu 105ºC selama 1-2 jam atau pada 50ºC selama 24 jam. Kertas saring didinginkan dan ditimbang bobotnya (B). Kertas saring dengan residu diabukan dengan muffle furnace pada suhu 600ºC selama 3-4 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang (C). Kadar lignin dihitung menggunakan rumus berikut :
Keterangan :
B = Bobot kertas saring dan residu setelah dioven (g) A = Bobot kertas saring (g)
C = Bobot abu (g)
3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Kadar Lignin Pada Jerami Padi
Kadar lignin pada jerami padi yang digunakan sebagai media fermentasi dapat dihitung berdasarkan prosedur AOAC yaitu dengan menggunakan asam pengoksidator (H2SO4) untuk menghidrolisis lignin dalam suasana asam5). Lignin sebagai senyawa polimer aromatik yang telah terhidrolisis akan terendapkan sedangkan komponen lainnya tetap berada dalam filtrat. Berat lignin pada jerami padi merupakan berat lignin yang terendapkan dikurangi dengan kadar abunya, sehingga diperoleh kadar lignin sebesar 29.2%. Hasil ini tidak berbeda jauh dari penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Wyman16), yaitu sebesar 23.4%. 3.2. Penapisan Isolat Lignolitik
Delapan isolat Actinomycetes yang diujikan aktivitas lignolitik untuk mengetahui besarnya kemampuan isolat tersebut dalam menguraikan lignin pada substrat jerami padi. Penapisan isolat yang
memiliki kemampuan mendegradasi lignin dilakukan dengan pengukuran APPL yang dihasilkan11), karena lignin dapat diendapkan. Lignin merupakan polimer aromatik yang terikat dengan molekul-molekul penyusun tumbuhan melalui ikatan eter dan karbon. Polimer aromatik lignin yang dihasilkan dari aktivitas pemutusan ikatan merupakan senyawa kompleks yang larut dalam air sehingga pada akhir fermentasi akan berada pada fase cair. Jika dilakukan pemisahan dengan penyaringan maka polimer lignin akan terdapat pada filtrat. Penambahan HCl akan menurunkan pH sehingga menurunkan kelarutan polimer lignin tersebut. Pada pH 2 polimer ini akan kehilangan kelarutannya di dalam air dan akan membentuk endapan jenuh. Endapan tersebut akan dihitung sebagai persentase lignin yang terhidrolisis. Isolat Actinomycetes yang memiliki nilai paling besar adalah AcP-1 yaitu sebesar 2.33% dan AcP-7 yaitu sebesar 10.27% (Gambar 1). Sehingga isolat AcP-1 dan AcP-7 yang akan digunakan pada proses fermentasi fase padat dengan variasi pH dan perbandingan substrat:buffer optimum.
Gambar 1. Grafik hasil pengukuran APPL sebagai indicator aktivitas lignolitik isolat Actinomycetes pada jerami padi.
3.3. Optimasi Fermentasi Fase Padat
Optimasi fermentasi fase padat terhadap isolat AcP-1 dan AcP-7 dilakukan menggunakan media jerami padi untuk mengetahui faktor lingkungan terutama pH serta pengaruhnya terhadap reaksi metabolisme dari mikroba tersebut. Untuk menumbuhkan mikroba pada media memerlukan pH yang stabil terutama pada mikroba yang dapat menghasilkan asam, sehingga pada medium pertumbuhan diberi tambahan buffer untuk menjaga kestabilan pH. Perbandingan volume buffer dikondisikan untuk memberikan suasana kelembapan yang juga dapat mempengaruhi aktivitas suatu mikroba dalam mendegradasi lignin.
Variasi pH 6, 7 dan 8 serta perbandingan substrat:buffer (1:1, 1:2, 1:3) memberikan variasi aktivitas lignolitik berdasarkan pengukuran nilai APPL. Baik Isolat AcP-1 maupun AcP-7 memilki nilai APPL tertinggi pada kondisi pada pH 7 dan perbandingan substrat:buffer 1:3 (Gambar 2). Hal ini menunjukkan bahwa Actinomycetes mampu hidup dan menghidrolisis lignin secara optimum pada kondisi pH normal namun lembab. Dimana isolat AcP 1 memiliki kemampuan untuk menghidrolisis lignin sebesar 8.4 mg/g substrat dan nilai APPL pada isolat AcP-7 sebesar 64.0 mg/g substrat. Perbedaan nilai APPL yang sangat signifikan ini kemungkinan disebabkan oleh perbedaan karakteristik fisiologis isolat yang perlu diteliti lebih lanjut secara mikrobiologi, sehingga tingkat kemampuannya dalam menghidrolisis lignin pada jerami pun berbeda.
Gambar 2. Grafik aktivitas lignolitik pada optimasi fermentasi berdasarkan variasi pH dan perbandingan substrat : buffer.
3.4. Kurva Pertumbuhan
Dengan menggunakan kondisi pH 7 dan perbandingan substrat : buffer 1:3, dilakukan fermentasi selama 30 hari pada substrat jerami menggunakan isolat Actinomycetes terpilih AcP-1 dan AcP-7. Langkah ini bertujuan untuk menentukan waktu optimum yang dibutuhkan oleh isolat AcP-1 dan AcP-7 dalam menghidrolisis polimer lignin menjadi produk yang larut dalam air dan CO2 (6). Kemampuan isolat Actinomycetes dalam menghidrolisis lignin dapat dilihat berdasarkan nilai APPL (Gambar 3.).
Gambar 3. Kurva pertumbuhan Actinomycetes pada media padat fermentasi jerami.
Dari Gambar 3, dapat diketahui bahwa kedua isolat AcP-1 dan AcP-7 mencapai aktivitas tertinggi dalam menghidrolisis lignin pada hari ke 20. Sama halnya dengan penelitian yang sebelumnya telah dilakukan oleh Yamac dan Tamer11) dimana dijelaskan bahwa aktivitas tertinggi hidrolisis lignin oleh Actinomycetes menggunakan metode APPL berada pada minggu ke-3.
3.5. Aktivitas Ekstrak Kasar Ligninase
Untuk mengetahui aktivitas ligninase pada saat fermentasi dilakukan pengujian aktivitas ligninase dengan melihat aktivitas peroksidase, yaitu kemampuan enzim untuk mengoksidasi veratryl alkohol menjadi veratraldehid pada λ 310 nm, menggunakan spektrofotometri UV-Vis. LiP merupakan enzim lignolitik yang mampu mengoksidasi inti aromatik (fenolik dan non-fenolik) melalui pelepasan satu elektron menghasilkan radikal kation dan fenoksi (2) seperti ditunjukan pada reaksi redoks berikut :
LiP + H2O2 H2O2 + LiPI (Komponen 1)
LiPI + Valc Valc + + LiPII (Komponen 2)
LiPII + Valc + 2H+ Valc+ + H2O + LiP (Nativ enzim)
LiP adalah enzim peroxidase ekstraseluler yang aktivitasnya bergantung pada H2O2, mempunyai potensial redoks yang luar biasa besar dan pH optimum14). Data yang ditunjukkan pada Gambar 4. menunjukkan bahwa isolat AcP-7 memiliki aktivitas unit lebih besar yaitu 0.052 U/ml sedangkan AcP-1 memiliki aktivitas unit sebesar 0.025 U/ml. Namun aktivitas kedua isolat tersebut optimum pada waktu inkubasi yang sama yaitu 15 hari.
Gambar 4. Aktivitas unit ligninase yang dinyatakan dengan aktivitas lignin peroxidase (LiP).
Dari Gambar 3. Dan Gambar 4. menunjukkan bahwa aktivitas enzim ligninase optimum pada hari ke-15,sehingga terjadi peningkatan residu lignin yang terukur sebagai APPL pada hari ke-20. Jika dilihat dari bentuk kurva yang diperoleh, fase stasioner Actinomycetes tercapai pada hari ke-20.
4. KESIMPULAN
Dari delapan isolat Actinomycetes yang diujikan diperoleh dua isolat yang memiliki kemampuan menghidrolisis lignin jerami tertinggi, yaitu isolat AcP-1 dan AcP-7, dengan kemampuan menguraikan lignin masing-masing sebesar 10,27% dan 2,33%. Waktu inkubasi optimum yang dibutuhkan oleh isolat AcP-1 dan AcP-7 untuk menghidrolisis lignin jerami padi berada pada hari ke 15 ditinjau dari aktivitas lignin peroksidase (LiP) optimum, namun polimer lignin baru dapat terakumulasi pada hari ke 20 berdasarkan nilai tertinggi menggunakan metode APPL.
UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian ini dibiayai oleh DIPA Universitas Lampung dengan surat perjanjian kontrak penelitian antara Lembaga Penelitian dengan Pembantu Rektor II Universitas Lampung Nomor : 1896/H26/KU/2009
tanggak 1 Juli 2009 atas nama Heri Satria. Penulis mengucapkan terimakasih kepada Indar, Yoanita dan Iman yang telah membantu secara teknis di Laboratorium.
DAFTAR PUSTAKA
1. Abdullah. K, 2001. Biomass energy potentials and utilization in Indonesia. Indonesian Renewable Energy Society (IRES).http://www.repp.org/discussiongroups/resources/stoves/ Fuels/msoB2D82.pdf. 7 Jul 2007;10:48 am
2. Syamsu, J.A. 2003. Daya dukung limbah pertanian sebagai sumber pakan ternak ruminansia di Indonesia. Buletin Peternakan Indonesia Wartazoa 13: 30-37.
3. Howard, R.L., Abotsi, E., Jansen van Rensburg, E.L., Howard S. 2003. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. Afr. J. Biotechnol. 2: 602-619
4. Thomsen, M.H., Hauggaard-Nielsen, Petersson, A., Thomsen, A.B., Jensen, E.S. 2007. Sustainable bioethanol production combining biorefinery principles and intercropping strategies.
http://www.risoe.dk/rispubl/reports/ris-r-1608_94-105.pdf. 6 Sept 2008; 10:32 am
5. Taherzadeh, M., and Karimi, K. 2008. Pretreatment of lignocellulosic waste to improve ethanol and biogas production: a review. Int. J. Mol. Sci., 9: 1621-1651.
6. Beg, Q.K., Bhushan, B., Kapoor M. and Hoondal, G.S. 2000. Production and characterization of thermostable xylanase from a Streptomyces sp. QG-11-33. J Ind Microbiol Biotechnol. 24: 396-402. 7. Perez, J., Munoz-Dorado, J., de la Rubia, T., Martinez, J.. 2002. Biodegradation and biological
treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview. Int. Microbiol., 5: 53-63.
8. Crawford, D.L., Pometto III, A.L., Crawford, R.L. 1983. Lignin degradation byStreptomyces viridosporus: isolation and characterization of new polymeric lignin degradation intermediate. App. and Env. Microb., 45: 898-904
9. Bogmeyer, J.R., Crawford, D.L. 1985. Production and characterization of polymeric lignin degradation intermediates from two different Streptomyces spp. App. and Env. Microb., 49: 273-278
10. Mc Charty, A.J., Peterson, A., Broda, P.M.A. 1986. Lignin solubilazation by Thermomonospora mesophila. Appl. Microb. and Biotechnol., 24: 347-352
11. Yamac, M., and Tamer, A.U. 2008. Lignin degradation and acid precipitable polymeric lignin (APPL) accumulation by selected Streptomyces strain in submerged and solid state culture system. JABS. 2: 55-61.
12. Ramachandra, M., Crawford, D.L., Pametto III, A.L. 1987. Extracellular enzyme activities during lignocellulose degradation by Streptomyces spp.: a comparative study of wild-type genetically manipulated strains. App. And Env. Microb., 53: 2754-2760.
13. Wendisch, F.K., Kurtzner, H.J. 1992. Role of Streptomycetaceae in biodegradation in: Balows, A., Truper, H., Dworkin, M., Harder, W., Schleifer, K.H. editor. The Procaryotes, A Handbook On The Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Application. 2nd ed. vol 1. Springer-Verlag. New York
14. Gold M.H. and Alic, M. 1993. Molecular biology of the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Microbiol. Rev., 57: 605-622.
15. Yadav, M. and Yadav, K.D.S. 2005. Enzymatic characteristic of ligninperoxidases from Penicillium citrinum, Fusarium oxysporum and Aspergillus terreus using n-propanol as substrate. Indian J. of Biochem. and Biophysics., 48-51.
16. Wyman, C.E. 2002. Potential synergies and challenges in refining cellulosic biomass to fuels. Biotechnol Progress. 19: 254-262.
