A.
Prinsip Dasar HPLC Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponenkomponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solutesolut terhadap fasa diam. Solutsolut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solutsolut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solutesolut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. B.
Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu . Fasa Gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom menuju detector. Sebaliknya dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa
komponenkomponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solutesolut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan fasa gerak HPLC Zat cair yang akan
digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut . zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis. . zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu
interpretasi kromatogram. . zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. . zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. . zat cair tidak kental. . sesuai dengan detektor. Jenis fasa gerak Fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan komponenkomponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak.
. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan . Menghasilkan tekanan sampai psi pons/in . Keluaran bebas pulsa . Kecepatan alir berkisar antara , mL/menit . Bahan tahan korosi Dikenal tiga jenis pompa yang masingmasing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic. Pompa
reciprocating Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundurmaju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Pompa
displacement Pompa ini menyerupai syringe alat suntik terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut mL dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut. Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan lt psi serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom. . Unit Sistem Penyuntikan atau
keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC . Injeksi Syringe Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum seal karet dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari dan sering lebih jelek. . Injeksi stopflow Injeksi stopfloe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. . Kran Cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah a sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop, b kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat digantiganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari hingga L. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini
memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume , hingga L.
waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir . Detector berdasarkan absorpsi UV merupakan detector HPLC yang paling banyak di pake. C. detector sepesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solute yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat C atau C yang terikat pada silica gel. dapat dilaksanakan pada suhu kamar. Detector HPLC dikelompokan ke dalam tiga jenis. D. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector.. yang penampakannya ditunjukan oleh perekam pencatat recorder. cepat dan mudah melaksanakannya. . . yakni beberapa milliliter per menit. . tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponenkomponennya. detektor HPLC dapat divariasi dan unik. tidak merusak cuplikan. Cara Kerja HPLC Mulamula solven diambil melalui pompa. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah . Hal ini terutama sering dilakukan untuk analisis senyawasenyawa hidrokarbon aromatic polisiklik PAH atau residu pestisida dalam makanan. Terakhir. Sebaliknya. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil. detectoe yang bersifat umum terhadap solute setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. . Rekorder menghasilkan kromatogram zatzat yang dipisahkan dari suatu sampel. . sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersamasama dengan solven masuk ke dalam kolom. walaupun demikian detector harus memenuhi persyaratan berikut cukup sensitive. stabilitas dan keterulangan tinggi. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar. Detector Berbagai detector untuk HPLC telah tersedia.realibilitas tinggi dan mudah digunakan. mudah
memperoleh cuplikan. ideal untuk molekul besar dan ion. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya. Kolom utama berisi fas diam. yang dipasang tepat pada sampel loop. kromatografi cair kinerja tinggi KCKT atau HPLC High Performance Liquid Chromatography mempunyai beberapa kelebihan. Suatu solven dengan polaritas rendah. . daya pisahnya baik. yaitu detector umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanaya solute. Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Dengan pertolongan mikrosiring. respon linear terhadap solute. misalnya CH berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CHOH murni. dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Sebagai alternative lain. menjamin pemisahan yang baik pada C yang terikat pada silica gel.
. . Kelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas. . Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih psi dengan laju alir rendah. Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. . diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. peka. Detector elektrokimia paling banyak dipakai terutama dalam HPLC penukar ion.
. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak. Bandung ITB . untuk kolom cm. alkaloid. . Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori lebih dari . alkaloid. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak. dengan fase diam berupa kolom dan larutan tertentu sebagai fase geraknya Instrumentasi HPLC yaitu . Fasa Gerak . IV.
kromatografi cair kinerja tinggi KCKT atau HPLC High Performance Liquid Chromatography mempunyai beberapa kelebihan. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak. segala senyawa jenis fenol. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative. . DAFTAR KEPUSTAKAAN Drs. Kolom . Malang JICA FMIPA UNM Sumar Hendrayana. KIMIA ANALITIK II. lipid dan gula. Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. lipid dan gula. Soebagio dkk. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel . segala senyawa jenis fenol.E. misalnya terpenoid tinggi. KIMIA PEMISAHAN. dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. K dkk. Pompa . Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongangolongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponenkomponennya. Cara Kromatografi Preparatif. misalnya terpenoid tinggi. Detector Dibandingkan dengan kromatografi gas. Bandung Rosdakarya Hostettmann. KESIMPULAN Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan kepolarannya.
. Kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya adalah bentuk peningkatan dari
kromatografi kolom. Oleh karena sampel yang digunakan sangat kecil lt g maka diperlukan detector yang sangat peka. Pada KG yg dianalisis harus menguap. dll Bekerja pada HPLC membutuhkan proses berat sebelum estimasi seperti filtrasi.HPLC/KCKT HPLC / KCKT Kromatografi cair tingkat tinggi metoda kimia amp fisikokimia. Teknologi kolom partikel kecil m ini memerlukan sistem pompa bertekanan tinggi yang mampu mengalirkan fase gerak dengan tekanan tinggi agar tercapai laju aliran mL/menit. . Data yang diperoleh HPLC adalah nonhomogen dan tidak pernah tanpa kebisingan fluktuasi dan kesalahan selama estimasi. . .degassing. kolom dan juga menggunakan kemurnian nilai tertinggi dari pelarut. Sistem dan Instrumen KCKT Sistem KCKT terdiri dari dua sub sistem yaitu sub sistem pemisahan dan sub sistem pendeteksian detektor. berbeda dg KCKT analit dalam cairan fase gerak HPLC teori Prinsip HPLC terlibat dalam pengujian adalah pemisahan senyawa dalam campuran yang lebih efisien dan juga cepat dari pada kromatografi kolomtradisional. . . . Alihalih pelarut diizinkan menetes melalui kolom di bawahgravitasi. Pada KCKT diperkenalkan penggunaan fase diam yang berdiameter kecil dalam kolom yang efisien. itu adalah dipaksa melalui tekanan tinggi gt atmosfer yang membuat jauh lebih cepat. Kelebihan memisahkan molekul dr suatu campuran mudah melaksanakannya kecepatan analisis n kepekaan tinggi
menghindari dekomposisi resolusi yg baik mnggunakan berbagai macam detector dapat dgnakan kmbali mudah mlkukan sample recovery Kekurangan Ini adalah teknik yang mahal karena memerlukan instrumentasi mahal HPLC. . dll derivatisasi Sistem operasi
membutuhkan pelatihan sebelum HPLC dan efektif HPLCpemecahan masalah keterampilan. buffer. .
. Arah pengaliran fase gerak harus selalu sama. Laju aliran pelarut mL/menit. Jenis detektor untuk deteksi adalah detektor indeks bias. Sistem injektor sampel sampel diinjeksikan langsung kedalam aliran pelarut dalam kolom dengan semprit mikro melalui septum injektor menggunakan diafragma atau tanpa diafragma.. elektrokimia dan spektrometri massa. fluoresensi. mm. dua jenis kolom kolom preparatif dan kolom analitik. . ultraviolet sinar tampak. Jenis pompa yang dipakai pompa pneumatik. System KCKT Pemisahan n Pemasok pelarut sampel detektor pendeteksia Skema PompapelarutkolomdetektorkoleksiKCKT preparatif Suntikan sample integrator limbah . pompa endesakan tetap dan pompa torak. Detektor Detektor dihubungkan dengan pipa baja tahan karat atau pipa jenis lainnya dengan ujung keluaran kolom. yang banyak dipakai adalah sistem suntik katup kitar loop valve. .. Kolom dapat dipanaskan sampai oC agar dihasilkan pemisahan yang lebih efisien. Pompa Sistem pompa bertekanan tinggi mengalirkan pelarut / fase gerak dari bejana pelarut ke kolom melalui pipa tekanan tinggi. . Panjang kolom antara cm . sampel yang diinjeksikan melalui injektor kedalam kolom. Volume suntik biasanya L dengan keterulangan . Sistem pemisahan sistem pemasok pelarut dengan bagian utamanya a. Ujungujung kolom
dihubungkan dengan pipa baja tahan karat melalui fiting dan terminator dari pompa/injektor di ujung yang satu dan pada ujung yang lain dihubungkan dengan detektor. diameter dalam . memantau aliran pelarut yang keluar dari kolom dalam waktu yang sebenarnya. Kolom untuk pemisahan analitik diameter dalam yang kecil mm. .. tekanan psi. Sistem pendeteksian terdiri dari detektor yang dihubungkan pada ujung akhir kolom. pompa yang mengalirkan pelarut b. Kolom Kolom KCKT terbuat dari pipa baja tahan karat..
Adsorbsi. asam. menetukan kadar senyawasenyawa aktif obat. . dan proteinprotein dalam cairan fisiologis. Pemisahan secara fisiko . pemisahan akan mengalami peningkatan dengan kesetimbangan interaksi. produk hasil samping proses sintesis. dengan . yaitu perbedaan stereochemistry melihat kelarutan melihat BM perbedaan muatan TINGGI KCKT
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi KCKT atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI KCKT MAKALAH KROMATOGRAFI PENDAHULUAN Kromatografi merupakan pemisahan fisiko kimiawi. dan sampel. banyaknya lempeng dinyatakan dengan N. Makin banyak N terjadi pelebaran puncak. High pressure tekanan tinggi bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal. Pemisahan ini dapat terjadi kalau interaksinya berulang. Low pressure tekanan rendah . .kimiawi yang melibatkan interaksi antar fase gerak. Afinitas. Persamaan Van Deemter H Dasar yang digunakan dalam pemisahan adalah . . . karena Senyawa tersebut berjalan ke bawah mengalami difusi kalau dibawa fase gerak. atau produkproduk degradasi dalam sediaan farmasi. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar
senyawasenyawa tertentu seperti asamasam amino. Partisi.asam nukleat.
KROMATOGRAFI CAIR kromatografi. fase diam. Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu . Kita dapat mengetahuinya dengan kuantitas ulangan yang dinyatakan dengan teori plate terjadi pada setiap lempeng. Solute CAIR KINERJA TINGGI KROMATOGRAFI KCKT fase Kalau Solute fase gerak geraknya fase gas diam fase gerak pada melihat dengan dengan berdasrkan KINERJA fase diam Interaksi yang terjadi . Ion Exchange. Fase diam dan fase gerak yang digunakan. N Makin banyak N.
jika ditarik cairan masuk. hal ini akan teramati pada spektrum yang puncakpuncaknya terpisah. antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan dengan pendingin liebig/ ion exchange karena ikatannya bisa lepas
dan bisa juga terjadi bleeding. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut.Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom preparatif. Detektor Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. c. rentang tanggapan liniernya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa. cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong. Pompa Pompa pendesakan tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa semprit. . injeksi dilakukan padakinerja atmosfir. bila valve difungsikan. stop flow aliran dihentikan. Pada posisi load. Instrumentasi . dan kecepatannya untuk sampai ke detektor waktu retensinya akan berbeda. Partikel kecil dari septum yang terkoyak akibat jarum injector dapat menyebabkan penyumbatan. Septum septum yang digunakan pada kckt sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. A. Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap. tidak banyak berderau. Loop valve tipe injector ini umumnya digunakan unutk menginjeksi volume lebih besar dari dan dilakukan dengan cara automatis dengan menggunkan adaptor yang sesuai. sampel diisi ke dalam loop pada kinerja atmosfir. yaitu a. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarutpelarut kromatografi cair. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak diperngaruhi. . b. Ada macam system injector. Tekanan harus bar. volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual. maka sampel akan masuk dalam kolom. diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya. B. alatnya terdiri dari kolom sebagai fasa diam dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. dan aliran dilanjutkan lagi. . Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampai atmosfir. . Detektor yang baik sangat peka. system tertutup. Injektor Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom kepala kolom. Kolom Kolom merupakan jantung kromatograf. Prinsip kerja Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analitanalit berdasarkan kepolarannya. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Urutan skala polaritas golongan fluorocarbon lt golongan hidrokarbon lt senyawa terhalogenasi lt golongan eter lt golongan ester lt golongan keton lt golongan alkohol lt golongan asam. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. tetapi tandonnya terbatas. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Cara meminimalkan HETP . u kecepatan alir fase gerak o temperatur kolom diturunkan untuk mengatasi difusi laminer . tR / W N dapat diperoleh dari hasil kromatogram dengan menginjeksikan suatu senyawa sehingga mendapatkan puncak. non equilibrium mass transfer C terjadi karena fase gerak ditambah terus sebelum terjadi keseimbangan o partikel diperkecil. Efisiensi kolom dapat dilakukan dengan Van Deemter equation N L / HETP N . Macam Macam Optimasi . difusi longitudinal B o memperkecil diameter partikel. N akan maximal bila H minimal. difusi eddy A o supaya cairan tidak kemanamana perlu memperkecil partikel o kerapatannya diperbesar . Rs yang bagus . Efisiensi kolom dapat diukur N. luas area makin besar o ketebalan fase diam cair makin tipis o kerapatan diperbesar. tidak bereaksi sesuai dapat mempunyai memungkinkan memperoleh dengan harganya Gambar syaratsyarat tanpa dengan dengan melarutkan viskositas mudah cuplikan jika Instrumentasi C. Jenisjenis UV Retraktif indeks konduktifitas Elektrokimia detektor / RI MS Vis Detector detector Detector PDA ELSD Detector gerak cemaran kemasan detektor cuplikan rendah diperlukan wajar . kerapatan diperkecil o u dipercepat.Tujuan Optimasi Memisahkan sampai baseline dengan waktu seminimal mungkin. Optimasi Selektivitas .. yaitu kemampuan memberikan small bath. Fase Fase gerak memiliki murni. Optimasi Efisiensi Kolom Adalah
jumlah keterulangan interaksi. u diperlambat supaya terjadi kesetimbangan o temperatur dinaikkan .
adsorpsi perbedaan pada stereokimia orto lebih cepat dilepaskan ke fase gerak sedangkan para paling lama dilepaskan tangan terikat partisi perbedaan pada kelarutan
senyawasenyawa yang akan dipisahkan ion exchange pada muatan senyawasenyawa . Pada KG.macam zat. Jenisjenis KCKT Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak. K ns nm dengan mengubah tersebut Optimasi ns / molekul dalam fase molekul dalam fase fase gerak kelarutan dalam fase gerak akan Kapasitas nm diam gerak senyawa berbeda. . Tergantung dari sifatsifat senyawa dan memilih berbagai interaksi yang ada dalam kolom. misalnya Silika gel direaksikan dengan klorosilan Fase gerak bersifat polar Keuntungan kromatografi fase terbalik Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya Senyawa ionic dapat dipisahkan Air dapat digunakan sebagi pelarut E. gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat. Detektordetektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram gram. Untuk analisis yang tidak rumit uncomplicated. KCKT kolomnya dibedakan menjadi a. waktu analisi kurang dari menit bisa dicapai Selektif Berbeda dengan KG. pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Radiometri. a. Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.Untuk menentukan
kemampuan kolom memisahkan. jumlah jumlah komposisi D. misalnya Silika gel Fase gerak bersifat non polar b. Indeks Refraksi. Keuntungan dan Kerugian Keuntungan Cepat Waktu analisis umumnya kurang dari jam. dll dapat juga digunakan dalam KCKT. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar menit. Peka Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram gram dari bermacam. Detektordetektor seperti Spektrofotometer Massa. Kromatografi fase terbalik Fase diam sifatnya non polar. Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana Fase diam normal bersifat polar.
Yogyakarta Skoog.and West DM. Analisis Kimia Kuantitatif.New York Mulja. Kolom dapat dipakai lagi Berbeda dengan kolom kromatografi klasik. Mudah memperoleh kembali sampel Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa. b. Sixth.Holler. Surabaya Sastrohamidjojo. biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik.DA.Florida Underwood.D. Ideal untuk molekul besar dan ion zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah
.A.Pharmaceutical Analysis. Penerbit Erlangga. .. Suharman.. John Wiley amp Sons Inc. Christian G.J Pharm.. Churchill Livingstone.G. Analisis Instrumental. Kromatografi.Harjono. D. Sampel Perlu yang tenaga digunakan ahli Kerugian Mahal jumlahnya sedikit untuk mengoperasikan Daftar Pustaka A. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut. Anal. Analytical Chemistry. . . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.L. Jakarta Watson.Edinburg ..J.Clark.. Hardcourt Grace College.Analytical Chemistry.FJ. oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Six Edition. . Biomed. Shafaati and B.. kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. Airlangga University Press. Universitas Gadjah Mada.Muhammad. kolom KCKT dapat digunakan kembali reusable .
didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan atm. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari
komponenkomponen dalam campuran. Pada proses ini meliputi tekanan dan flow eluent. Diagram alir HPLC Pada umumnya windows program HPLC menampilkan urutan dari proses kerja HPLC.HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Gambar di atas sebagai contohnya. Mari bro kita pelajari tiap bagiannya Injeksi sampel port injection Bagian ini ada yang manual dan
otomatis. Tapi disini saya tunjukkan port injection manual. Dimana besarnya volume sampel yang diinjeksi hanya sekitar l. untuk itu mari kita mempelajari secara bertahap. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. . Kolom dan pelarut Membingungkan ya benar. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi. itu kesan pertama kali saat kita mempelajari fase dalam kromatografi. terlihat pada gambar warna hijau dimulai dari injeksi sampelpompaflow eluentkolom terdapat dalam termostatdetectorproses perhitungan hasil kromatogram. Ini membuatnya lebih cepat. dengan alat penginjeksi yang disebutsyringe. Metodemetode ini sangat otomatis dan sangat peka. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekulmolekul yang melintasinya.
Ex perbandingan water acetonitril dan setiap analisa. senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. ingat bukan air. Senyawasenyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan
senyawasenyawa non polar. akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam. Fase balik HPLC Dalam kasus ini. molekulmolekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. methanol dan acetonitril biasa. ukuran kolom sama. Oleh karena itu. tiap senyawa
menggunakan perbandingan yang berbeda. Sebagai contoh. di dalamnya terdapat kolom. Ini berarti bahwa molekulmolekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. pelarut polar digunakan berupa campuran air. Fase normal HPLC Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah kita baca tentang kromatografi lapis tipis KLT atau kromatografi kolom. tapi ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantairantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika fase diam dan molekulmolekul polar dalam larutan. tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantairantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon atau .Pada gambar diterangkan bahwa pada analisa kali ini
menggunakan perlarut polar. Flow dan preasure dikerjakan oleh pompa. methanol dan acetonitril. Ini adalah dasar HPLC like disolve liketolong dipahami lebih dalam Termostat Thermostat dikenal sebagai alat pengatur suhu kolom. Oleh karena itu. . Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal . Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC. Dalam kasus ini. Dari bagian inilah suatu zat dapat terdeteksi. Senyawasenyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawasenyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen
sebagaimana halnya senyawasenyawa tersebut berada dalam molekulmolekul air atau metanol misalnya. dari mengambil pelarut dalam botol hingga menyalurkan pelarut ke dalam kolom. mm dan mungkin kurang/lebih dari nilai ini dengan panjang sampai mm. tapi ini khusus untuk HPLC solvent. Oleh karenanya. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Ada dua perbedaan dalam HPLC.
senyawasenyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Dimana tiap pelarut dapat diatur perbandingannya secara otomatis. Walaupun disebut normal.
Banyak senyawasenyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Untuk beberapa senyawa. jika kita menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawasenyawa. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada tekanan yang digunakan karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut flow pelarut berpengaruh pada banyaknya pelarut yang melewati kolom kondisi dari fase diam tidak hanya terbuat dari material apa. Jika kita menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan. tetapi juga pada ukuran partikel komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hatihati. kita akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap. Detektor Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. . Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan
ultraviolet.Waktu retensi Mengapa pembahasan waktu retensi saya letakkan di bagian kolom Karena dari kolom inilah senyawa terpisah pada waktu tertentu waktu retensi.
Senyawasenyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor.
Pelarut menyerapnya Tetapi berbeda. tetapi kita juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan. Jika kita menggunakan campuran metanolair sebagai pelarut. tentunya. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar sangat sederhana. senyawasenyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagianbagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya. Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor. kita dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh. Jika kita menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen. dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Kita juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Sepanjang kita mengontrol kondisi kolom. Kita akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. kita atau orang lain sudah mengukur
senyawasenyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama. . X. dimana masingmasing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. kita sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut. kita tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut. Interpretasi output dari detektor Output akan direkam sebagai rangkaian puncakpuncak. menyerap pada panjang gelombang dibawah nm dan air pada gelombang dibawah nm.Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. metanol. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu.
nhanang HPLC High Performance Liquid Chromatography LANSIDA comments HPLC High Performance Liquid Chromatography atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT dikembangkan pada akhir tahun an dan awal tahun an. area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Jika kita mempunyai dua
substansi yang berbeda dalam sebuah campuran X dan Y. harus berhatihati. Meskipun demikian. Saat ini. area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya. Rangkaian HPLC pada spektrometer massa Ini
menunjukkan hal yang sangat menakjubkan Pada saat detektor menunjukkan puncak. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Dalam gambar. HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X. ini akan hanya memberikan puncak yang kecil. tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. dapatkah kita mengatakan jumlah relatifnya Kita tidak dapat mengatakannya jika kita menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak. Misalnya. beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer
massa.Jika larutan X kurang pekat. SISTEM PERALATAN HPLC . tetapi jika diserap lemah. Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk
mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil. baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.
kolom. detektor. dan sifat komponenkomponen sampel. fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarutpelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarutpelarut jenis alkohol. Selain itu.Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas wadah fase gerak. Untuk pemisahan dengan fase normal. Sementara untuk fase terbalik fase diam kurang polar daripada fase gerak. pompa. Pompa .
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. polaritas fase diam. Untuk fase normal fase diam lebih polar daripada fase gerak. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikelpartikel kecil ini. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini . kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. . Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik komposisi fase gerak tetap selama elusi atau dengan cara bergradien komposisi fase gerak berubahubah selama elusi yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Wadah Fase gerak dan Fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara sampai liter pelarut. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut. alat untuk memasukkan sampel tempat injeksi. wadah penampung buangan fase gerak. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
atau polimerpolimer stiren dan divinil benzen. karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagenreagen seperti klorosilan. Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi. baja tahan karat. Reagenreagen ini akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugusgugus fungsional yang lain. kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan mL/menit. Kolom mikrobor mempunyai keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional. yakni Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat l/menit. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. reprodusibel. silika yang tidak dimodifikasi. dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. . dan bebas dari gangguan. Ada jenis pompa dalam HPLC yaitu pompa dengan tekanan konstan. Teflon. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir mL/menit. . Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol SiOH. Kolom dan Fase diam Posisi pada saat menyuntik sampel Ada jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. konstan. Posisi pada saat memuat sampel . Untuk tujuan preparatif. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat. Tempat penyuntikan sampel Sampelsampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel sample loop internal atau eksternal. dan batu nilam. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. Meskipun demikian. dalam prakteknya. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas.
dan elektrokimia. Indeks bias x Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi golongan yaitu detektor
universal yang mampu mendeteksi zat secara umum. Sangat sensitif terhadap suhu. tidak bersifat spesifik. selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda. dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif. . Stabil dalam pengopersiannya. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Fluoresensi Sensitifitas sangat bagus. yakni mampu
mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. selektif. tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Berdasarkan pada kedua pemisahan ini. paling sering Spektrofotometer x digunakan. sedang. . Sensitifitas sangat bagus. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel. JENIS HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya atau fase terbalik jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya.Oktadesil silika ODS atau C merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawasenyawa dengan kepolaran yang rendah. dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien Elektrokimia Konduktimetri Peka terhadap perubahan suhu Amperometri dan kecepatan alir fase gerak. . sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC . Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik g/ml linier Absorbansi Uvvis Fotometer filter x Sensitivitas bagus. . Mempunyai sensitifitas yang tinggi. dan tidak bersifat selektif seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa. maupun tinggi. . Hanya mendeteksi solutsolut ionik. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan
mempunyai karakteristik sebagai berikut . Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. Silikasilika aminopropil dan sianopropil nitril lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. . selektif terhadap
spektrometerphotogt x gugusgugus dan strukturstruktur diode array yang tidak jenuh. Idealnya. detektor fluoresensi. seperti detektor UVVis.
dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. Dengan demikian. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. atau berdifusi lewat fase diam. akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. dengan jenisjenis HPLC sebagai berikut . peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. atau dengan fenil. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau
menganalisis senyawa dengan berat molekul gt dalton. oktasilana. karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbonhidrokarbon nonpolar seperti dengan oktadesilsilana. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan ODS atau C dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah.fase terbalik. kemudian molekulmolekul yang ukuran medium. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. akan terelusi terlebih dahulu. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda. . Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya airalkohol dan juga pelarut organik. HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut. . . . meskipun demikian sekitar kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina. . Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk
pemisahan sampelsampel ionik dan mengatasi masalahmasalah yang melekat pada metode penukaran ion. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus lewat diantara partikel. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air. meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah
Nbromometilasam fosfat diisopropilisourea DNBDI.nitrobenzooksa.dinitrobenziloksiamin hidroklorida DNBA. Fase diam mengandung gugusgugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisikondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi..
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein enzim dari campuran yang sangat kompleks. . .asetoksikumarin. fluoroSNPA. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk .Nkloronitrobenzooksao sekunder suksinimidilpnitrofenilasetat . Dansil klorida dimetilaminiazobenzensulfinil DabsylCl. produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi. bromofenasil bromida PBPB Alkohol . Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UVVis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi Reagen untuk dapat dengan UVVis dideteksi dengan Fluoresen Asamasam pnitrobenzilN.Nbromometilkaboksilat. Di samping itu.dinitrobenzil klorida DNBC. . asam lemak. pmetoksikumarin. naftilisosianat NIC. Asamasam amino dimetilaminiazobenzensulfinil Fluoresamin . diazol NBDF. keton
pnitrobenziloksiamin hidroklorida Dansil hidrazin PNBA. . Aldehid. Amin primer Fluoresamin oftalaldehid OPA o Amin primer dan . . Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai
syaratsyarat sebagai berikut. DERIVATISASI PADA HPLC Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisikakimia suatu analit.dinitrobenzil klorida DNBC.asamdinitrobenzilN.dinitrofenilasetat SDNPA. proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin . pemisahan terjadi karena interaksiinteraksi biokimiawi yang sangat spesifik. yakni produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri. asamdiisopropilisourea PNBDI. dimetilaminiazobenzensulfinil DabsylCl. serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi. juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor senyawa yang mamapu berfluoresensi sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini.Nsuksinimidil.diazol NBDCl. naftilisosianat NIC. Meningkatkan deteksi Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik Menstabilkan analit yang sensitif.
fluoronitrobenzooksa.peptida DabsilCl oftalaldehid OPA kloronitrobenzooksa. .diazol NBDF.diazol NBDCl. Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom precolumn derivatization atau setelah analit keluar dari kolom postcolumn derivatization.
