Percobaan VI
Uji aktivitas suksinat dehidrogenase Nama : Firdaus
Nim : 90511007 Kelompok : II (dua)
I. Tujuan Percobaan
Menguji aktivitas enzim dehidrogenasi suksinatif dengan inhibitor dan tanpa inhibitor serta dengan pemanasan maupun tanpa pemanasan
II. Dasar Teori
Enzim dehidrogenase mengkatalisis reaksi transfer hydrogen (atau elektron) dari suatu substrat kepada senyawa akseptor seperti halnya NAD, NADP atau flavoprotein. Suksinat dehidrogenase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi oksidasi reversibel asam suksinat menjadi asam fumarat. Dan satu-satunya enzim dalam daur TCA yang mengkatalisis transfer elektron secara langsung ke flavoprotein.
Senyawa metilen biru dan trifeniltetrazolium klorida dapat bertindak sebagai akseptor buatan dengan kehadiran flavoprotein. Kedua senyawa ini akan menunjukkan perubahan warna ketika mengalami reduksi. Dalam bentuk teroksidasi metilen biru berwarna biru dan dalam bentuk tereduksi tidak berwarna. Bentuk tereduksi metilen biru secara cepat dapat teroksidasi kembali dengan kehadiran oksigen udara. Karenanya dalam pengerjaan penentuan aktivitas suksinat dehidrogenase harus dilaksanakan pada kondisi vakum (ketiadaan udara). Kemudian enzim dehidrogenasi suksinatif bekerja optimal pada suhu 37oC sehingga inkubasi dilakukan pada suhu 37oC. Apabila dipanaskan lebih dari pH optimumnya maka enzim ini akan terdenaturasi sehingga strukturnya rusak dan tidak dapat menjalankan fungsinya sebagai katalis.
III. Prosedur dan pengamatan
Prosedur Pengamatan
Dengan menggunakan natrium suksinat (tanpa penambahan malonat)
1. Tabung A
- 0,5 ml metilen biru + 0,5ml Air + 5ml buffer + 0,5ml homogenat + 5 tetes paraffin oil + inkubator 37oC selama 1 jam
2. Tabung B
- 0,5 ml metilen biru + 0,5ml Na suksinat + 5ml buffer + 0,5ml homogenat + 5 tetes paraffin oil + inkubator 37oC selama 1 jam
3. Tabung C
- 0,5 ml metilen biru + 0,5ml Na suksinat + 5ml buffer + 0,5ml homogenate yang dipanaskan + 5 tetes parafin oil + inkubator 37oC selama 1 jam
Warna larutan tetap biru
Sebagian larutan berubah menjadi putih
Nampak sedikit larutan berubah jadi putih
Dengan menggunakan penambahan Na-malonat
1. Tabung A malonat
- 0,5 ml metilen biru + 0,5ml Air + 5ml buffer + 0,5ml homogenat + 5 tetes paraffin oil + Na-malonat + inkubator 37oC selama 1 jam
2. Tabung B malonat
- 0,5 ml metilen biru + 0,5ml Na suksinat + 5ml buffer + 0,5ml homogenat + 5 tetes paraffin oil + Na-malonat + inkubator 37oC selama 1 jam
3. Tabung C malonat
- 0,5 ml metilen biru + 0,5ml Na suksinat + 5ml buffer + 0,5ml homogenate yang dipanaskan + 5 tetes parafin oil + Na-malonat + inkubator 37oC selama 1 jam
Warna larutan tetap biru Nampak ada endapan
Sebagian larutan berubah menjadi putih
Nampak sangat sedikit larutan berubah jadi putih
IV. Pembahasan
Menguji aktivitas enzim suksinat dehidrogenase ada inhibitor ( pakai malonat) dengan tanpa inhibitor (tanpa Malonat) serta dengan ada enzim dan tanpa enzim. Ion Malonat dapat berfungsi sebagai Inhibitor kompetitif karena Malonat memiliki struktur yang mirip dengan suksinat karena sama-sama memiliki dua gugus karboksil yang mengion pada pH 7,0 sehingga malonat dapat bersaing dengan suksinat untuk masuk kedalam sisi aktif enzim.
Hati sapi digunakan sebagai sumber enzim utamanya yang dibutuhkan adalah enzim suksinat dehidrogenase yang dapat bereaksi katalis dalam reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat dengan cara melepas dua hidrogen dari suksinat. Mekanisme reaksinya sebagai berikut :
Sebagai indikator untuk mengetahui reaksi dehidrogenasi suksinat maka digunakan metilen biru karena metilen biru ini dapat menunjukkan perubahan warna dalam bentuk tereduksi berubah menjadi bening sedangkan dalam bentuk teroksidasi tetap biru. Terjadinya perubahan warna pada metilen biru menjadi bening menunjukkan bahwa enzim bekerja mengoksidasi suksinat menjadi fumarat. Sedangkan apabila metilen biru tidak menunjukan perubahan warna (tetap biru) berarti enzim tidak bekerja mengoksidasi suksinat menjadi fumarat. Semakin banyak warna putih pada tabung, maka semakin banyak fumaratnya artinya semakin banyak suksinat yang teroksidasi menjadi fumarat. Fungsi penambahan sukrosa dalam hati sapi adalah untuk mengekstrak enzim dari hati sapi.
Tujuan vakum dari masing-masing tabung adalah untuk menghilangkan pengaruh oksigen yang ada dalam tabung Thunberg kemudian sebelum alat vakum dimatikan maka
terlebih dahulu tabung Thunberg diputar untuk menutup agar tidak ada jalan oksigen dari luar masuk kedalam tabung. Perlakuan ini dilakukan karena oksigen akan dapat
mempengaruhi reaksi redoks yang terjadi dimana ditandai pada indikator metilen biru akan teroksidasi kembali dengan kehadiran oksigen baik yang berasal dari dalam vakum maupun diudara. Sedangkan Perlakuan yang sama inkubasi selama 1 jam adalah agar dapat dibandingkan hasil aktivitas dari enzim suksinat dehidrogenasi.
Pada tabung A tanpa malonat dan tanpa suksinatif tidak terjadi perubahan (ditandai dengan warna larutan tetap biru) karena enzim dehidrogenasi suksinatif tidak bekerja begitu pula dengan tabung A malonat (dengan penambahan malonat) larutan tetap biru karena tidak adanya suksinatif yang akan dikatalisis oleh enzim sehingga malonat tidak berfungsi sebagai inhibitor namun kelihatan ada endapan karena pengaruh reaksi dengan malonat dengan bahan yang ada dalam larutan namun tidak terlihatnya perubahan warna (tetap biru) karena malonat tidak terdehidrogenasi oleh enzim dehidrogenasi suksinatif.
Pada tabung B larutan biru yang berubah jadi putih lebih banyak, menandakan oksidasi suksinat menjadi fumarat lebih banyak dari tabung B malonat (dengan penambahan malonat) karena pada tabung B malonat ada ion malonat yang bertindak sebagai inhibitor kompetitif yang bersaing dengan substrat untuk masuk kesisi aktif enzim apabila inhibitor masuk kepusat aktif enzim maka enzim tidak dapat bekerja dengan substrat untuk menghasilkan produk fumarat. ion malonat ini dapat bersaing dengan substrat untuk masuk kesisi aktif enzim dehidrogenasi suksinatif karena sisi katalitik enzim dehidrogenasi dilengkapi dengan dua gugus bermuatan positif yang berjarak tertentu dari masing-masing yang dapat menarik dua gugus karboksilat
bermuatan negatif dari ion malonat selain dua gugus karboksilat dari suksinat sehingga terjadi kompetisi untuk menempati dua gugus positif pada sisi akti enzim tersebut dan apabila gugus karboksilat dari ion malonat yang ditarik, maka terbentuk kompleks [EI] sehingga produk dari substrat suksinat tidak dapat dihasilkan.
Berikut adalah gambar hasil praktikum dari tabung B (tanpa malonat dan dengan malonat) dan tabung C (tanpa malonat dan dengan malonat).
Tabung B (tanpa malonat) Tabung B ( dengan malonat) Tabung C ( dilakukan pemanasan homogenate) Tabung C ( dilakukan pemanasan homogenate
dan ditambah malonat)
Berdasarkan gambar foto hasil pengamatan datas bila tabung B tanpa malonat maupun dengan malonat dibandingkan dengan tabung C tanpa malonat maupun dengan malonat maka tabung B (tanpa malonat) memperlihatkan lebih banyak yang berubah jadi putih karena enzim suksinat dehidrogenasenya masih dapat bekerja dengan baik dalam mengkatalisis oksidasi suksinat menjadi fumarat sedangkan pada tabung C (tanpa
malonat maupun dengan malonat) enzim suksinat dehidrogenasenya terdenaturasi karena dipanaskan sehingga struktur tersiernya rusak dan enzim ini tidak dapat menjalankan fungsinya untuk mengkatalisis dengan demikian reaksi lebih lambat hal ini teramati pada tabung setelah diinkubasi dalam waktu yang sama ( 1 jam) larutan yang berubah warna menjadi putih sangat sedikit yang menandakan suksinat yang teroksidasi menjadi fumarat sangat sedikit.
V. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan terhadap percobaan yang dilakukan maka dapat ditarik simpulan sebagai berikut :
- enzim suksinat dehidrogenase suksinatif akan bekerja lebih optimal sebagai katalis dalam mengoksidasi suksinat menjadi fumarat apabila tanpa inhibitor (tanpa malonat) dan tanpa pemanasan karena pemanasan diatas temperature optimumnya (diatas 37oC) akan merusak struktur tersier enzim suksinat dehidrogenase.
- Enzim dehidrogenase suksinatif merupakan enzim yang spesifik mengkatalisis oksidasi suksinatif menjadi fumarat terbukti pada tabung A tanpa suksinatif larutan tetap berwarna biru sedangkan tabung lain (B dan C) yang berisi suksinatif terjadi perubahan warna dari biru menjadi putih.
Daftar Pustaka
Fional Frais. 1972. Practical Biochemistry an introductory course, st. ed. Butter worths Co. London.
Fessenden. 1992. Kimia Organik edisi ketiga. Jakarta : penerbit erlangga.
Styrer. 2007. Biochemistry, 6th ed. WH. Freeman & Company.
Wilbraham, Matta. 1992. Pengantar Kimia Organik dan Hayati. Bandung : Penerbit ITB.
Pertanyaan
1. Apa yang dikandung dalam hati selain enzim ?
2. pH dan temperature optimum dari enzim dehidrogenasi suksinat berapa ya ? 3. gambar struktur malonat ?
4. fungsi parafin oil ?
5. bagaimana sukrosa bekerja dalam mengekstrak enzim dari hati sapi ?
Pada tabung C (tanpa malonat) larutan biru yang berubah jadi putih lebih banyak menandakan oksidasi suksinat menjadi fumarat lebih banyak dari tabung C malonat (dengan penambahan malonat) karena pada tabung C malonat ada ion malonat yang bertindak sebagai inhibitor kompetitif yang bersaing dengan substrat untuk masuk kesisi aktif enzim apabila inhibitor masuk kepusat aktif enzim maka enzim tidak dapat bekerja dengan substrat untuk menghasilkan produk fumarat.
Kekurangan :
