SOFHIANI DEWI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

159 

Loading....

Loading....

Loading....

Loading....

Loading....

Teks penuh

(1)

IDENTIFIKASI PEPTIDA GURIH DAN SENYAWA BERNITROGEN

SERTA KARAKTERISASI SENSORI SENYAWA

BERNITROGEN YANG BERKONTRIBUSI TERHADAP RASA

GURIH EKSTRAK IKAN ASIN JAMBAL ROTI

SOFHIANI DEWI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2005

(2)

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Identifikasi Peptida Gurih dan Senyawa Bernitrogen serta Karakterisasi Sensori Senyawa Bernitrogen yang Berkontribusi terhadap Rasa Gurih Ekstrak Ikan Asin Jambal Roti adalah karya saya sendiri dibawah bimbingan Dr. Ir. Anton Apriyantono, M.S dan Dr. Ir. Feri Kusnandar M.Sc. Tesis ini belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, November 2005 Sofhiani Dewi NRP F251020161

(3)

ABSTRAK

SOFHIANI DEWI. Identifikasi Peptida Gurih dan Senyawa Bernitrogen serta Karakterisasi Sensori Senyawa Bernitrogen yang Berkontribusi terhadap Rasa Gurih Ekstrak Ikan Asin Jambal Roti. Dibimbing oleh ANTON APRIYANTONO dan FERI KUSNANDAR.

Ekstrak air ikan asin jambal roti yang mengandung peptida berberat molekul rendah (dibawah 1000 Da) hasil ultrafiltrasi dengan MWCO 1000 Da, telah difraksinasi dengan Sephadex G-10 dan menghasilkan 5 fraksi ekstrak ikan asin jambal roti yang mempunyai rasa gurih, khususnya fraksi 1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jenis peptida serta peranan senyawa-senyawa bernitrogen yang terdapat pada masing-masing fraksi terhadap pembentukan rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti.

Identifikasi peptida dilakukan menggunakan LC-MS/MS terhadap Fraksi 1, 3, 4 dan 5. Fraksi 2 tidak dianalisa karena merupakan fraksi garam. Sebelum identifikasi dengan LC-MS/MS, Fraksi 1 difraksinasi menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) dengan fase diam C-18 sehingga menghasilkan 9 fraksi (Fraksi Tidak Tertahan (FTT), F-A, F-B, F-C, F-D, F-E, F-G, dan F-H) yang berbeda tingkat kepolarannya. Fraksi 2, 3, 4 dan 5 langsung dianalisa. Identifikasi senyawa bernitrogen dilakukan menggunakan Capillary Electrophoresis (CE) terhadap kelima fraksi. Pada senyawa yang teridentifikasi dilakukan karakterisasi sensori oleh 10-11 orang panelis terlatih menggunakan uji skoring rasa gurih dan asin dengan skala 0-150. Pengujian dilakukan menggunakan omission test terhadap 3 model dasar yaitu (1) larutan MSG 4 mM, (2) larutan NaCl 80 mM dan (3) campuran MSG 4 mM dan NaCl 80 mM.

Identifikasi LC-MS/MS menunjukkan bahwa pada Fraksi 1 terdapat peptida yang mengandung L-Glutamat (Glu) dan L-Aspartat (Asp) yaitu peptida yang terdapat pada FTT (BM 375.1 Da) dan F-A (BM 444.1 Da). Peptida lainnya adalah peptida yang hanya mengandung Glu yaitu pada Fraksi 1 [ F-B (BM 465.1), F-E (BM 364.0) dan F-G (BM 365.0)], Fraksi 3 (BM 473.6 dan 378.5) dan Fraksi 5 (BM 377.9). Peptida-peptida ini diduga berkontribusi terhadap pembentukan rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti.

Berdasarkan hasil CE, Fraksi 1 mengandung L-Histidin (His) dan dipeptida anserin/karnosin. Pada Fraksi 2 terdapat kreatinin dan L-Fenilalanin (Phe), sedangkan pada Fraksi 4 terdapat L-Tirosin (Tyr), Phe dan kreatinin. Adapun Fraksi 5 mengandung Phe dan L-Triptofan (Trp). Hasil uji sensori menunjukkan bahwa campuran kreatinin, Phe dan Tyr pada konsentrasi di bawah nilai threshold-nya (1.5 mM) berpengaruh terhadap peningkatan rasa gurih campuran MSG dan NaCl. Kreatinin berperan terhadap peningkatan rasa gurih campuran MSG, Tyr dan Phe. Sedangkan Phe berpengaruh terhadap peningkatan rasa gurih campuran NaCl, Tyr, kreatinin dan campuran MSG, NaCl, Tyr, kreatinin. Campuran Phe (1 mM) dan Trp (1 mM) tidak berpengaruh terhadap rasa gurih dan asin larutan MSG, NaCl dan campurannya.

Dapat disimpulkan bahwa rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti dipengaruhi oleh senyawa bernitrogen seperti kreatinin, Phe dan Tyr pada konsentrasi di bawah nilai thresholdnya. Adanya peptida yang mengandung glutamat dan asparat pada Fraksi 1, diduga turut berperan terhadap pembentukan rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti.

(4)

IDENTIFIKASI PEPTIDA GURIH DAN SENYAWA BERNITROGEN

SERTA KARAKTERISASI SENSORI SENYAWA BERNITROGEN

YANG BERKONTRIBUSI TERHADAP RASA GURIH

EKSTRAK IKAN ASIN JAMBAL ROTI

SOFHIANI DEWI

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2005

(5)

Judul Tesis : Identifikasi Peptida Gurih dan Senyawa Bernitrogen serta Karakterisasi Sensori Senyawa Bernitrogen yang Berkontribusi terhadap Rasa Gurih Ekstrak Ikan Asin Jambal Roti

Nama : Sofhiani Dewi

NRP : F251020161

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Anton Apriyantono, M.S. Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, M.S. Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc Tanggal Ujian: 14 November 2005 Tanggal Lulus:

(6)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2004 ini adalah identifikasi peptida gurih, dengan judul Identifikasi Dan Karakterisasi Peptida Gurih Dari Ekstrak Ikan Asin Jambal Roti.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Anton Apriyantono, M.S. dan Bapak Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc. selaku pembimbing, serta Ibu Prof. Dr. Ir. Winiati Puji Rahayu, M.S. selaku dosen penguji yang telah banyak memberi saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Diana Hermawati, M.S. beserta staf dari Balai Pengujian Mutu Produk Peternakan atas bantuannya mengijinkan penulis menggunakan alat untuk identifikasi peptida. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami, anak-anak (Dzaky dan Nissa), mama, bapak serta seluruh keluarga tercinta, atas dukungan, doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, November 2005 Sofhiani Dewi

(7)

RIWAYAT HDUP

Penulis dilahirkan di Cimahi pada tanggal 20 Pebruari 1976 dari ayah K. Surya Permana dan ibu Titi Sumiati. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara.

Tahun 1994 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Cimahi dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN). Penulis memilih Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian dan lulus pada tahun 1999. Setelah itu, penulis bekerja sebagai Penanggung Jawab Praktikum pada Program Studi Supervisor Jaminan Mutu Pangan (D3), Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pangan IPB hingga tahun 2000. Pada 2002, penulis melanjutkan studi di Sekolah Pascasarjana pada Program Studi Ilmu Pangan dengan biaya sendiri.

Penulis telah menikah dengan seorang pria bernama Herdianto pada tahun 1999 dan dikaruniai 2 orang putra yaitu Muhammad Sajid Dzaky (5 tahun) dan Syarifah Syahmina Khairunnisa (2,5 tahun).

(8)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... v

DAFTAR GAMBAR ... vii

DAFTAR LAMPIRAN ... xii

PENDAHULUAN... 1

TINJAUAN PUSTAKA ... 4

Peptida Pemberi Rasa Gurih ... 4

Sumber Peptida Pemberi Rasa Gurih ... 6

Teknik Isolasi Peptida ... 8

Identifikasi Peptida ... 11

BAHAN DAN METODE ... 17

Bahan dan Alat ... 17

Metode ... 17

PEMBAHASAN ... 23

Identifikasi Peptida... 23

Karakterisasi Sensori (Omission Test) ... 63

SIMPULAN DAN SARAN ... 73

Simpulan ... 73

Saran ... 74

DAFTAR PUSTAKA ... 75

(9)

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Peptida-peptida yang mempunyai rasa gurih pada pH 6 ... 5 2 Sistem pengacakan sampel pada uji segitiga rasa asam-pahit dan

asin-gurih ... 21 3 Jenis dan konsentrasi larutan sampel untuk uji rangking pada

pelatihan panelis ... 21 4 Senyawa-senyawa yang teridentifikasi dari ekstrak ikan asin jambal

roti dengan menggunakan CE ... 24 5 Ion-ion yang terbentuk sebagai dasar penentuan dugaan kandungan

asam amino peptida yang diduga mempunyai rasa gurih ... 31 6 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada FTT Fraksi 1 ulangan 1 dan 2... 36 7 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi A Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1

dan 2 ... 39 8 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi B Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1

dan 2... 42 9 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi C Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1

dan 2... 45 10 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi D Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1

dan 2... 47 11 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi E Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1

dan 2... 49 12 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi F Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1

(10)

13 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi G Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1

dan 2... 53 14 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi H Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1

dan 2... 55 15 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi 3 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan 2... 58 16 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi 4 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan 2... 60 17 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang

ada pada Fraksi 5 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan 2... 62

(11)

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1 Skema isolasi peptida pemberi rasa gurih ... 10 2 Skema komponen-komponen utama pada sistem Capillary

Electrophoresis ... 11 3 Skema proses ionisasi elektrospray ... 14 4 Pola fragmentasi peptida (Harrison et al. 2000) ... 15 5 Cara isolasi peptida dari fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti

menggunakan teknik Solid Phase Extraction (SPE) ... 19 6 Electropherogram senyawa standar secara berurutan : kreatinin,

karnosin, anserin, arginin, histidin, SI, kreatinin, kreatin, triptofan,

metionin, fenilalanin, tirosine dan hipoksantin ... 23 7 Electropherogram fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang

telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak : a) Spektrum UV peak pada waktu retensi 7.849 menit, b) 8.644 menit,c) 21.875 menit ... 25 8 Electropherogram fraksi 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang

telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak: a) spektrum UV pada waktu retensi 7.026 menit, b) 8.171 menit, c) 22.161 menit ... 27 9 Electropherogram fraksi 3 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang

telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak : a) spektrum UV pada peak dengan waktu retensi 7.028 menit, b) 8.669 menit, c) 20.234 menit, d) 22.034

menit dan d) 22.857 menit... 28 10 Electropherogram fraksi 4 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang

telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak, a: spektrum UV peak dengan waktu retensi 18.942 menit, b) 19.565 menit dan c) 20.560

menit... 29 11 Electropherogram fraksi 5 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang

telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak, a) spektrum UV peak dengan waktu retensi 19.104 menit dan b) 20.699 menit... 30

(12)

12 Kromatogram FTT hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1ikan asin jambal roti goreng (14 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 35 13 Kromatogram FTT hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal

roti goreng (16.3 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 35 14 Kromatogram Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin

jambal roti goreng (23.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit ... 38 15 Kromatogram Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin

jambal roti goreng (7.8 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 38 16 Kromatogram Fraksi B hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin

jambal roti goreng (16.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 41 17 Kromatogram Fraksi B hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin

jambal roti goreng (8 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 41 18 Kromatogram F-C hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal

roti goreng (0 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit...

44 19 Kromatogram Fraksi C hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin

jambal roti goreng (1.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 44

(13)

20 Kromatogram Fraksi D hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (2.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 46 21 Kromatogram Fraksi D hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin

jambal roti goreng (8 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 46 22 Kromatogram Fraksi E hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin

jambal roti goreng (7.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 48 23 Kromatogram Fraksi E hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin

jambal roti goreng menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1ml/menit... 48 24 Kromatogram Fraksi F hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin

jambal roti goreng (7 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit

... 50

25 Kromatogram Fraksi F hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (3 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 50 26 Kromatogram Fraksi G hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin

jambal roti goreng (1 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit 52 27 Kromatogram Fraksi G hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin

jambal roti goreng (6 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit 52

(14)

28 Kromatogram Fraksi H hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 54 29 Kromatogram Fraksi H hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin

jambal roti goreng menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 54 30 Kromatogram Fraksi 3 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (2 mg/ml)

menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 57 31 Kromatogram Fraksi 3 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (6.2

mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 57 32 Kromatogram Fraksi 4 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng

menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 59 33 Kromatogram Fraksi 4 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng

menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 59 34 Kromatogram Fraksi 5 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (4.1

mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1ml/menit ... 61 35 Kromatogram Fraksi 5 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (5 mg/ml)

menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 61 36 Pengaruh penambahan histidin (His) 1 mM terhadap skor rasa gurih dan

asin dari MSG, NaCl dan campuran MSG dan NaCl, oleh 10 panelis terlatih. Skor: 0-150 ... 64

(15)

37 Pengaruh penambahan kreatinin (crn) 1.5 mM dan fenilalanin (phe) 1.5 mM terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG (4 mM), NaCl (80 mM) dan campuran keduanya, oleh 10 panelis terlatih dengan skor 0 -150... 65 38 Pengaruh penghilangan L-Phe pada campuran kreatinin (crn) 1.5 mM

dan L-Phe 1.5 mM terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG (4 mM), NaCl (80 mM) dan campuran keduanya, oleh 10 panelis terlatih. Skor:

0-150………... 66

39 Pengaruh penambahan kreatinin (crn) terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG, NaCl dan campuran MSG dan NaCl, oleh 10 panelis terlatih. Skor: 0-150 ... 66 40 Pengaruh penambahan kreatinin (crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM

dan tirosin (tyr) 1.5 mM terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG, NaCl dan campuran MSG dan NaCl, oleh 10 panelis terlatih. Skor: 0-15 67 41 Pengaruh penghilangan tirosin (tyr) terhadap skor rasa gurih dan asin

dari campuran MSG, NaCl, kreatinin (crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM, oleh 10 panelis terlatih. Skor: 0-150 …… 68 42 Pengaruh penghilangan fenilalanin terhadap skor rasa gurih dan asin dari

campuran MSG, NaCl, kreatinin (crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM, oleh 10 panelis terlatih. Skor 0-150 ………….. 69 43

Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) dan tirosin (tyr) terhadap skor rasa gurih dan asin dari campuran MSG, NaCl, kreatinin (crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM, oleh 10 panelis terlatih. Skor:

0-150 ………. 69

44

Pengaruh penghilangan kreatinin (crn) terhadap skor rasa gurih dan asin dari campuran MSG, NaCl, kreatinin (crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM, oleh 10 panelis terlatih. Skor: 0-150 ……. 70 45 Pengaruh penambahan fenilalanin (phe) dan triptofan (trp) terhadap

skor rasa gurih dan asin dari MSG, NaCl, dan campuran MSG dan NaCl, oleh 10 panelis terlatih. Skor: 0-150………... 71 46 Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) 1 mM terhadap skor rasa gurih

dan asin dari MSG 4 mM, NaCl 80 mM, dan triptofan (trp) 1 mM, oleh 10 panelis terlatih. Skor: 0-150... 72 47 Pengaruh penambahan triptofan (trp) 1 mM terhadap skor rasa gurih dan

asin dari MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran MSG,NaCl, oleh 11 panelis terlatih. Skor: 0-150………... 72

(16)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Format isian uji rasa dasar... 80

2 Format isian uji segitiga rasa asam-pahit ... 81

3 Format isian uji segitiga rasa asin-gurih... 82

4 Format isian uji rangking rasa asin/gurih ... 83

5 Format isian uji skoring/pengujian sampel untuk rasa gurih dan asin 84 6 Hasil seleksi panelis untuk uji rasa dasar... 85

7 Hasil seleksi panelis untuk uji segitiga rasa... 87

8 Hasil pelatihan panelis yang telh lolos seleksi dengan menggunakan uji peringkat rasa asin dan rasa gurih... 88

9 Hasil uji skoring rasa gurih pada pelatihan panelis dengan menggunakan sampel ekstrak kecap ikan berberat molekul kurang dari 1000 Da... 89

10 Hasil uji skoring rasa asin pada pelatihan panelis dengan menggunakan sampel ekstrak kecap ikan berberat molekul kurang dari 1000 Da... 90

11 Spektrum UV senyawa-senyawa standar untuk identifikasi dengan Capillary Electrophoresis ……….. 91

12 Contoh spektrum massa peptida berberat molekul 430.0 Da (waktu retensi 16.1 menit) yang terdapat pada FTT Fraksi 1 ulangan 1, (a) spektrum massa pada MS1 dan (b) fragmentasi lebih lanjut (MS2) dari ion dengan m/z 149.9... 93

13 Contoh spektrum massa peptida berberat molekul 375.1 Da (waktu retensi 26.7 menit) yang terdapat pada FTT Fraksi 1 ulangan 2 (a) spektrum massa pada MS1 dan (b) fragmentasi lebih lanjut (MS2) dari ion dengan m/z 376.2... 93

14 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi Tidak Tertahan (FTT) hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) ... 94

(17)

15 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi Tidak Tertahan (FTT) hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 95 16 Spektrum massa (pola fragmentasi pada MS1) peptida berberat

molekul 375.1 yang terdapat pada Fraksi Tidak Tertahan (FTT) hasil fraksinasi Fraksi 1, (a) peptida dengan waktu retensi 27.7 (ulangan 1) dan 26.7 menit(ulangan 2), (b) peptida dengan waktu retensi 44.7 (ulangan 1) dan 45.3 menit (ulangan 2)... 96 17 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 97 18 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 99 19 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi B hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction).. 100 20 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi B hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction).. 102 21 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi C hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction).. 103 22 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi D hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 103 23 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi D hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 104 24 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi E hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 104

(18)

25 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi E hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 105 26 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi F hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 106 27 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi G hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 107 28 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi G hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 107 29 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi H hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 108 30 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi H hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 108 31 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi 3 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti... 109 32 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi 4 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti... 110 33 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi 4 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti... 110 34 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi 5 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti... 111 35 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida

pada Fraksi 5 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti... 112 36 Pengaruh penambahan Histidin (His) 1.5 mM terhadap skor rasa gurih

dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran MSG, NaCl... 113

(19)

37 Uji sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penambahan histidin 1 mM terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran keduanya... 114 38 Pengaruh penambahan kreatinin (Crn) 1.5 mM dan fenilalanin (phe)

1.5 mM terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran MSG, NaCl... 115 39 Uji sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh

penambahan kreatinin (crn) 1.5 mM dan fenilalanin (phe) 1.5 mM terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran keduanya... 116 40 Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) pada campuran kreatinin

(Crn) 1.5 mM dan fenilalanin (phe) 1.5 mM terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran MSG, NaCl... 117 41 Uji sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh

penghilangan fenilalanin (phe) terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM, kreatinin (crn) 1.5 mM dan fenilalanin (phe) 1.5 mM... 118 42 Pengaruh penambahan creatinin (Crn) 1.5 mM terhadap skor rasa

gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran MSG, NaCl... 119 43 Uji sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh

penambahan creatinin 1.5 mM terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran keduanya... 120 44 Pengaruh penambahan Kreatinin (Crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5

mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran MSG,

NaCl... 121 45 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh

penambahan kreatinin (crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campurannya... 122 46 Pengaruh penghilangan tirosin (tyr) terhadap skor rasa gurih dan asin

campuran MSG 4 mM, NaCl 80 mM, kreatinin (Crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM... 123

(20)

47 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penghilangan tirosin (tyr) 1.5 mM terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM fenilalanin (phe) 1.5 mM dan creatinin 1.5 mM... 124 48 Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) terhadap skor rasa gurih dan

asin campuran MSG (4 mM), NaCl (80 mM), kreatinin (Crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM... 125 49 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh

penghilangan fenilalanin (phe) 1.5 mM terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM, kreatinin (crn) 1.5 mM, fenialalanin (phe) dan tirosin (tyr) 1.5 mM... 126 50 Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) dan tirosin (tyr) terhadap

skor rasa gurih dan asin campuran MSG (4 mM), NaCl (80 mM), kreatinin (Crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM... 127 51 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh

penghilangan fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan creatinin 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM... 128 52 Pengaruh penghilangan kreatinin (crn) terhadap skor rasa gurih dan

asin campuran MSG (4 mM), NaCl (80 mM), kreatinin (Crn) 1.5 mM, fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM... 129 53 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh

penghilangan kreatinin (crn) 1.5 mM terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80, kreatinin (crn) 1.5 mM, mM fenilalanin (phe) 1.5 mM dan tirosin (tyr) 1.5 mM... 130 54 Pengaruh penambahan fenilalanin (phe) 1 mM dan triptofan (trp) 1

mM terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80

mM dan campuran MSG, NaCl... 131 55 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh

penambahan fenilalanin (phe) 1 mM dan triptofan (trp) 1 mM terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan

campurannya... 132 56 Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) 1 mM terhadap skor rasa

gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan triptofan (trp) 1

mM... 133 Halaman

(21)

57 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) 1 mM terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM, triptofan (trp) 1 mM dan fenilalanin (phe) 1 mM... 134 58 Pengaruh penambahan triptofan (trp) 1 mM terhadap skor rasa gurih

dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campuran MSG, NaCl 135 59 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh

penambahan triptofan (trp) 1 mM terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan campurannya... 137

(22)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Telah diketahui bahwa peptida-peptida yang mempunyai berat molekul kurang dari 1000 Da mempunyai kontribusi terhadap rasa dan flavor bahan pangan, dimana salah satunya adalah memberikan rasa umami (Yamasaki dan Maekawa, 1978). Rasa umami adalah rasa yang ditimbulkan oleh senyawa monosodium glutamate (MSG) dan 5’ nukleotida seperti 5’-inosine monophosphate (IMP) dan 5’-guanosine monohosphate (GMP) (Maga, 1994). Rasa umami ini menjadi penting karena ternyata sejak lama telah dijadikan sebagai dasar dari pemilihan makanan (McBride, 1991). Dalam penelitian ini, rasa umami diasumsikan dengan rasa gurih, karena rasa gurih merupakan rasa yang paling dekat dengan umami dan merupakan rasa yang lebih dikenal oleh masyarakat Indonesia.

Isolasi terhadap peptida-peptida yang berkontribusi terhadap pembentukan flavor bahan pangan, khususnya rasa gurih, masih perlu dilakukan. Hal ini dikarenakan senyawa-senyawa pemberi rasa umami yang telah dikomersialisasi secara luas baru dilakukan pada MSG diikuti oleh IMP dan GMP. Dengan adanya senyawa lain dari golongan peptida yang juga dapat berfungsi sebagai pemberi rasa gurih, diharapkan dapat dijadikan alternatif ingredient pangan selain juga menambah nilai nutritif dari makanan tersebut.

Peptida-peptida yang mempunyai rasa umami pada umumnya terdapat pada bahan pangan yang mempunyai kadar protein tinggi seperti hidrolisat protein ikan (Fujimaki et al., 1973), daging sapi (Yamasaki dan Maekawa, 1978) dan kacang kedelai (Apriyantono et al., 2003 dan Lioe et al., 2003). Sedangkan peptida umami yang pertama kali berhasil diisolasi dan diidentifikasi adalah oktapeptida (Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala) yang dikenal sebagai delicious peptide atau Beefy Meaty Peptide (BMP) yang berasal dari kaldu daging sapi (Yamasaki dan Maekawa, 1978).

Sumber-sumber pangan lainnya yang diduga mempunyai potensi mengandung peptida gurih adalah produk pengolahan hasil perikanan seperti ikan

(23)

asin jambal roti, ikan peda putih dan kecap ikan (Saleha, 2003). Produk-produk ini disukai oleh masyarakat di Indonesia karena rasanya gurih. Hasil fraksinasi menggunakan Sephadex G-10 dari ekstrak air ikan asin jambal roti dan kecap ikan berberat molekul kurang dari 1000 Da menghasilkan fraksi-fraksi yang mempunyai rasa gurih (Priliandari 2004 dan Rahmawaty 2004) berberat molekulRasa gurih pada produk-produk tersebut salah satunya diduga berasal dari peptida yang merupakan hasil hidrolisis protein secara enzimatis pada saat fermentasi.

Tujuan

Tujuan penelitian ini secara umum adalah melakukan isolasi, identifikasi dan karakterisasi peptida gurih dari ekstrak larut air ikan asin jambal roti. Sedangkan secara khusus, penelitian ini bertujuan untuk :

1. Mendapatkan fraksi peptida dari Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti berberat molekul kurang dari 1000 Da yang telah difraksinasi dengan kromatografi gel (Sephadex G-10).

2. Mendapatkan identitas peptida dan asam amino yang terdapat pada fraksi-fraksi ikan asin jambal roti dengan menggunakan Capillary Electrophoresis (CE) dan Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (LC-MS).

3. Mendapatkan karakterisasi sensori asam amino dan peptida yang teridentifikasi terhadap pembentukan rasa gurih dan asin dengan menggunakan teknik ommision test.

Hipotesa

Pada fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Da diduga terdapat peptida yang mempunyai rasa gurih pada ikan asin jambal roti. Peptida-peptida tersebut bersama komponen-komponen lain yang ada dalam fraksi seperti asam amino bebas, garam, gula, asam organik, nukleotida, mineral dan ion-ion klorida dan fosfat, diduga saling berinteraksi dalam memberikan rasa gurih.

(24)

Manfaat Penelitian

Penelitian mengenai peptida yang mempunyai rasa gurih akan sangat bermanfaat terhadap pengembangan bahan tambahan pangan, khususnya bahan penambah rasa gurih. Selain itu, hasil penelitian ini akan memperkaya pengetahuan, khususnya pada bidang flavor, mengenai bagaimana peranan komponen-komponen berberat molekul rendah yang larut air terhadap pembentukan karakteristik rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti.

(25)

TINJAUAN PUSTAKA

Peptida Pemberi Rasa Gurih

Pada umumnya, peptida yang mempunyai rasa gurih mengandung asam amino glutamat (Glu) dan aspartat (Asp) seperti terlihat pada Tabel 1. Adanya residu asam amino asam ini sangat penting untuk menghasilkan rasa dari peptida-peptida yang ada dalam bahan pangan (Tamura et al. 1989). Akan tetapi, bukan berarti rasa gurih dari suatu peptida hanya ditentukan oleh kedua jenis asam amino tersebut. Asam amino yang bersifat hidrofilik seperti serin (Ser), threonin (Thr), glisin (Gly) dan glutamin (Gln) apabila diikat melalui ikatan peptida bersama dengan asam amino glutamat dan aspartat, juga menghasilkan rasa gurih (Noguchi et al 1975).

Rasa gurih dari suatu peptida juga dipengaruhi oleh urutan asam amino penyusunnya dan jenis garam yang ditambahkan untuk mencapai pH 6 (Nakata et al, 1995). Di-peptida Asp-Glu mempunyai rasa gurih dengan nilai threshold 3.32 mM, sedangkan di-peptida Glu-Asp mempunyai rasa asin dengan nilai threshold 1.74 mM. Tamura et al. (1989) menemukan bahwa posisi Asp dan Glu dalam garam sodium peptida asam merupakan faktor yang sangat penting untuk menghasilkan rasa gurih. Contohnya adalah garam sodium dipeptida Asp-Glu.2 Na menghasilkan rasa gurih yang lebih kuat dibandingkan Glu-Asp.2Na. Selain itu, ia juga menduga bahwa suatu peptida yang menghasilkan rasa gurih dan asin memiliki kation dan anion yang berdekatan.

Selain di- dan tripeptida sintetik yang mempunyai rasa gurih, juga terdapat oktapeptida yang berhasil diisolasi dari kaldu daging sapi oleh Yamasaki dan Maekawa (1978) yang mempunyai rasa gurih. Urutan asam amino penyusun oktapeptida ini adalah H-Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala-OH yang sering disebut sebagai delicious peptide atau beefy meaty peptide (BMP). Rasa gurih yang dihasilkan oleh oktapeptida ini disebabkan oleh interaksi antara fragmen basa (Lys-Gly) dan fragmen asam (Asp-Glu-Glu) (Tamura et al. 1989 dan Nakata et al. 1995). Selain berpengaruh terhadap rasa, kedua fragmen ini juga berpengaruh terhadap intensitas rasa yang dihasilkan. Timbulnya rasa gurih ini

(26)

Tabel 1 Peptida-peptida yang mempunyai rasa gurih pada pH 6

Peptida pHa Na+ b Nilai threshold

(mM) Asp-Glu* 3.31 1.75 3.32 Glu-Glu* 3.54 1.90 2.22 Asp-Asp-Glu* 3.18 2.78 2.06 Asp-Glu-Asp* 3.32 2.55 2.68 Asp-Glu-Glu* 3.32 2.68 2.09 Glu-Glu-Asp* 3.47 2.53 3.47 Glu-Glu-Glu* 3.33 2.68 2.09 Asp-Glu-Ser** - - 300c Glu-Ser** - - 200 c Thr-Glu** - - 300 c Glu-Gly-Ser** - - 200 c Ser-Glu-Glu** - - 200 c Glu-Gln-Glu** - - 300 c Asp-Asp*** 3.24 1.74 3.32 Glu-Asp*** 3.33 1.04 1.74 Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala**** - - 1.25

a pH pada saat sebelum ditambahkan NaOH

b jumlah ion sodium (mol) yang ditambahkan hingga mencapai pH 6 (mM)

c satuannya : mg%

* sumber: Nakata et al. (1995) ** sumber: Noguchi et al. (1975) *** sumber: Kuramitsu et al. (1996)

**** sumber: Yamasaki dan Maekawa (1978)

diduga dihasilkan oleh lokalisasi kation pada fragmen basa dan anion pada fragmen asam (Nakata et al. 1995).

Faktor lainnya yang berperan dalam pembentukan rasa gurih suatu peptida adalah pH larutan dan jenis garam yang ditambahkan. Rasa gurih dari BMP mempunyai intensitas tertinggi pada pH 6.5, kemudian menurun pada pH 9.5. Sedangkan pada pH asam (3.5) tidak menghasilkan rasa gurih (Wang et al. 1996). Adapun jenis garam yang dapat menimbulkan suatu peptida mempunyai rasa gurih adalah garam sodium (Nakata et al. 1995). Kuramitsu et al. (1996) menemukan bahwa penambahan garam Na pada larutan dipeptida Asp, Asp-Glu, Glu-Asp dan Glu-Glu hingga pH larutan menjadi 6.0 akan menghasilkan rasa gurih/asin, sedangkan jika pH larutan menjadi 5.0 atau 7.0, rasa gurih/asin akan hilang.

(27)

Sumber Peptida Pemberi Rasa Gurih

Seperti disebutkan di atas, peptida yang mempunyai rasa gurih, pertama kali diisolasi dari kaldu daging sapi oleh Yamasaki dan Maekawa (1978). Berawal dari penemuan ini, banyak dilakukan penelitian mengenai keberadaan peptida gurih pada bahan pangan yang mempunyai rasa gurih seperti hidrolisat protein ikan, keju dan moromi dari kacang kedelai.

Konsentrat Protein Ikan

Pada tahun 1973, Fujimaki et al. melakukan hidrolisis konsentrat protein ikan dengan menggunakan enzim pronase dan kemudian difraksinasi untuk mengetahui hubungan antara distribusi berat molekul dengan sifat organoleptik hidrolisat protein ikan. Senyawa yang bertanggung jawab terhadap rasa gurih hidrolisat protein ikan adalah peptida asam yang memiliki residu asam amino hidrofilik, dimana peptida ini mempunyai berat molekul di bawah 1000 dalton.

Keju

Keju merupakan bahan pangan yang disukai oleh kebanyakan orang, karena rasanya yang gurih dan mempunyai mouthfeel yang enak. Pengujian terhadap kandungan dan kontribusi peptida yang terdapat pada fraksi larut air terhadap flavor berbagai jenis keju telah dilakukan, yaitu keju Cheddar yang difermentasi selama 9 bulan (Fernandez et al. 1998), keju yang terbuat dari susu sapi, domba dan kambing (Molina et al. 1999) dan keju Bouton de Culotte-BC dan Crottin de Chavignol-CC yang terbuat dari susu kambing (Salles et al. 2000). Pada umumnya, peptida-peptida yang berperan dalam pembentukan karakteristik rasa dan flavor keju adalah peptida yang mempunyai berat molekul kurang dari 1000 Da. Akan tetapi penelitian-penelitian itu menunjukkan bahwa peptida yang terdapat dalam fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Da dan 500 Da tidak berkontribusi secara langsung terhadap pembentukan flavor keju, demikian pula terhadap rasa umami keju. Peptida yang terdapat pada keju berperan secara sinergis dengan mineral untuk menurunkan rasa pahit (Engel et al. 2000).

(28)

Kacang Kedelai

Sumber peptida gurih lainnya adalah kacang kedelai. Protein kacang kedelai dapat langsung dihidrolisis baik secara enzimatik, hidrolisis dengan asam ataupun dengan cara hidrolisis enzimatik yang direaksikan dengan glukosa melalui pemanasan menghasilkan Hydrolyzed Vegetable Protein (HVP) yang mempunyai rasa gurih (Aaslyng et al. 1998).

Selain itu, peptida gurih dapat diambil dari fermentasi kacang kedelai dalam bentuk moromi yang merupakan salah satu tahap dalam pembuatan kecap, dimana penelitian mengenai hal ini telah dilakukan oleh Apriyantono et al. (2003). Mereka menemukan bahwa peptida yang berkontribusi terhadap rasa gurih kecap adalah peptida berberat molekul kurang dari 500 Da yang dihasilkan dari proses ultrafiltrasi ekstrak moromi. Selanjutnya Lioe et al. (2003) melakukan fraksinasi fraksi yang mengandung peptida kurang dari 500 Da dengan kromatografi filtrasi gel dan menghasilkan 4 fraksi. Dari keempat fraksi yang diuji, fraksi ke 2 mengandung asam glutamat dalam jumlah yang paling besar (15.48%), akan tetapi kandungan asam glutamat bebasnya hanya 1.43% (b/b). Hal ini menunjukkan bahwa asam glutamat yang ada didalam fraksi 2 berada terikat dalam suatu peptida yang menghasilkan rasa gurih.

Produk Olahan Ikan Tradisional

Hasil olahan produk-produk perikanan secara tradisional seperti ikan asin, ikan peda dan kecap ikan dikenal sebagai produk yang mempunyai cita rasa yang khas khususnya untuk rasa asin dan gurihnya. Berdasarkan hasil penelitian Saleha (2004) terhadap berbagai jenis ikan asin, ikan peda dan kecap ikan, diketahui bahwa ekstrak ikan asin jambal roti goreng, ekstrak ikan peda putih goreng dan ekstrak kecap ikan cap ikan merah, merupakan produk-produk yang mempunyai rasa gurih tertinggi. Penelitian selanjutnya menemukan bahwa fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Da mempunyai rasa gurih tertinggi daripada fraksi-fraksi berberat molekul lebih dari 1000 Da. Hal ini menunjukkan bahwa

(29)

senyawa-senyawa yang berperan terhadap rasa gurih ketiga ekstrak adalah senyawa-senyawa berberat molekul kurang dari 1000 Da.

Keberadaan peptida yang mempunyai rasa gurih pada ekstrak ikan asin jambal roti goreng (Rahmawaty 2004) dan ekstrak kecap ikan cap ikan merah (Priliandari 2004) diketahui setelah dilakukan fraksinasi lebih lanjut menggunakan kromatografi gel dengan kolom Sephadex G 10. Penggunaan kolom ini dapat menghasilkan 5 fraksi peptida yang terpisah dengan garamnya, dimana pada umumnya garam terdapat pada fraksi 2. Dugaan adanya peptida yang mempunyai rasa gurih pada ketiga ekstrak adalah tingginya skor rasa gurih pada fraksi 1. Fraksi 1 ini tidak mengandung garam dan mempunyai proporsi asam glutamat bebas per total asam glutamat yang kecil, sehingga diduga asam glutamat terikat dalam bentuk peptida yang memberikan rasa gurih.

Teknik Isolasi Peptida

Tahap-tahap yang dilakukan untuk mengisolasi peptida yang memberikan rasa gurih secara umum adalah ekstraksi, filtrasi dan fraksinasi hingga mendapatkan satu fraksi yang berpotensi mengandung peptida gurih. Setelah itu dilakukan pemurnian dengan teknik elektroforesis untuk mendapatkan senyawa tunggal (peptida gurih). Tahap akhir adalah identifikasi untuk mendapatkan struktur primer peptida gurih. Skema isolasi peptida yang mempunyai rasa gurih dapar dilihat pada Gambar 1.

Ekstraksi peptida gurih cukup mudah tergantung dari bentuk bahan pangannya yaitu padatan, cairan atau campuran keduanya. Pelarut yang biasa digunakan adalah air karena peptida merupakan senyawa yang larut air. Untuk mengekstrak peptida dari bahan yang masih mengandung protein yang belum terhidrolisis seperti daging sapi, ekstraksi dilakukan dengan menggunakan air panas (Yamasaki dan Maekawa 1978). Akan tetapi bahan pangan yang telah melalui proses pengolahan yang menyebabkan proteinnya terhidrolisis menjadi peptida-peptida kecil, misalnya proses fermentasi, ekstraksi cukup dengan menggunakan air dingin seperti pada keju (Salles et al. 2000). Kacang kedelai yang telah melalui fermentasi oleh kapang dan garam yang sering disebut moromi

(30)

mempunyai bentuk campuran cairan dan padatan, sehingga untuk mengekstrak peptidanya cukup dengan menghomogenisasi moromi dan memerasnya hingga didapat ekstrak moromi (Apriyantono et al.2003 dan Lioe et al 2003). Senyawa-senyawa lain yang ikut terekstrak seperti lemak, karbohidrat dan lain sebagainya, dapat dihilangkan dengan cara sentrifugasi.

Tahap isolasi selanjutnya adalah penyaringan ekstrak larut air dengan menggunakan teknik ultrafiltrasi. Pada umumnya, ultrafiltrasi dilakukan hingga mendapatkan fraksi peptida dengan berat molekul kurang dari 1000 Da (Salles et al. 2000; Molina et al. 1999 dan Mojarro-Guerra et al. 1991), akan tetapi Apriyantono et al (2003) dan Lioe et al. (2003) melakukannya hingga mendapatkan fraksi berberat molekul kurang dari 500 Da. Selain dengan menggunakan teknik ultrafiltrasi, penyaringan juga dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel dengan menggunakan kolom sephadex G-25 (Yamasaki dan Maekawa 1978) dan sephadex G-15 (Oka dan Nagata (1974).

Setelah didapat fraksi-fraksi peptida berberat molekul tertentu, dilakukan fraksinasi terhadap fraksi-fraksi dengan menggunakan teknik kromatografi. Teknik kromatografi yang umum digunakan adalah kromatografi filtrasi gel dan kromatografi pertukaran ion. Proses fraksinasi dapat dilakukan dengan menggabungkan teknik-teknik kromatografi ini, seperti Oka dan Nagata (1974) melakukan tiga kali fraksinasi dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion, dimana masing-masing menggunakan kolom yang berbeda-beda sehingga dapat memisahkan fraksi non ionik, asam, basa dan netral. Yamasaki dan Maekawa (1978) menggabungkan teknik kromatografi filtrasi gel dengan kolom sephadex G-25 dengan kromatografi pertukaran ion yang menggunakan kolom Dowex 50 x 4. Peneliti lainnya, Mojarro-Guerra et al. (1991) menggabungkan teknik kromatografi pertukaran ligan dan pertukaran ion dengan kolom aminex. Teknik lainnya yang telah digunakan adalah re-kromatografi fraksi dengan teknik kromatografi filtrasi gel (kolom Sephadex G-25) (Fernandez et al. 1998). Adanya perbedaan penggunaan teknik kromatografi yang digunakan, tergantung dari jenis-jenis peptida yang terdapat pada ekstrak.

(31)

• untuk mendapatkan fraksi terpilih dapat dilakukan dengan beberapa teknik kromatografi

Gambar 1 Skema isolasi peptida pemberi rasa gurih

Bahan pangan ¬ Air panas ¬ Enzimatis Identifikasi : Elektroforesis, LC-MS, peptide sequencer

Fraksinasi dengan kromatografi Ultrafiltrasi

Ekstraksi

Fraksi 1 Fraksi 2 …….. Fraksi n

Fraksi tergurih

………

Fraksi B

Fraksi A Fraksi n

(32)

Profil peptida yang terdapat pada fraksi berpotensi hasil fraksinasi dapat diketahui dengan menggunakan teknik elektroforesis, baik elektroforesis kertas (Yamasaki dan Maekawa, 1978 dan Oka dan Nagata, 1974) maupun Capillary Electroforesis (Lioe et al. 2003). Teknik lainnya adalah dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Mojarro-Guerra et al. 1991; Fernandez et al. 1998 dan Molina et al. 1999).

Tahap akhir dari isolasi peptida adalah menentukan urutan asam amino penyusun peptida tersebut yang dapat dilakukan dengan metode degradasi Edman untuk menentukan urutan N – terminal dan metode Carboxypeptidase A (Cpase A) untuk menentukan urutan C-terminal terpisah (Yamasaki dan Maekawa 1978). Metode lainnya adalah gas phase isothiocyanate degradation yang merupakan modifikasi degradasi Edman (Mojarro-Guerra et al. 1991). Cara lain yang lebih mudah dan cepat adalah dengan menggunakan peptide sequencer (Wassenar et al. 1995) atau asam amino analyzer (Fernandez et al. 1998).

Identifikasi Peptida

Capillary Electrophoresis (CE)

Peptida maupun asam amino merupakan senyawa yang dapat mengion dalam larutan, dimana jenis ion yang terbentuk sangat tergantung dari pH larutan. Sifat inilah yang menyebabkan analisis terhadap kedua senyawa ini banyak dilakukan menggunakan Capillary Electrophoresis (CE). Adapun prinsip kerjanya adalah kolom kapiler yang berisi buffer ditempatkan pada 2 bejana buffer dan dialiri medan listrik. Hal ini menyebabkan pembentukan ion-ion pada kapiler sehingga mengakibatkan perpindahan ion-ion analit yang didasarkan oleh electrophoretic mobility masing-masing komponen (Sorensen et al. 1999). Sistem peralatan pada CE dapat dilihat pada Gambar 2.

(33)

Gambar 2 Skema komponen-komponen utama pada sistem Capillary Electrophoresis

Mode pemisahan yang dapat digunakan untuk peptida adalah Capillary Zone Electrophoresis (CZE), Capillary Isoelectric Focusing (CIF), Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC) dan Capillary Gell Electrophoresis (CGE). Akan tetapi, yang banyak digunakan adalah mode CZE karena mempunyai efisiensi yang tinggi terhadap molekul-molekul kecil, mudah diotomatisasi, memungkinkan untuk kuantifikasi secara langsung (Schoneich et al. 1993). Kolom kapiler dalam mode ini terdiri dari fused silica yang permukaannya bermuatan negatif karena terionisasinya gugus silanol (SiO-), dimana derajat muatannya tergantung dari pH larutan dalam kapiler (Sorensen et al. 1999).

Pemisahan senyawa pada CE, idealnya disebabkan oleh perbedaan mobilitas elektroforetik, dimana suatu peptida mempunyai mobilitas elektroforesis tertentu yang bersifat konstan tergantung dari muatan, viskositas larutan dan radius ion (Messana et al. 1997). Masalah utama pada peptida adalah adanya beberapa peptida dan protein yang berinteraksi kuat dengan permukaan silanol-silanol kapiler yang mengandung fused-silica. Interaksi ini menghasilkan penyimpangan bentuk peak dan ireprodusibiliti waktu elusi dan kuantifikasi. Untuk mencegahnya perlu penggunaan buffer ber-pH rendah sehingga kondisi

(34)

ionisasi permukaan silanol akan ditekan sehingga interaksi peptida bermuatan positif (pH<pI) akan diminimisasi (Schöneich et al. 1993).

Detektor yang dapat digunakan untuk mendeteksi peptida adalah Diode Array Detector dengan menerapkan absorbansi UV/VIS sehingga didapat informasi spektral yang sangat penting dalam identifikasi dan purifikasi (Kitagishi 1997). Adanya peptida dapat dideteksi dengan menggunakan panjang gelombang 215 nm yang merupakan daerah penyerapan ikatan peptida, selain itu panjang gelombang 230 atau 254 nm juga sering digunakan (Bailey 1992). Untuk asam amino aromatik seperti L-Phe, L-Tyr dan L-Trp dapat dilakukan pendeteksian pada panjang gelombang 280 nm (Bailey 1992). Dari 20 asam amino, hanya 3 asam amino inilah yang dapat menyerap sinar UV secara nyata (Cancalon 1997).

Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)

Liquid Chromatography tandem MS (LC-MS/MS) merupakan alat yang banyak digunakan untuk mengidentifikasi campuran beberapa peptida baik hasil sintesis maupun yang berasal dari sampel biologi. Di dalam reviewnya, Mehlis dan Kertscher (1997), memperlihatkan luasnya aplikasi LC-MS/MS untuk analisis peptida yaitu telah melebihi 100 peptida dan protein yang terdaftar pada review biannual (1994/95).

Person et al. (2004) telah berhasil melakukan identifikasi dan karakterisasi peptida berberat molekul rendah (di- dan tripeptida) dari minuman anggur dengan menggunakan LC-MS/MS tanpa memerlukan persiapan sampel yang rumit yaitu hanya dengan ultrafiltrasi hingga MWCO 1000 Da. Untuk sampel peptida yang berasal dari bahan-bahan biologi yang diekstrak dengan air harus melalui tahap persiapan sampel sebelum disuntikkan ke LC-MS/MS. Hal ini disebabkan sampel hanya mengandung peptida dalam jumlah kecil sehingga perlu dilakukan pengkayaan (enrichment) yang dapat dilakukan dengan menggunakan teknik SPE (Solid Phase Extraction) (Heraiz dan Casal 1995) dan mengandung garam yang tinggi (Mehlis dan Kertscher 1997). Garam dapat mengganggu sistem MS jika terdeposit di dalamnya. Sedangkan untuk menganalisa peptida sintetis tidak memerlukan persiapan sampel karena sudah mengandung peptida murni seperti yang dilakukan oleh Petitris et al. (2002) yang menganalisis campuran 23 peptida

(35)

berberat molekul rendah (20 dipeptida, 2 tripeptida dan glutathione teroksidasi) dengan menggunakan ion pair reverse phase LC-ESI-MS tanpa melakukan derivatisasi.

Untuk mendapatkan hasil yang optimum dalam mengidentifikasi peptida menggunakan LC-MS/MS perlu dilakukan pengembangan metode LC dan MS-nya sehingga dapat menghasilkan spketrum massa yang baik tetapi tidak merusak sistem detektor MS (Careri dan Mangia 2003). Penelitian untuk mendapatkan kondisi pemisahan yang optimum telah banyak dilakukan. Dalam reviewnya, Mehlis dan Kertscher (1997) menyatakan bahwa standar fase gerak yang digunakan pada lebih dari 90% penelitian mengenai analisis peptida dengan LC-MS/MS adalah campuan asetonitril (ACN) dengan air dan diasamkan oleh trifluoroacetic acid (TFA, 0.05-0.1%). Penggunaan ACN/air sebagai solven disebabkan oleh karakteristik campuran ini yang dapat membentuk larutan terprotonasi sebagai akibat dari reaksi solven dengan asam lemah seperti asam asetat, asam format atau asam propionat yang ditambahkan (Cech dan Enke 2001). Adapun teknik elusi yang umum digunakan adalah gradien agar dapat memperkecil kemungkinan hilangnya peptida yang sangat polar karena terelusi terlalu cepat atau kehilangan peptida yang sangat tidak polar karena berikatan kuat dengan fase diam (Mehlis dan Kertscher 1997).

Penggunaan zat aditif berupa ion pairing agent banyak digunakan untuk lebih mengoptimalkan pemisahan peptida dan untuk mempertajam bentuk peak (Petritis et al. 2002, McCalley 2004, Toll et al., 2005). Pada mulanya zat aditif yang banyak ditambahkan pada eluen adalah TFA (Trifluoroacetic acid), akan tetapi penelitian lebih lanjut menunjukkan bahwa penggunaan TFA dapat menurunkan sensitiftas MS (McCalley 2004). Sebagai alternatif penggunaan ion pairing agent dapat dengan menggunakan ammonium format (McCalley 2004), NFPA (Nonafluoropentanoic acid) dan TDFHA (Tridecafluoroheptaenoic acid) (Petritis et al. 2002).

Teknik ionisasi yang sesuai dengan LC-MS/MS adalah electrospray ionisation (ESI) (Burlingame et al. 1994). Menurut Van Bramer (1998), penggunaan teknik ESI ini disebabkan oleh sifat peptida yang labil terhadap panas, sehingga ionisasi tidak dapat dilakukan pada suhu tinggi. Adapun prinsip

(36)

dari ESI-MS in adalah solven polar yang mengandung ion-ion analit di semprot dari ujung logam kapiler, jika disertai potensial yang tinggi (4-5 kV, positif atau negatif dan tergantung dari muatan ion-ion analit) antara kapiler dengan lempeng logam, maka akan terbentuk droplet bermuatan tinggi (diameter 1 – 3 µm). Droplet tersebut dibantu oleh aliran gas inert kering dan panas (bukan prasyarat untuk pembentukan spray) kemudian bergerak menuju lempeng logam yang berpotensial lebih rendah. Hal ini menyebabkan droplet-droplet berkumpul dan akhirnya akan dikeluakan dari bentuk droplet menjadi fase gas (Mehlis dan Kertscher 1997). Untuk lebih jelasnya Cech dan Enke (2001) menjelaskan prinsip kerja ESI dengan menggunakan skema seperti terlihat pada Gambar 3.

Gambar 3 Skema proses ionisasi elektrospray. Larutan analit dipompa melalui needle dimana tegangan tinggi diberikan. ”Taylor cone’ dengan muatan positif berlebih dipermukaannya terbentuk sebagai hasil daru perbedaan medan listrik antar ESI needle dengan eletroda yang berlawanan. Droplet bermuatan terbentuk dari ujung Taylor cone dan droplet-droplet ini diuapkan dan masuk ke MS untuk menghasilkan molekul analit bebas dan bermuatan yang dapat dianalisa rasio massa per muatannya (m/z) (Cech dan Enke, 2001).

Untuk mengetahui atau menguraikan struktur peptida sehingga dapat diidenifikasi, digunakan teknik aktivasi tumbukan (Collisionally Activated decomposition : CAD) yang secara umum diasumsikan mengacu pada tumbukan-tumbukan dengan atom-atom gas pada tekanan tinggi (Burlingame et al. 1994). Peptida-peptida yang telah dikenakan CAD pada energi tertentu akan mengalami

(37)

fragmentasi, dimana kemungkinan pembentukan ion-ionnya sangat banyak tergantung jenis peptidanya (Gambar 4).

Secara umum pada fragmentasi peptida, jika energi tumbukan relatif tinggi, maka fragmentasi melibatkan pemecahan ikatan tunggal dan terbentuklah ion-ion tipe b. Sedangkan jika energi tumbukan relatif kecil, maka kerusakan ikatan akan terjadi secara simultan sehingga akan terbentuk ion-ion tipe y (Staudenmann et al. 2000 Di dalam : Petritis et al. 2002). Berdasarkan penelitian yang dilakukan Petritis et al. (2000) diketahui bahwa energi tumbukan (CAD) untuk dipeptida yang paling optimum adalah 15 eV.

Gambar 4 Pola fragmentasi peptida (Harrison et al. 2000)

Berdasarkan ion-ion yang terbentuk dapat dilakukan identifikasi kandungan asam amino serta urutannya. Wysocki et al. (2003) mengemukakan modifikasi penentuan urutan asam amino suatu peptidauntuk interpretasi dari spektrum sector-TOF SID yang bermuatan +1, yaitu (1) menentukan berat molekul peptida yang tidak diketahui dari m/z ion prekursor dan informasi komposisi dari ion-ion immonium, (2) menandai residu terminal-C dari ion-ion y1

dan y2, (3) menemukan pasangan ion b/a (kemudian residu terminal-N) dengan

adanya ion yn-2, (4) menandai secara langsung ion b2 dengan adanya yn-1, selisih

(38)

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak ikan asin jambal roti yang telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel dengan Sephadex G10 yang telah dilakukan oleh Rahmawaty (2004). Bahan-bahan lainnya untuk identifikasi adalah air bebas ion, asetonitril (Merck), metanol (Merck) dan akuades. Sedangkan untuk uji sensori digunakan NaCl dan monosodium glutamate (MSG) sebagai larutan standar, L-Fenilalanin (Sigma), L-Triptofan (Sigma), L-Tirosin (Sigma), L-Histidin-HCl (Sigma) dan kreatinin (Sigma). Untuk seleksi dan pelatihan panelis diperlukan larutan NaCl (Merck), MSG (Quest), asam sitrat, sukrosa dan kafein. Larutan untuk uji sensori diencerkan menggunakan air minum dalam kemasan merk Aceros.

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pH meter, freeze dryer, Solid Phase Extraction (SPE) dengan kolom C18 (LC-18) dari Supelco, LC-MS/MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry): LC (agilent 1100 series), MS (Bruker Daltonics Esquire 6000), kolom C8 (Agilent Eclipse XDB-C8, 5 µm (4,6 x 150 mm). Alat lainnya adalah Capillary Electrophoresis (CE) Hewlett Packard Capillary Zone electrophoresis dan HP ChemStation untuk sistem kontrol, pengumpulan dan analisis data.

Metode

Isolasi Peptida Dari Fraksi Tergurih menggunakan Solid Phase Extraction (Herraiz dan Casal, 1995)

Teknik ini merupakan mode pemisahan kromatografi yang menggunakan fase diam C18. Kolom disposible yang digunakan mengandung 500 mg adsorben (40 ì m, 60 • ) dengan volume kolom 2.8 ml). Sebelum digunakan, dilakukan pengkondisian kolom dengan cara melewatkan solven : 2 ml metanol, 2 ml air bebas ion dan 2 ml air bebas ion yang mengandung 0.1 % TFA. Setelah itu,

(39)

sebanyak 1 ml larutan sampel (kurang lebih 150 nmol) dimasukkan ke dalam kolom dan ditarik secara perlahan dengan kecepatan 1 ml/menit dalam kondisi vakum bertekanan 20 inHg. Eluat yang keluar kolom ditampung sebagai fraksi tidak tertahan. Setelah itu, ditambahkan 2 ml air bebas ion yang mengandung TFA 0.1% dan eluatnya ditampung sebagai fraksi 1. Fraksi 2 hingga 8 didapatkan secara berurutan setelah menambahkan 2 ml solvent yang mengandung 10% - 40% ACN yang mengandung 0.1% TFA dengan interval kenaikan ACN 5% (Gambar 5).

Identifikasi Peptida menggunakan CE

Peptida dan asam amino yang terdapat pada fraksi-fraksi hasil fraksinasi menggunakan kromatografi gel dengan Sephadex G10 yang telah dilakukan oleh Rahmawaty (2004) diidentifikasi menggunakan CE. Identifikasi peptida dengan CE dilakukan dengan menggunakan Capillary Zone Electrophoresis yaitu Hewlett Packard Capillary Zone electrophoresis dan HP ChemStation untuk sistem kontrol, pengumpulan dan analisis data. Kondisi yang diterapkan : kolom yang digunakan adalah fused silica dengan panjang 48.5 cm dan diameter dalam 50 ì m. Tegangan 15 kV dengan jumlah sampel yang diinjeksikan sebanyak 50 nl. Detektor yang digunakan adalah Diode Array Detector pada panjang gelombang 190 – 600 nm. Suhu eksternal 25oC dan buffer yang digunakan adalah asam fosfat 100 mM, pH 2.5.

Identifikasi Peptida menggunakan LC-MS

Identifikasi peptida dilakukan dengan menggunakan LC-MS (Sanz-Nebot, V. et al., 2002). Kondisi operasi LC-MS yang digunakan adalah kolom C18 (250 x 4.6 mm ID). Solven yang digunakan adalah campuran ACN yang mengandung 0.1% asam format(v/v) dengan air bebas ion yang mengandung 0.1% asam format(v/v). Sampel dielusi secara gradien yang berubah dari 2% - 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 30 menit, kemudian ditingkatkan menjadi 70% ACN yang mengandung 0.1% asam format dan dipertahankan

(40)

Gambar 5 Cara isolasi peptida dari fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti menggunakan teknik Solid Phase Extraction (SPE)

Kondisioning : 1. 2 ml metanol 2. 2 ml air bebas ion

Ditambahkan 2 ml sampel dengan konsentrasi 19 – 20 mg/ml

Ditambahkan 2 ml ACN 35% Ditambahkan 2 ml ACN 40% Ditambahkan 2 ml ACN 30% Fraksi H Fraksi G Fraksi F Ditambahkan 2 ml ACN 15%

Ditarik perlahan dengan kecepatan 1 ml/menit

Ditambahkan 2 ml air bebas ion

Ditambahkan 2 ml ACN 10%

Fraksi tidak tertahan

Fraksi E Fraksi D Fraksi C Fraksi B Fraksi A Ditambahkan 2 ml ACN 20% Ditambahkan 2 ml ACN 25%

(41)

selama 10 menit. Setelah itu, konsentrasi ACN diturunkan hingga 2% dan dipertahankan selama 10 menit. Flow rate solvent adalah 0.1 ml/menit. Detektor yang digunakan adalah mass spectrometry.

Seleksi Panelis

Seleksi panelis bertujuan untuk mendapatkan panelis yang mempunyai kemampuan dalam membedakan lima rasa dasar (manis, asam, asin, pahit dan gurih), mampu membedakan 2 rasa yang berdekatan dan mampu membedakan intensitas rasa. Uji-uji yang dilakukan adalah :

1. Uji Lima Rasa Dasar

Tujuan pengujian ini adalah untuk mendapatkan panelis yang dapat mendeteksi dan mengenali 5 rasa dasar (manis, asam, asin, pahit dan gurih). Jumlah panelis (calon panelis) yang diikutsertakan adalah 30-60 orang. Sedangkan metode pengujiannya dilakukan sebagai berikut : panelis diminta untuk menentukan rasa dasar dari 5 larutan yang diujikan seperti pada formulir isian yang disediakan (Lampiran 1). Pengujian ini dilakukan dengan 2 kali ulangan. Adapun cara penyajiannya adalah:

♦ Dalam 1 booth disediakan 5 set larutan yang masing-masing terdiri dari rasa manis (larutan sukrosa 1 %), asin (larutan NaCl 0.2%), asam (larutan asam sitrat 0.04%), pahit (larutan kafein 0.05%) dan gurih (larutan MSG 0.06%)

♦ Sebagai penetral disajikan air minum dan roti tawar

Panelis yang lolos seleksi adalah panelis yang mampu menjawab dengan benar paling sedikit 75%.

2. Uji Segitiga Rasa

Tujuan pengujian ini adalah untuk mengetahui kemampuan panelis dalam membedakan 2 rasa yang berdekatan yaitu rasa asam dan pahit serta rasa asin dan gurih. Dalam setiap pengujian yang dilakukan sebanyak 2 kali ulangan, setiap panelis akan mendapatkan pengacakan seperti pada Tabel 2.

Cara penyajian larutan uji adalah : dalam 1 booth tersedia 3 larutan uji, 2 larutan sama sedangkan yang lainnya beda. Konsentrasi larutan yang digunakan

(42)

sama untuk masing-masing rasa dengan uji rasa dasar. Panelis diminta untuk mendeteksi larutan mana yang berbeda seperti pada form isian pada Lampiran 2 dan 3. panelis yang lolos seleksi adalah panelis yang mampu menjawab benar minimal 75%.

Tabel 2 Sistem pengacakan sampel pada uji segitiga rasa asam-pahit dan asin-gurih

Panelis Sesi 1 Sesi 2 Panelis Sesi 1 Sesi 2

1 AAB BBA 7 ABB BAA

2 BBA ABA 8 ABA ABB

3 BAA BAB 9 BAB AAB

4 ABA ABB 10 BBA ABA

5 ABB BAA 11 AAB BBA

6 BAB AAB 12 BAA BAB

3. Uji Rangking

Tujuan pengujian ini adalah untuk mengetahui kemampuan panelis dalam membedakan tingkat intensitas rasa asin dan gurih. Metode uji yang digunakan adalah uji pasangan. Larutan sampel yang diujikan seperti tertera pada Tabel 3.

Table 3 Jenis dan konsentrasi larutan sampel untuk uji rangking pada pelatihan panelis

Rasa Stimuli Konsentrasi (g/L)

Asin NaCl 1.0 2.0 5.0 10.0

Gurih MSG 0.6 1 1.8 3.5

Sampel disajikan secara acak dimana masing-masing panelis akan mendapatkan pengacakan yang sama. Panelis yang diterima adalah panelis yang mampu merangking dengan benar dan panelis yang merangking terbalik pada konsentrasi yang berdekatan. Form isian dapat dilihat pada Lampiran 4.

(43)

Pelatihan Panelis

Pelatihan panelis dilakukan pada 14 orang panelis yang telah lolos seleksi. Pelatihan bertujuan agar panelis mengenal sampel yang akan diuji (ekstrak ikan asin jambal roti, ekstrak ikan peda putih dan kecap ikan berberat molekul kurang dari 1000 Da). Selain itu, pelatihan bertujuan agar panelis terbiasa/terlatih untuk melakukan uji skoring dalam menguji intensitas rasa asin dan gurih sampel. Pelatihan dilakukan dengan menyajikan 3 sampel, 3 standar rasa asin dan 3 standar rasa gurih. Sampel disajikan pada 3 konsentrasi berbeda yaitu 0.1% (b/v), 0.5% (b/v) dan 1.0% (b/v). Standar rasa asin adalah NaCl dengan konsentrasi 0.25% (b/v) untuk skor 50, 0.50% (b/v) untuk skor 80 dan 1.25% (b/v) untuk skor 150. Sedangkan standar rasa gurih digunakan larutan MSG dengan konsentrasi 0.05% (b/v) untuk skor 50, 0.10% (b/v) untuk skor 80 dan 0.20% (b/v) untuk skor 150. Panelis diminta untuk menilai intensitas rasa asin bersamaan dengan rasa gurih sampel uji setelah mencicip ke tiga standar. Intensitas rasa asin dan gurih dinilai dari skor 1 – 150 pada garis lurus sepanjang 15 cm. Form isian pelatihan panelis terdapat pada Lampiran 5. Selama pelatihan dilakukan pengujian kinerja panelis dengan mengamati rata-rata standar deviasi respon terhadap rasa asin dan gurih untuk masing-masing panelis.

Omission test (Engel et al., 2000)

Omission test digunakan untuk mengetahui peranan peptida dalam menghasilkan rasa gurih fraksi tergurih hasil kromatografi gel. Uji ini dilakukan dengan cara membuat larutan model yang terdiri dari MSG 4 mM, NaCl 80 mM dan asam amino sintetik sesuai hasil diidentifikasi, setelah itu diuji intensitas rasa gurih dan asinnya. Untuk mengetahui peranan masing-masing komponen, dilakukan penghilangan satu atau beberapa komponen kemudian diuji intensitas rasa gurih dan asinnya. Intensitas rasa gurih dan asin diuji menggunakan uji skoring dengan 14 panelis terlatih. Selanjutnya dilakukan analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pada á = 0.05 dengan menggunakan program SPSS 11.0.

(44)

PEMBAHASAN

Identifikasi Peptida Gurih menggunakan LC-MS/MS

Liquid Chromatography – Mass Spectrometry digunakan untuk mengetahui berat molekul peptida dan asam amino penyusunnya yang ada pada masing-masing fraksi. Campuran peptida yang ada pada fraksi akan dipisahkan berdasarkan kesamaan kepolaran dan selektifitasnya terhadap fase gerak (campuran air dan asetonitril) serta interaksinya dengan fase diam (C8). Setelah itu masing-masing senyawa akan diionisasi menggunakan teknik electrospray ionization (ESI) sehingga membentuk ion-ion molekul bermuatan positif yang akan dideteksi oleh MS1 untuk mengetahui massa peptida. Kemudian dilakukan seleksi parent ion (dari MS1) untuk kemudian dideteksi fragmentasinya (product ion) oleh MS2 sehingga dapat dilakukan identifikasi asam amino penyusunnya. Hal ini berlaku bagi senyawa yang menghasilkan muatan lebih dari 1, akan tetapi senyawa yang hanya menghasilkan muatan +1, identifikasi asam amino dapat dilakukan dari MS1 (Wysocki et al., 2003).

Kandungan asam amino pada peptida diduga berdasarkan spektrum MS (baik MS1 maupun MS2) yaitu dari adanya peak yang sesuai dengan berat molekul asam amino+1 [M+H]+, ion immonium dan adanya peak yang

menunjukkan pelepasan H2O (kehilangan massa 18) ataupun NH3 (kehilangan

massa 17) (Petritis et al., 2000; Petritis et al., 2002 dan Chimbault et al., 1999). Selain itu, kandungan asam amino diduga dari adanya kehilangan massa yang sesuai dengan massa asam amino yang kehilangan H2O karena telah berikatan

dengan asam amino lain membentuk ikatan peptida (Covey et al., 1991 dan D’Agostino et al., 1998). Adapun urutan dari asam amino belum dapat ditentukan karena memerlukan identifikasi yang lebih intensif dan memerlukan software khusus agar kesalahan penentuan urutan asam amino tidak terlalu besar.

Contoh pendugaan kandungan asam amino pada peptida yang teridentifikasi pada FTT Fraksi 1 ulangan 1 yaitu pada peak ke-6 dengan waktu retensi 16.1 menit dan berat molekul 430.0 Dalton. Fragmentasi senyawa ini dapat dilihat pada Lampiran 6a. Peptida ini diduga mengandung asam amino metionin (Met). Dugaan ini didasarkan oleh adanya ion dengan m/z 149.9, 132.8

Figur

Memperbarui...

Referensi

Memperbarui...

Related subjects :