Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 23 Peran Apoteker dalam Menjamin Mutu, Efektifitas, Keamanan pada Obat, Makanan dan
Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia
POTENSI ANTIHIPERURISEMIA DARI SENYAWA HASIL FRAKSINASI FASE ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL 96% DAUN SIRIH MERAH
(Piper crocatum Ruiz & Pav)
Dian Ratih Laksmitawati, Resty Andadi, Hindra Rahmawaty, Liliek Nurhidayati Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jl. Srengseng Sawah, Jagakarsa, Jakarta
Corresponding author email: dianratih.ffup@gmail.com
ABSTRAK
Daun sirih merah digunakan untuk mengobati berbagai macam keluhan penyakit. Salah satunya sebagai digunakan untuk meredakan penyakit akibat kadar asam urat yang tinggi. Dari penelitian in vitro diketahui bahwa fase etil asetat dari ekstrak etanol 96 % sirih merah mempunyai potensi menghambat enzim xantin oksidase, yaitu enzim yang mengubah substrat xantin menjadi asam urat dengan nilai IC 50 = 16,86 bpj. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui lebih lanjut fraksi mana yang mempunyai potensi penghambatan terhadap xantin oksidase. Fase etil asetat dari ektrak etanol 96% difraksinasi menggunakan kolom kromatografi dengan metode gradien. Fraksi ditampung dalam botol dan dilakukan kromatografi lapis tipis untuk menentukan pola kromatogram. Fraksi yang memiliki pola kromatogram yang mempunyai kemiripan pola akan disatukan, sehingga didapat 12 fraksi. Keduabelas fraksi diuji potensi penghambatan xantin oksidase secara spektrofotometri pada panjang gelombang 291 nm. Hasil menunjukkan bahwa fraksi ke 4 memberikan penghambatan yang tertinggi yaitu sebesar 40,9±1,27% pada konsentrasi fraksi 100 ppm. Untuk mengetahui karakteristik senyawa pada fraksi 4 harus diuji lebih lanjut dengan analisis uv,vis IR dan GC-MS.
Kata kunci : ekstrak sirih merah, penghambat xantin oksidase , antihiperurisemia
THE POTENCY OF ANTIHYPERURICEMIC ACTIVITY OF ETHYL ACETATE FRACTION FROM ETHANOLIC LEAVES EXTRACT OF RED BETEL
(Piper crocatum Ruiz & Pav)
ABSTRACT
Red betel leaves have been used to therapy many of disease symptoms. One of the symptom is hyperuricemia. In vitro study showed that ethyl acetate phase from 96 % ethanol extract of Red betel inhibited xanthine oxidase activity (IC 50 = 16,86 bpj). Xanthine oxidase is the enzyme which catalized the oxidation of xanthine to be an uric acid. The aim of this study is to explore which fraction of ethyl acetate phase that have the maximum inhibition of xanthine oxidase activity. Ethyl acetate phase were fractinated using gradien coloumn chromatography methods. All fractions were accomodated in container. The fractions were analized with thin layer chromatograpy to know the chromatogram profile. Fractions which had the same profile of chromatogram was put together. There was 12 fractions, at the end. The 12th of fractions were tested for their xanthine oxidase inhibition activity by spectrophotometry at 291 nm. Result showed that the fraction 4 had the maximum inhibition, that was 40,9±1,27% at 100 ppm. To know the characteristics of the compounds, the fraction 4 should be tested further with the analysis of the uv, vis and IR/GC-MS.
Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 24 Peran Apoteker dalam Menjamin Mutu, Efektifitas, Keamanan pada Obat, Makanan dan
Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia PENDAHULUAN
Kondisi hiperurisemia atau peningkatan kadar asam urat didalam tubuh banyak dialami oleh banyak penduduk di dunia. Jumlah penduduk yang mengalami hiperurisemia memperlihatkan pola peningkatan. Kadar asam urat yang tinggi di dalam darah dapat disebabkan pola makan yang banyak mengandung senyawa purin seperti misalnya daging dan jeroan. Tidak hanya karena pola makan, kondisi hiperurisemia juga dialami oleh pasien penderitan hipertensi, kolesterol dan diabetes tanpa penyebab yang diketahui. Penelitian menunjukkan adanya korelasi antara kadar kolesterol yang tinggi dengan kadar asam urat. Bahkan hiperurisemia dikatakan merupakan faktor resiko penyakit kardiovaskuler. Peningkatan jumlah pasien berpenyakit kardiovaskuler dapat memungkinkan peningkatan jumlah penderita hiperurisemia.
Hiperurisemia juga dapat berakibat timbulnya penyakit arthritis gout yaitu penyakit dengan gejala inflamasi dan nyeri pada persendian akibat penumpukan kristal asam urat. Asam urat yang meningkat di dalam darah akan mengendap dan mengkristal di persendian dan mengakibatkan nyeri akibat gesekan persendian. Kristal asam urat juga akan menyebabkan sel inflamatori akan direkrut ke persendian sehingga reaksi inflamasi akan terjadi.
Sampai saat ini tidak banyak jenis obat penurun kadar asam urat yang beredar di Indonesia. Penurun kadar asam urat adalah obat yang dapat menghambat aktivitas xantin oksidase dan obat yang dapat meningkatkan ekskresi asam urat. Penghambat xantin oksidase yang dikenal adalah alopurinol sedangkan peningkat ekskresi asam urat adalah urikosurik probenesid dan sulfinpirazon. Kondisi hiperurisemia mempunyai kecenderungan yang berlangsung lama sehingga konsumsi obat tersebut khususnya alopurinol juga berlangsung lama. Sampai saat ini, obat yang banyak digunakan di Indonesia untuk pengobatan hiperurisemia adalah alopurinol yang bekerja dengan menghambat enzim xantin oksidase yang berperan dalam pembentukan asam urat.
Namun, alopurinol ini dapat menyebabkan efek samping seperti nefropati, reaksi kulit (berupa kulit kemerahan), reaksi alergi (berupa demam, menggigil, leukopenia/ leukositosis, eosinofilia, atralgia, pruritus), gangguan saluran cerna, dan kerusakan hati, sehingga diperlukan obat hiperurisemia yang lebih aman (Setiawan, 2012). Berdasarkan hal tersebut maka perlu pencarian alternatif obat yang aman. Salah satu bahan yang potensial dan cenderung lebih aman berasal dari herbal. Sirih merah adalah herbal yang secara empirik digunakan untuk pengobatan segala jenis penyakit termasuk penyakit gout.
Penelitian sebelumnya membuktikan bahwa ekstrak etanol yang dipartisi dengan etil asetat menunjukkan kemampuan penghambatan enzim xantin oksidase melalui pengujian invitro. Potensi penghambatan xantin oksidase , ditandai dengan IC50, pada ekstrak etanol 96% fase n-heksan , etil asetat, n-butanol dan air adalah berturut-turut sebesar 40.22 , 16.86, 23.74 bpj dan 49.09 bpj (Laksmitawati dkk., 2014). Menurut Apaya, ekstrak yang mampu menghambat lebih dari 50% aktivitas enzim pada konsentrasi 50 ppm dapat dikatakan memiliki aktivitas kuat sebagai inhibitor sehingga dapat diteliti lebih lanjut (Apaya et al, 2001), sehingga fase etil asetat eksrak etanol daun sirih merah tergolong jenis komponen yang dapat dieksplorasi lebih lanjut mengenai fraksi mana yang menunjukkan penghambatan terbesar. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi bukti ilmiah adanya senyawa yang terkandung dalam daun sirih merah yang mempunyai aktivitas biologi berupa pemnghambatan enzim xantin oksidase.
METODE Bahan dan Alat
Bahan penelitian yang digunakan adalah daun sirih merah yang dikumpulkan dari Bogor dan dideterminasi di Herbarium Bogoriense sebagai Piper crocatum dengan familia piperaceae. Daun sirih merah disortasi dan dicuci bersih kemudian diiris dan dikeringanginkan, diserbukan dan diayak. Pelarut yang digunakan adalah etanol 96% , n-heksan dan etil asetat teknis yang telah
Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 25 Peran Apoteker dalam Menjamin Mutu, Efektifitas, Keamanan pada Obat, Makanan dan
Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia didestilasi. Untuk pemisahan digunakan
kolom yang diisi dengan serbuk silika gel dan celite. Untuk bioasai penghambatan xantin oksidase digunakan enzim xantin oksidase SIGMA X-1875, substrat Xantin bioultra Sigma X-4002 dengan pelarut dapar fosfat salin.
Ekstraksi dan partisi
Sejumlah total lebih kurang 1 kg serbuk daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz&Pav.) diekstraksi dengan cara maserasi dengan pengaduk kinetik selama 3 jam pada suhu kamar dengan menggunakan etanol 96%. Setelah itu disaring dengan menggunakan kertas saring. Ampas di maserasi kembali hingga 4 kali pengulangan. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan rotavapor hingga didapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental yang didapatkan ditimbang kemudian dihitung nilai DER-native.
Ekstraksi dilanjutkan dengan partisi ekstrak dengan pelarut yang berbeda kepolarannya, dimulai dari n-heksana yang bersifat non polar. Ampas sisa partisi dengan n-heksan kemudian dipartisi kembali dengan asetat yang bersifat semipolar yaitu etil asetat. Filtrat etil asetat kemudian dirotavaporasi sehingga didapat ekstrak kental.
Fraksinasi dengan kromatografi kolom gradien
Ekstrak kental dari fase etil asetat difraksinasi dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel 60 secara gradien. Fase gerak dituangkan kedalam kolom yang telah diisi dengan kapas, sea sand B dan silika gel 60 mesh. Sejumlah fase etil asetat dihomogenkan dengan selite 545 sampai sampel kering dan homogen kemudian dimasukkan ke dalam kolom. Fase gerak dituangkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom. Eluat dari tiap fraksi ditampung dalam botol kemudian diuapkan. Masing-masing fraksi yang didapat dianalisis dengan menggunakan kromatografi lapis tipis. Fraksi yang memiliki kromatogram yang sama digabung.
Uji Aktivitas Penghambatan Xantin Oksidase In Vitro
Uji inhibisi aktivitas xantin oksidase secara in vitro menurut (Tamta et al. 2005). Uji daya
inhibisi ekstrak dan fraksi pada XO dilakukan pada kondisi optimumnya. Ekstrak dalam 1,45 mL dapar fosfat 50 mM pH 7.5 dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambah 1 ml substrat xantin 0,3 mM dalam dapar fosfat pH 7,5 kemudian dilakukan prainkubasi pada suhu 25˚C selama 15 menit. Setelah itu sebanyak 0.05 ml ditambah xantin oksidase 0.1 unit/ml dan diinkubasi pada suhu 25˚C selama 45 menit. Setelah diinkubasi, campuran segera ditambahkan HCl 1 N sebanyak 0,5 ml untuk menghentikan reaksinya. Serapan campuran diukur pada panjang gelombang 291 nm dengan spektrofotometer UV untuk melihat seberapa besar asam urat yang terbentuk dalam sampel uji. Daya inhibisi yang diperoleh dibandingkan dengan alopurinol.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil dan Pembahasan
Suatu bahan yang memiliki kemampuan menghambat xantin oksidase mempunyai potensi menghambat asam urat. Xantin oksidase adalah enzim yang mengoksidasi nukleotida purin menjadi asam urat. Pada orang yang mengkonsumsi makanan tinggi purin akan mungkin terjadi peningkatan kadar asam urat darah. Asam urat mempunyai kelarutan yang terbatas di dalam air. Peningkatan kadar asam urat menyebabkan kemungkinan kristalisasi asam urat dalam jaringan terutama jaringan lunak seperti sendi dan pada akhirnya menyebabkan nyeri dan inflamasi yang disebut dengan arthritis gout. Usaha menghambat enzim xantin oksidase merupakan usaha untuk mencegah dan mengobati gejala arthritis gout. Sirih merah ,dengan nama latin Piper crocatum Ruiz & Pav, telah banyak digunakan secara empiris sebagai antibakteri dan lain-lain.
Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 26 Peran Apoteker dalam Menjamin Mutu, Efektifitas, Keamanan pada Obat, Makanan dan
Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia Fraksinasi fase etil asetat dari ekstrak etanol
daun sirih merah didapat 12 fraksi. Keduabelas fraksi tersebut diuji kekuatan penghambtan enzim xantin oksidase secara in vitro. Hasil pengujian dapat dilihat pada tabel 1. Ekstraksi etanol serbuk daun sirih merah didapat rendemen 22,45% sedangkan dari partisi fase etil asetat didapat Dari 1038,5 gram serbuk simplisia sirih merah yang diekstraksi dengan etanol 96% didapat rendemen 1,29 %. Keseluruhan ekstrak di partisi dengan n-heksan, dilanjutkan dengan etil asetat. Hasil partisi etil asetat dikeringkan dengan rotavapor dan didapat 3,00 gram. Fraksinasi menggunakan kromatografi kolom gradien didapatkan 12 fraksi. Dari keduabelas fraksi didapatkan hasil bahwa fraksi ke 4 memiliki persen hambat terbesar dibanding fraksi lainnya yaitu sebesar 40,9 ± 1,27% pada konsentrasi fraksi 100 bpj.
TABEL 1. Berat bahan (simplisia, ekstrak dan fraksi) yang digunakan dan persentase penghambatan enzim xantin oksidase/100 bpj fraksi Bahan Berat (gram) Rata-rata % inhibisi /100 bpj fraksi terhadap xantin oksidase ± SD (n=3) Fraksi 1 0,0205 19,41 ± 1,88 Fraksi 2 0,0096 21,48 ± 4,67 Fraksi 3 0,0146 24,81 ± 0,64 Fraksi 4 0,0121 40,9 ± 1,27 Fraksi 5 0,0145 32,86 ± 0,51 Farksi 6 0,1806 30,63 ± 2,27 Fraksi 7 0,1699 30,29 ± 1,61 Fraksi 8 0,2567 28,32 ± 1,26 Fraksi 9 0,5971` 24,58 ± 0,18 Fraksi 10 0,0368 24,66 ± 8,00 Fraksi 11 0,5566 28,97 ± 11,66 Fraksi 12 0,5964 21,79 ± 2,98
Diduga jenis senyawa yang bertanggungjawab pada sifat penghambatan xantin oksidase adalah flavonoid. Beberapa laporan penelitian menyatakan bahwa flavonoid yang memiliki cincin benzopiran seperti silbinin, galangin, apigenin, baikalin, dan krisin mampu menghambat kerja enzim xantin oksidase (Umamaheswari, 2012 ). Laporan lain menyatakan bahwa senyawa flavonoid yang
memiliki aktivitas penghambatan enzim xantin oksidase adalah krisin, apigenin, kuersetin, luteolin, galangin, dan kaemferol (Cos, 1998).
Salah satu metabolit sekunder yang terkandung dalam daun sirih merah adalah flavonoid. Jenis flavonoid yang terdapat pada daun sirih merah adalah senyawa flavonol, flavanon, isoflavon, dan auron (Arishandy, 2010). Kaemferol dan kuersetin merupakan senyawa golongan flavonol. Apigenin dan luteolin merupakan senyawa golongan flavon. Isolasi yang telah dilakukan terhadap ekstrak sirih merah menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid pada fraksi etil asetat dan kuersetin (senyawa golongan flavonoid) pada fraksi etanol yang mampu bekerja sebagai antioksidan (Rachmawati, 20114). Senyawa flavonol, flavanon, dan isoflavon yang dikandung oleh daun sirih merah memiliki struktur cincin benzopiran. Oleh karena itu, daun sirih merah berpotensi dalam menghambat xantin oksidase.
KESIMPULAN
Eksplorasi bukti ilmiah potensi khasiat antihiperurisemia ekstrak daun sirih merah dilakukan melalui ekstraksi dan isolasi menggunakan etanol 96%. Fraksinasi terhadap fase etil asetat dipandu dengan uji aktivitas penghambatan xantin oksidase menunjukkan bahwa fraksi ke 4 menunjukkan aktivitas penghambatan tertinggi, yaitu 40,9 ± 1,27 %.per 100 bpj fraksi melalui pengujian aktivitas enzim xantin oksidase secara spektrofotometri pada panjang gelombang 291 nm
UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian ini adalah bagian dari penelitian Hibah Bersaing Tahun Kedua Pendanaan tahun 2015. Terima kasih kepada Kemenristek Dikti atas kesempatan dan dana yang diberikan.
Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 27 Peran Apoteker dalam Menjamin Mutu, Efektifitas, Keamanan pada Obat, Makanan dan
Kosmetik Sebagai Upaya Meningkatkan Derajat Kesehatan Masyarakat Indonesia DAFTAR PUSTAKA
Apaya KL, Chichioco-Hernandez CL, 2011: Xanthine oxidase inhibition of selected Philippine medicinal plants, J Med Plant Res:5(2):289-92
Arishandy DNAT, 2010: Isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid dari daun sirih merah (Piper betle L. var Rubrum) (skripsi). Malang: Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim;. h. 91.
Cos P, Ying L, Calomme M, Hu JP, Cimanga K, Poel BV, et al. , 1998 : Structure-activity relationship and classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers. J Nat Prod.;61:71-76.
Gunawan SG, 2007 : Farmakologi dan terapi. Edisi V. Jakarta: Balai Penerbit FKUI; h. 243-44.
Laksmitawati, D.R., Muflihah A , 2014 :Eksplorasi inhibitor xantin Oksidase dari beberapa tanaman dan Pengembangannya sebagai antihiperurisemia, Laporan Akhir Hibah Bersaing Dikti Tahun Pendanaan 2014.
Rachmawati IS dan Ciptati, 2011. Isolasi senyawa antioksidan dari daun sirih merah (Piper crocatum). SNIPS: 327-333.
Setiawan I, Suyono 2012 : Pengaruh pemberian teh kombucha terhadap kadar asam urat serum darah Rattus norvegicus, UNESA Journal of Chemistry.;1(1):40-44.
Umamaheswari M, Madeswaran A, Asokkumar K, Sivashanmugam AT, Subhadradevi T, Jagannath P, 2012 : Docking studies: search for possible phytoconstituents for the treatment of gout. IJBPR.3(1):6-11.
