Latar Belakang VAKSIN. Colony Forming Unit ( CFU) Metode Alternatif

(1)

(2)

Latar Belakang

VAKSIN PREVENTIF KUALITAS & STABILITAS JUMLAH BAKTERI HIDUP Colony Forming Unit ( CFU) 1. Waktu pengujian yang lama 2. Tergantung pada medium pertumbuhan >> waktu inkubasi hingga 5 pekan. Metode Alternatif Metode ATP-Bioluminesens Belum ada laporan Validasi metode

Pengembangan & Validasi metode ATP

(3)

Metode ATP-Bioluminesens



Reaksi Enzimatik ( Sistem

Luciferin-Luciferase) dengan ATP :

(4)

SAMPEL

Vaksin BCG SSI Danish strain 1331 1 vial >> 0.75mg BGC liofilisasi & 3.75mg Na.glutamat

Low Viability Sample

Suhu 37˚C selama 28 hari Intermediate Viability Sample Suhu 2-8˚C selama 12-18 bulan.

High Viability Sample

Suhu 2-8˚C selama 1-3 bulan.

(5)

2. Reagen :

• Medium Dubos (0.045% Tween & 0.5% Bovine

Albumin)

• Reagen ATP-SL ( rekonstitusi dengan 10 mL

aqua pro injectione)

• Dapar Tris-asetat 0.1 M (dengan 2 mM EDTA,

pH 7.75)

• ATP-Standar , 1 x 10

-5

M.

• Sauton SSI encer.

• Apyrase

Larutan Kerja

(6)

METODE ANALISIS

1. Penetapan ATP dalam Vaksin BCG

- Ekstraksi ATP, sampel tanpa inkubasi

- Ekstraksi ATP, sampel dengan pre-inkubasi 37˚C.

- Pengukuran ATP

2. Penetapan CFU

3. Korelasi antara ATP – CFU

4. Validasi metode dengan tahapan

Pre-inkubasi.

(7)

1. _{Penetapan ATP}

Ekstraksi ATP Tanpa Inkubasi Dengan Pre-inkubasi 24 jam, 37˚C Pengukuran ATP

1 vial Vaksin BCG + 400 µl sauton SSI dan 100 µl Apyrase. Didiamkan 10 menit.

Ekstraksi ATP (tiap vial 3 x 100 µl suspensi BCG) dengan Buffer Tris-Asetat dengan EDTA ( 3 x 500 µl ) yang sebelumnya dipanaskan pada suhu 98-99°C. Campuran BCG-Buffer dijaga pada suhu 98-99°C selama 6 menit, ekstrak lalu didinginkan pada

suhu kamar.

1 vial vaksin BCG + 1.0 ml Media pertumbuhan mikroba ( Medium Dubos dengan Tween dan Bovine Albumin ), Nitrogen dialirkan selama 10-15 menit, vial ditutup. Inkubasi 24

jam suhu 37˚C sebelum ATP diekstraksi. Prosedur ekstraksi ATP, mengikuti prosedur ekstraksi ATP tanpa inkubasi.

(8)

Pengukuran ATP

Ekstrak ATP ( 100 µg Suspensi BCG + 500 µl buffer) 100 µl reagen ATP Diukur dengan Luminometer 1251 Blanko (100 µl Sauton/Apyrase atau medium Dubos)

Suhu 25°C, signal 10 detik ( mV x 10 detik ) 10/20µl Larutan ATP Standar Konsentrasi standar 1.0-15 x 10-12 mol ATP Reagen ATP

Output RLU (Relative Light Unit) >> ng ATP

(9)

2

.

Penetapan CFU



8 vial BCG, direkonstitusi dengan Sauton

SSI hingga diperoleh konsentrasi 0.75mg

BCG/ml.



3 seri pengenceran diinokulasikan pada

Medium Lowenstein-Jansen, diinkubasi pada

suhu 37˚C selama 5 pekan dan kemudian

(10)

www.themegallery.com

3. KORELASI ATP -CFU

Tujuan :

Melihat hubungan viabilitas sampel lyophilised BCG dengan berbagai level

berbeda hasil pengukuran dengan metode ATP dan CFU

 Korelasi positif ( P < 0.01)  koefisien korelasi r = 0.53

 Untuk pengukuran dengan

metode ATP : overlapping antara viabilitas rendah dan tinggi

Sampel BCG tidak.di pre-inkubasi dalam media pertumbuhan sebelum pengukuran ATP. Samples (n = 43)

● : viabilitas rendah ▀ : viabilitas tinggi

(11)

3. KORELASI ATP -CFU

Sampel BCG di pre-inkubasi dalam media pertumbuhan selama 24 jam sebelum

pengukuran ATP. Samples (n = 43) ● : viabilitas rendah ▲ : viabilitas sedang ▀ : viabilitas tinggi  Korelasi positif ( P < 0.01)  koefisien korelasi r = 0.93

Metode pengukuran ATP dengan pre-inkubasi dalam media pertumbuhan

meningkatkan korelasi antara ATP-CFU secara signifikan

(12)

4. Validasi Metode dengan Tahapan Preinkubasi

1. Robustness

2. Linearitas dan Rentang

3. Akurasi

4. Presisi

(13)

Tujuan

Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode dengan

cara dibuat perubahan metode dengan

kondisi-kondisi tertentu, apakah berbagai faktor tersebut

berpengaruh terhadap respon yang dihasilkan.

Prosedur



Desain Faktorial

(

Software

statistik JMP 6.0)



Menggunakan 16 vial Vaksin BCG dengan

Intermediate Viability



Terdiri dari 8 faktor kondisi percobaan dengan

2 level

(14)

Desain Percobaan

Robustness

Faktor Level

A. Pre-Inkubasi

•Vial airing time before incubation •Incubation temperature •Incubation time •pH in Dubos medium 5 or 30 min 35 or 39 C 21 or 27 h pH 6.6 atau 7.0 B. Ekstraksi ATP

•Time to preheat extraction buffer •Extraction buffer temperature •Heat treatment time

•Covering cuvettes during extraction

10 or 20 min 97 or 100 C 5 or 10 min

(15)

Hasil Robustness

Untuk masing-masing faktor, metode menunjukkan

robust

di masing2 level percobaan

α =0.05 , tidak ada perbedaan yang signifikan pada

masing2 hasil pengukuran ATP di berbagai kondisi

percobaan

(16)

2. Linearitas dan Rentang



Linearitas

Kemampuan metode analisis untuk memperoleh hasil

uji yang proporsional (sepadan) terhadap konsentrasi

analit dalam sampel dan dalam rentang konsentrasi

yang digunakan.



Rentang

Menunjukkan nilai terendah dan tertinggi hasil

pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat dan

seksama.

(17)

Prosedur Linearitas

Linearitas

Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG Linearitas Standar

ATP

Dibuat Variasi

Konsentrasi Standar ATP dengan rentang 1.0-25 x10-12 _{mol ATP}

per kuvet

Total konsentrasi BCG (bakteri hidup dan mati) dalam sampel dibuat konstan dengan penambahan BCG yang telah dimatikan

dengan pemanasan dan hanya konsentrasi ekstrak ATP yang dibuat bervariasi.

(18)

Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG

www.themegallery.com 500µl Buffer Tris-EDTA total100 µl suspensi BCG

Untuk Vial Suspensi BCG dengan volume : 20 µl 40 µl 60 µl 80 µl Volume dibuat konstan dengan penambahan BCG

yang telah dimatikan dengan pemanasan ATP standar dengan rentang konsentrasi 1.0-15 x 10-12 mol ATP/kuvet untuk mengkonversi respon BCG-ATP ke dalam mol-ATP

(19)

Hasil Linearitas

1. Kurva Linearitas ATP

standar 1.0-25 x10

-12

_{mol ATP ->}

Koefisien Korelasi

r ≥ 0,99 (kurva tidak

ditampilkan)

2. Kurva Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG dengan viabilitas yang berbeda pada

konsentrasi BCG konstan -> Koefisien Korelasi r ≥ 0,99

(20)

Hasil Rentang



Kurva ATP standard dengan

rentang konsentrasi 1.0-15 x 10

-12

_{mol ATP menghasilkan respon}

dibawah konsentrasi standar

(pada vial dengan low viability

dengan volume terkecil ) dan

respon diatas konsentrasi

standar pada vial dengan high

viability dengan volume

terbesar.



Rentang pengukuran adalah tidak

kurang dari 1.0-15 x 10

-12

_mol

ATP untuk 100 µl suspensi BCG

atau setara dengan 10-150 x 10

-12

_{mol ATP per vial vaksin}

(21)

3. AKURASI



Tujuan

Untuk mengukur ketepatan atau kedekatan hasil

pengujian dengan hasil yang sebenarnya.



Prosedur

1. Menggunakan 15 sampel baru yang di pre-inkubasi

2. Hasil yang didapat kemudian dibandingkan dengan

data korelasi antara ATP dengan jumlah CFU

3. Dibuat kurva regresi linier dengan derajat

kepercayaan 95%.

4. Data hasil 15 sampel baru kemudian diplotkan

tehadap kurva korelasi yang telah ada.

(22)

Hasil Akurasi

(23)

(24)

Hasil Akurasi



Terdapat korelasi positif yang signifikan

dengan nilai P < 0.0001, r = 0.934



Perhitungan hubungan antara metode ATP

dan CFU : log (CFU) = -1.426 + 1.398 LOG

(ATP) atau CFU = 0.037 ATP

1.398

(25)

4 .Presisi



Definisi

Tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual

dengan rata-rata hasil pengujian berulang



Prosedur

1. Presisi dilakukan oleh 3 analis dalam 3 hari

2. Desain faktorial dilakukan untuk menguji

repeatability

dan

intermediate precision

dari sampel dengan

low viability

dan

high viability.

3. Repeatability

: pengujian dengan 2 sampel (2x8 vial), diukur

koefisien variasinya (CV) untuk

repeatability.

4. Intermediate precision

: Data dari desain percobaan dianalisa,

dihitung sesuai dengan perhitungan

intermediate precision.

(26)

Hasil Presisi

(27)

Hasil Presisi



Low Viability

1. Repeatability : 5.5%

2. Intermediate Precision : 15%



High Viability

1. Repeatability : 5.1%

2. Intermediate Precision : 9.0%

(28)

Parameter dan Hasil Validasi

Hasil Syarat Akurasi >70% Presisi -Repeatability -Intermediate Precision 5,1%-5,5% 9%-15% Cfu/plate 30-300 <15% 10-30 <25% <10 <35% Linearitas 99% r > 099 >95%