UJI DAYA ANTIBAKTERI PADA SEDIAAN HAND SANITIZER KITOSAN TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus
DAN Escherichia coli
Eko Kusumawati1), Supomo2) dan Libiyah2) 1)
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Mulawarman Samarinda
2)
Akademi Farmasi Samarinda ABSTRACT
This study aimed to compare the effevtiveness of antibacterialgel hand sanitizer of chitosan shrimp shells ini suppressing the growth of bacteria Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Antibacterial effectiveness was analyzed using a diffusion method.Data were analyzed statistically using One Way ANOVA. The results showed that hand sanitizer with chitosan concentration of 1% had a greater inhibitory against Staphylococcus aureus that is 2,49 mm and against Escherichia coli that is 0,705 mm, while the results of positive control (Dettol) of inhibition greater than formula 1,which is 6,31 mm for Staphylococcus aureus and 4,75 mm for Escherichia coli. The resulting inhibition of hand sanitizer formula shrimp shell chitosan weak category. Basedonthe results of this study concluded that chitosan concentration of 1% which is formulated in the form of hand sanitizer gel had weakinhibition against bacteria Staphylococcus aureus and Escherichia coli.
Keywords: antibacteri, chitosan, gel, hand sanitizer PENDAHULUAN
Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk menjaga kebersihan tangan adalah dengan menggunakan gel antiseptik tangan (hand sanitizer). Sebagai alternatif praktis menggantikan sabun dan air untuk mencuci tangan, gel antiseptik tangan diformulasikan sebagai pembersih tangan yang mudah dibawa serta dapat diperoleh dengan mudah. Dewasa ini penggunaan gel antiseptik tangan mendapat respon positif dari masyarakat, namun kebanyakan produk gel antiseptik tangan di pasaran berbahan dasar alkohol yang memiliki kekurangan dapat mengiritasi kulit dan membuat kulit kering bila digunakan berulang- ulang. Sebagai salah satu alternatif, kulit udang yang mengandung kitosan dapat dimanfaatkan sebagai antibakteri dalam sediaan hand sanitizer.
Nurainy et al. (2008) menyatakan bahwa terdapat aktivitas penghambatan kitosan dari kulit udang sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dengan diameter penghambatan tertinggi pada penambahan kitosan dengan konsentrasi 0,2% sebesar 20,27 mm/mg kitosan dan terendah dengan konsentrasi 0,8% sebesar 6,82 mm/mg kitosan, sementara untuk aktivitas penghambatan antibakteri Escherichia coli dengan diameter penghambatan tertinggi pada penambahan kitosan dengan konsentrasi 0,2% sebesar 31,53 mm/mg kitosan dan terendah pada penambahan kitosan dengan konsentrasi 0,8% sebesar 14,22 mm/mg kitosan.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui perbandingan efektivitas antibakteri gel hand sanitizer berbahan dasar kitosan dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
METODE PENELITIAN Persiapan Sampel dan Perlakuan
Sampel kitosan yang akan digunakan sebagai sediaan gel antiseptik tangan diperoleh dari CV. M&H Farm, selanjutnya diberi perlakuan sebagai berikut :
P1 = Kontrol (+) Dettol terhadap bakteri Staphylococcus aureus P2 = Formula 1 (Kitosan 1%)
terhadap bakteri Staphylococcus aureus
P3 = Kontrol negatif (Larutan DMSO 1%) terhadap bakteri Staphylococcus aureus
P4 = Kontrol (+) Dettol terhadap bakteri Escherichia coli
P5 = Formula 1 (Kitosan 1%) terhadap bakteri Escherichia coli P6 = Kontrol negatif (Larutan DMSO 1%) terhadap bakteri Escherichia coli
Pembuatan Media 1. Media Agar Miring
Bubuk NA merk Oxoid ditimbang sebanyak 2,8 gram, dimasukkan ke dalam labu erlenmayer ditambahkan aquadest 100 ml. Kemudian diletakkan diatas hotplate dan diaduk menggunakan magnetic stirrer sampai mendidih. Sebanyak 5 ml dituangkan masing-masing pada 5 tabung reaksi steril dan ditutup dengan aluminium foil. Media tersebut disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15
menit, kemudian dibiarkan pada suhu ruangan selama 1 malam sampai media memadat pada kemiringan 45o. Media agar miring digunakan untuk peremajaan bakteri.
2. Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Bubuk MHA ditimbang sebanyak 38 gram, dimasukkan ke dalam labu erlenmayer ditambahkan aquadest 1000 ml. Kemudian diletakan diatas hotplate dan diaduk menggunakan magnetic stirrer. Setelah mendidih, ditutup dengan kapas lalu dilapisi dengan aluminium foil. Selanjutnya disterilkan dalam autoklaf dengan tekanan 2 atm pada suhu 121°C selama 15 menit.
3. NaCl 0,9%
Sebanyak NaCl 0,9 gram ditimbang, kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass ditambahkan dengan aquadest sampai 100 ml, diaduk hingga homogen. Selanjutnya dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml. 4. Inokulasi Bakteri pada Media Agar
Miring
Bakteri uji diambil dengan jarum ose steril, lalu ditanamkan pada media agar miring dengan cara menggores. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. 5. Pembuatan Standar Kekeruhan
Larutan (Larutan Mc.Farland) Larutan H2SO40,36 N sebanyak 99,5
ml dicampurkan dengan larutan BaCl2.2H2O 1,175% sebanyak 0,5
ml dalam erlenmeyer. Kemudian dikocok sampai terbentuk larutan yang keruh. Kekeruhan ini dipakai sebagai standar kekeruhan suspensi bakteri uji.
6. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Bakteri uji yang telah diinokulasi diambil dengan kawat ose steril lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan NaCl 0,9% kemudian divortex hingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar kekeruhan larutan Mc. Farland. Perlakuan yang sama dilakukan pada setiap jenis bakteri uji.
Aktivitas Antibakteri
Media MHA dituang ke dalam 5 cawan petri masing-masing sebanyak 15 ml, dibiarkan hingga memadat. Tabung yang telah berisi suspensi bakteri uji diambil dan disterilkan pinggiran tabung reaksi di atas lampu bunsen. Setelah itu lidi kapas dicelupkan ke dalam tabung reaksi. Pinggiran cawan petri difiksasi di atas lampu bunsen. Lidi kapas tadi diswab ke dalam cawan petri hingga merata. Kemudian pinggiran cawan petri yang berisi kertas cakram difiksasi di atas lampu bunsen. Lalu dicelupkan pinset ke dalam alkohol 70%, setelah itu difiksasi di atas lampu bunsen kemudian diangin- anginkan. Kertas cakram diambil dengan pinset, lalu dicelupkan ke dalam gel hand sanitizer kitosan setelah itu ditanamkan kertas cakram ke dalam cawan petri dan dianggap sebagai ulangan pertama. Pengulangan ini dilakukan hingga 3 kali. Setelah selesai diberi label, lalu diinkubasi secara terbalik selama 24 jam dengan suhu 37oC.
Analisis Data
Data hasil penelitian berupa data kuantitatif. Data kuantitatif berupa daya
antibakteri yang terbentuk pada uji aktivitas anti bakteri. Data kuantitatif diuji dengan menggunakan metode ANOVA (jika data yang diperoleh berdistribusi normal) atau uji Friedman (jika data tidak berdistribusi normal). Sebelum diuji dengan menggunakan metode One Way ANOVA, terlebih dahulu dilakukan uji Shapiro-Wilkuntuk menentukan apakah data berdistribusi normal atau tidak. Selanjutnya, dilakukan uji lanjutan yaitu dengan uji Duncan untuk mengetahui perbedaan secara nyata pada perbedaan perlakuan dan hasil yang diperoleh. Data diolah dengan menggunakan program Microsoft Excel2010dan SPSS20.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini dilakukan uji antibakteri terhadap formula gel hand sanitizer kitosan dengan konsentrasi 1% dengan metode Kirby Bauer (kertas cakram). Sebagai pembanding digunakan kontrol positif (Dettol) dan kontrol negatif (larutan DMSO 1%). Hasil penelitian yang dilakukan dapat dilihat pada Tabel 1 berikut:
Tabel 1. Aktivitas antibakteri gel pembersih tangan berbahan dasar kitosan terhadap bakteriStaphylococcus aureusdan Escherichia coli
Perlakuan Rata-rata zona hambat (mm) Kriteria zona hambat (mm)
P1 4,75 < 5 (Lemah) P2 4,57 < 5 (Lemah) P3 0,00 Tidak ada P4 6,31 5-10 (Sedang) P5 2,49 < 5 (Lemah) P6 0,00 Tidak ada Keterangan:
P1 = Kontrol (+) Dettol terhadap bakteri Staphylococcus aureus P2 = Formula 1 (Kitosan 1%) terhadap bakteri Staphylococcus aureus
P3 = Kontrol negatif (Larutan DMSO 1%) terhadap bakteri Staphylococcus aureus P4 = Kontrol (+) Dettol terhadap bakteri Escherichia coli
P5 = Formula 1 (Kitosan 1%) terhadap bakteri Escherichia coli
Dari data yang diperoleh seperti pada Tabel 1 diketahui bahwa formula hand sanitizer memiliki daya hambat kategori lemah baik terhadap bakteri Staphylococcus aureus maupun Escherichia coli. Hasil daya hambat tersebut lebih kecil bila dibandingkan dengan kontrol positif (Dettol). Pada kontrol negatif (Lautan DMSO 1%) tidak ada daya hambat yang dihasilkan.
Pada penelitian ini digunakan metode cakram kertas. Metode ini digunakan karena memliki kelebihan; mudah dilakukan, tidak memerlukan peralatan khusus dan relatif murah. Sedangkan kelemahannya adalah ukuran zona bening yang terbentuk tergantung oleh kondisi inkubasi, inokulum, predifusi dan preinkubasi serta ketebalan medium. Apabila keempat faktor tersebut tidak sesuai maka hasil dari metode cakram kertas relatif sulit untuk ditentukan. Selain itu, metode cakram kertas ini tidak dapat diaplikasikan pada mikroorganisme yang pertumbuhannya lambat dan mikroorganisme yang bersifat anaerob obligat (Jawetz et al., 2005).
Bahan aktif yang digunakan dalam formula gel hand sanitizer ini adalah kitosan. Kitosan yang merupakan polimer kationik yang bersifat nontoksik, dapat mengalami biodegradasi dan bersifat biokompatibel. Kitosan merupakan senyawa polikationik alam yang unik memiliki aktivitas antibakteri (Liu et al., 2006). Berdasarkan sifat antibakteri kitosan dari penelitian sebelumnya maka digunakan konsentrasi 1% pada setiap formula. Sebagai kontrol positif digunakan Dettol dan kontrol negatif digunakan larutan DMSO 1%.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada formula hand sanitizer dengan konsentrasi kitosan 1% memiliki daya hambat terhadap bakteri Staphylococcus aureus yaitu sebesar
2,49 mm. Hal ini menunjukkan bahwa daya hambat hand sanitizer kitosan pada bakteri Staphylococcus aureus lemah. Darmanto et al. (2010) menyatakan bahwa mekanisme aktivitas antimikroba dari kitosan terhadap Staphylococcus aureus yaitu kitosan akan membentuk membran polimer pada permukaan sel Staphylococcus aureus sehingga akan menghambat nutrisi masuk kedalam sel. Hal ini disebabkan oleh adanya gugus amina pada kitosan yang mempunyai muatan kationik yang dapat mengikat sumber makan bagi bakteri tersebut seperti alginat, pektin, protein, dan polielektrolit anorganik seperti polifosfat. Aktivitas antibakteri kitosan terhadap Staphylococcus aureus meningkat dengan peningkatan berat molekul kitosan. Selain itu, aktivitas antibakteri kitosan dipengaruhi oleh derajat deasetilasi, konsentrasi dalam larutan, dan pH media. Pada penelitian ini data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95% sehingga dapat diketahui bahwa hand sanitizer kitosan 1% tidak menunjukkan daya hambat yang signifikan pada bakteri Staphylococcus aureus. Hal ini dimungkinkan terjadi karena kurang homogennya kitosan dengan basis gel sehingga efektivitasnya pun ikut berkurang.
Staphylococcus aureus merupakan jenis bakteri Gram positif. Menurut Pelczar dan Chan (1998), struktur dinding bakteri Gram positif relatif sederhana sehingga memudahkan senyawa antibakteri menemukan sasaran untuk bekerja. Kitosan dapat berikatan dengan lipid yang ada pada permukaan dinding sel bakteri. Menurut Yusman (2006), bakteri Gram positif memiliki kandungan peptidoglikan yang tinggi dibandingkan dengan bakteri Gram negatif. Kandungan
peptidoglikan yang tinggi akan mengakibatkan tingginya kandungan lipid. Menurut Widodo et al. (2006), kitosan bersifat polikationik dapat mengikat lipid dan logam berat. Rusaknya lipid pada dinding sel bakteri akan mengakibatkan rusaknya pertahanan sel. Bakteri Gram positif memiliki asam teikoat, polimer yang bersifat asam yang mengandung ribitol, fosfat, atau gliserol fosfat. Menurut Yusman (2006), asam teikoat yang bersifat asam dan mengandung ulangan rantai gliserol fosfat dan ribotol fosfat pada bakteri Gram positif menyebabkan bakteri Gram positif bermuatan negatif. Muatan negatif pada dinding sel bakteri akan berikatan dengan muatan positif dari kitosan membentuk senyawa yang tidak bermuatan. Selain asam teikoat akan berikatan dengan kitosan yang bersifat basa.
Berdasarkan Tabel 1 dapat diketahui bahwa pada formula hand sanitizer dengan konsentrasi kitosan 1% memiliki daya hambat yang lemah pada bakteri Escherichia coli yaitu sebesar 4,57 mm. Kemungkinan besar sasaran agen antibakteri kitosan adalah dinding sel, membran sitoplasma dan mengganggu sintesis DNA sel bakteri. Bahan antibakteri khususnya dengan gugus ammonium kuaterner berinteraksi dengan dinding sel yang mengandung protein, lipopolisakarida atau peptidoglikan, serta asam teikoat yang mengandung alkohol dan fosfat. Escherichia coli merupakan bakteri. Gram negatif yang memiliki dinding sel yang tersusun dari peptidoglikan yang merupakan lipopolisakarida dan asam teikoat yang terdiri dari alkohol dan fosfat. Membran sitoplasma mengandung protein dan phospolipida. Adanya phospat, protein, alkohol, asam teikoat dan phospolipid menyebabkan bakteri memiliki gugus hidrofilik yang cenderung bermuatan negatif dan lebih
polar, walaupun di sisi lain memiliki gugus hidrofobik. Gugus hidrofilik yang cenderung bermuatan negatif ini kemudian berinteraksi dengan kitosan. Maka dengan adanya kitosan maka dapat mengganggu metabolisme bakteri dengan melapisi permukaan sel bakteri, mencegah masuknya nutrien ke dalam sel, berikatan dengan DNA kemudian menghambat RNA dan sintesis protein. Menurut Helander et al. (2001) mekanisme aktivitas antibakteri kitosan bisa dijelaskan sebagai berikut muatan positif NH3+ glukosamin kitosan berinteraksi dengan muatan negatif (lipopolisakarida, protein) membran sel mikroba sehingga menyebabkan kerusakan membran luar sel dan keluarnya konstituen intraselullar bakteri.
Hasil daya hambat terhadap bakteri pada formula hand sanitizer dengan konsentrasi kitosan 1% menunjukkan bahwa daya hambat dari hand sanitizer tersebut tergolong lemah baik terhadap bakteri Staphylococcus aureus maupun Escherichia coli yaitu sebesar 2,49 mm dan 4,57 mm. Hal ini dikarenakan hand sanitizer tersebut kental, sehingga mempengaruhi pada saat perendaman kertas cakram. Akibat zat aktif kitosan tidak terserap sempurna pada saat perendaman sehingga mempengaruhi hasil pengukuran daya hambat yang diperoleh. Hasil ini juga dimungkinkan dapat dipengaruhi oleh ketidakcocokkan metode yang dipilih dan digunakan sehingga hasil yang diperoleh tidak maksimal. Metode ini dipengaruhi banyak faktor di samping interaksi antara obat dan bakteri (misalnya sifat perbenihan, daya difusi, ukuran molekul dan stabilitas obat). Kelemahan metode difusi adalah metode ini tidak dapat menentukan apakah suatu obat bersifat bakterisid dan bakteriostatik (Jawetz et al., 1996).
Daya hambat yang dihasilkan dari formula hand sanitizer menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap bakteri Staphylococcus aureus bila dibandingkan dengan kontrol positif (Dettol) begitu pula terhadap kontrol negatif (Larutan DMSO 1%). Hasil tersebut berbeda dengan daya hambat hand sanitizer terhadap bakteri Escherichia coli. Daya hambat yang dihasilkan tidak memiliki perbedaan yang signifikan dengan kontrol positif namun memilki perbedaan yang signifikan dengan kontrol negatif. Hal ini sesuai hasil uji One WayANOVA dengan nilai p > 0,05.
DMSO 1% sebagai kontrol negatif tidak menunjukkan adanya zona hambat pada bakteri Gram positif Staphylococcus aureus dan bakteri Gram negatif Escherichia coli. Hal ini mengindikasikan bahwa kontrol yang digunakan tidak berpengaruh pada uji antibakteri. Sedangkan Dettol sebagai kontrol positif berpengaruh pada bakteri Gram positif Staphylococcus aureus dan bakteri Gram negatif Escherichia coli.
Dettol sebagai kontrol positif dengan zat aktif alkohol 60% berfungsi sebagai antiseptik. Mekanisme kerjanya mengganggu membran sel bakteri yang akan menurunkan kemampuan membran sel untuk memproduksi ATP sebagai sumber energi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa daya hambat Dettol terhadap bakteri Staphylococcus aureus sebesar 6,31 mm dan Escherichia coli sebesar 4,75 mm. Hal ini berarti Escherichia coli lebih resisten terhadap zat aktif Dettol, yang ditunjukkan dengan daya hambat yang lebih kecil.
Terbentuknya zona hambat, membuktikan bahwa kandungan senyawa dalam larutan kitosan mampu berfungsi sebagai zat penghambat pertumbuhan. Hal ini didukung karena kitosan mengandung gugus amino bebas
yang bermuatan positif sehingga dapat berikatan dengan senyawa lain yang mempunyai muatan negatif. Sebagai kation, kitosan mempunyai potensi untuk mengikat banyak komponen, seperti protein, pektin, alginat, dan polielektrolit anorganik. Muatan positif dari gugus NH3+ pada kitosan dapat berinteraksi dengan muatan negatif pada permukaan sel bakteri, yaitu asam teikoat pada bakteri Gram positif dan lipopolisakarida pada bakteri Gram negatif. Interaksi ini diperkirakan akan
mengganggu pembentukan
peptidoglikan sehingga sel tidak mempunyai selubung yang kokoh dan mudah mengalami lisis sehingga aktivitas metabolisme akan terhambat dan pada akhirnya mengalami kematian (Sarjono et al, 2008).
KESIMPULAN
Gel hand sanitizer kitosan memiliki daya hambat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat. Zona hambat yang terbentuk dari gel hand sanitizer kitosan terhadap bakteri Staphylococcus aureus sebesar 2,49 mm sedangkan terhadap bakteri Escherichia coli sebesar 4,57 mm. Daya hambat yang terbentuk termasuk dalam kategori lemah.
DAFTAR PUSTAKA
Darmanto, M. L. Atmaja, dan M. Nadjib. 2010. Studi Analisis Antibakteri dari Film Gelatin- Kitosan Menggunakan Staphylococcus aureus. Skripsi. Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Sepuluh November.
Helander, I.M., E.L. Numiaho, R. Ahvenainen, J. Rohoades, and S. Roller. 2001. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of Gram negative bacteria. International Journal of Food Microbiol. 71: 235-244. Jawetz, E., J.L. Melnick., E.A .
Adelberg., G.F. Brooks., J.S . Butel., dan L.N. Ornston. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke -20 (Alih bahasa : Nugroho & R.F.Maulany). Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. hal. 211,213,215.
Jawetz, et al,. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke 23. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran ECG. Liu, N., X.G. Chen, H.J. Park, C.G. Liu,
C.S. Liu, X.H. Meng, and L.J. Yu. 2006. Effect of MW and Concentration of Chitosan on Antibacterial Activity of Escherichia Coli, Carbohydr. Polym.Jumal. 64: 60 – 65.
Nurainy F., S. Rizal, dan Yudiantoro. 2008. Pengaruh Konsentrasi Kitosan terhadap Aktivitas Antibakteri dengan Metode Difusi Agar Sumur. Jurnal. Fakultas
Pertanian Universitas Lampung. Lampung.
Pelczar, M.J., dan E.C.S Chan. 1998.
Mikrobiologi Dasar.
Diterjemahkan oleh Ratna Sri Hadioetomo et al. Universitas Indonesia Press. Jakarta.
Sarjono PR, N.A. Mulyani, dan N. Wulandari. 2008. Uji Antibakteri Kitosan Dari Kulit Udang Windu (Penaeus monodon) Dengan Metode Difusi Cakram Kertas. Proceeding Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia.(UNS-UNDIP-UNNES). Widodo, A., Marida, dan A. Prasetyo.
2006. Potensi Kitosan dari Limbah Udang sebagai Koagulan Logam Berat Limbah Cair Industri Tekstil. Skripsi. Jurusan Teknik Kima Institut Sepuluh November (ITS).
Yusman, D.A. 2006. Hubungan Antara Aktivitas Antibakteri Kitosan dan Ciri Permukaan Dinding Sel Bakteri. Jurnal Penelitian IPB. Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB. Bogor.
