Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidang //mu Hayaf
PENGARUW BERBAGAI INDUKTOR TERIZADAB EAJU DEGltaADASl OLEN Corynebacterium UBT 9
EFFECT OF VARIOUS mDUCTORS ON ACETONITRllLE DEGRADATION M T E BY Goyp1ebactehum UBT 9
Bambang Sunarko
iologi, Puslitbang Biologi, LIP1
ABSTRACT
Various nitrile substances were selected to find out the best inductor for biosynthesis of enzyme nitrile hydratase of Co~y~lebncferizcm UBT 9. This work showed that Corynebacierizci~~ UBT 9 could grow on eight of examined sixteen nitrile substances, as inductors. The bacterial colony attained the highest cell biomass, as it grew on acetonitrile, allylcyanide, butyronitrile, and propionitrile. However, the highest nitrile-fnydratase activity was shown by Cloynebacteriunz
UI3T grown on 2-pentenitrile. The acetonitrile degradation rate by 2-pentenitrile induced cells was five times higher than those by acetonitrile induced cells. The needed cell biomass for the total 10 ( 5 (vlv) acetonitrile degadation by 2-pentenitrile induced cells was 25 % smaller than those by acetonitrile induced cells.
Keywords: nitriles, nitrile-hydratase, inductor, degradation
Dalam penelitian ini diperlihatkan, bahwa Cc1yrebncter7'm UBT 9 mampu tumbuh pada delapm dari enambelas senyawa nitril yang diuji sebagai indukqor. Biomassa tertinggl diperoleh bila
Col-yr2ebacter.zlim UBT 9 ditumbuhkan pada asetonitril, allilsianida, butironitril, dan propionitd. Namun aktivitas enzirn nitril-hidratase tertinggi diperoleh apabila sel ditumbuhkan pada 2- pentenitril. Dapat diperlihatkan pula, bahwa laju degradasi asetonitril oleh sel yang diinduksi 2- pentenitril berlangsung sekitar lima kali lebih cepat dibandingkan dengan laju degradasi oleh sel yang diinduksi asetonitril. Selain itu, untuk mendegradasi 10 (v/v) asetonitril secara total dengan menggunakan sel yang diinduksi oleh 2-pentenitril diperlukan biomassa yang Iebih kecil, yaitu hanya 25 % dari biomassa yang diinduksi oleh asetonitril.
Kata kunci: senyawa nitril, nitril-hidratase, induktor, degradasi
Asetonitril (CH3CN) adalah senyawa toksik, tetapi secara komersial mempp~lyai arti pentins. Senyawa tersebut banyak diproduksi dan dimanfaatkan ole11 industri kimia dan f m a s i , terutama sebagai pelarut dan pengekstrak. Asetonitril juga diguilakan dalam i1ldust1-i plastik,
-
Pusat Antar Universitas I l m u Wayat I P BProsidina Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidana //mu Havat
fotografi, pewarna tekstil, pewangi dan dalam produksi senyawa-senyawa organik yang mengandung nitrogen seperti arnida, amina, mono- dan dinitril. Disamping itu, asetonitril juga mempakan produk sarnping dari berbagai proses produksi, misalnya produksi bensol kasar dari ter batubara, dan produksi akrilonitril dari propilen.
Toksisitas asetonitril temtma disebabkan oleh produk urainya, a s m sianida (IICN) yang sulit temrai dan sangat berbahaya bagi manusia. Asetonitril juga m d a h terserap kulit, sehingga dapat mengakibatkan ganggum pada kulit dan selaput pelindung Iainnya (Hagedom & Gelbke,
1979). Untuk mengantisipasi masalah pencemaran Iingkungan akibat peningkatan produksi dan penggunaan asetonitril dalam industri, maka perlu dikernbangkm suatu sistem biologls yang dapat menghidrolisis senyawa tersebut menjadi senyawa-senyawa BOB-toksik.
Corynebacteui2m gTBT 9 dilaporkan marnpu tumbuh pada asetonitril dan memanfaatkmya sebagai surnber energi, karbon dan nitrogen untuk tumbuhnya (Sunarko, 1995). Telah diketahui, bahwa nitril-hiduafase (E.C. 4.3.2.84) dan amidase ( E.C. 3.5.1.4) adalah enzirn yang terlibat d a l m hidrolisis asetonitril menjadi asam asetat dan amonia pada berbagal jasad renik Pagasawa et al., 1 987; Wyatt & Linton, 1988, Sander, 199 1 ; Sunarko, 1995). N a m n , aktivitas kedua enzim tersebut pada Co~~zebacteri?mf UBT 9 terbukti masih relatif rendah (Sunarko & Meyer, 1989; Sunarko, 1995; Sunarko, 1996). Oleh karena itu, untuk dapat memanfaatkan jasad renik tersebut sebagai biokatalisator yang efektif untuk mendetoksifikasi air buangan yang mengandung asetonitril diperlukm upaya untuk nleningkatkm aktivitas kedua enzim tersebut. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji pengaruh berbagai induktor (berbagai senyawa nitril) terhadap aktivitas enzim nitril hidratase dari Corylehncterizr~n UBT 9 dan terhadap proses degradasi asetonitril oleh isolat yang ditumbuhkan pada induktor terbaik.
BAILaN DAN METODE
Mikrot)rgan1'sm~ Coryrlebncferiml UBT 9 diperoleh dari koleksi biak Lehrstuhl h e r Mikrobiologie, Universitaet Bayreuth, Jerman.
Medium tgmbult &buymebacterium UBT 9. Komposisi medium mineral untuk menurnbuhkan Cozyt~ebacterirml UBT 9 adalah sebagai berikut : Na211P04.2&0 (0,4475 g), KN2P04 (0,l g), MgS04.7H20 (0,1 g), CaCl2.2H20 (0,Ol g), FeS04.7W20 (0,001 g), ekstrak khamir (0,01 g), yang dilamtkan dalam H20 dest.(1000 ml) (Meyer & Sehlegel 1983) dan
Pusat Aniar Universitas I l m u Wayat IPB 172
Pros~ding Seminar Hasil-Hasil Peneljfjan Bjdang ]/mu Hayaf
I
ditmbah dengan 1 rnl mikroelemen. Sedangkan, komposisi mikroelemen tersebut adalah sebagai berikut: ZnS04.7H20 (0,1 g), R/InC12.4H20 (0,03 g), HjBOj (0,3 g), GoC12.6H2O (0,2 g), GuS04.5W20 (0,015 g), NiCI2.6H20 (0,02 g), Na2M04.2H20 (0,9 g), Na2Se03 (0,02 g) dalam H20 dest. ( 1000 ml) (Pfennig 1974). Sebagai sumber energi, karbon, dan nitrogen d i p n a k m asetonitril dan senyawa-senyawa nitril lainnya dengan konsentrasi 10 mNI.
Prolhuksi biomassa Coqaebacterz'um UBT 8. Biomassa Cov~ebacferiun? UBT 9 diproduksi dengan cam menumbuhkan isolat tersebut pada asetonitd dan senyawa-senyawa nitril lainnya sebagai satu-satunya sumber energi, karbon, dan nitrogen daIam fernentor (3 1) yang berisi 2 1 medium mmbuh dengan aerasi dan pengadukan dengan kecepatan 100 rpm. Aerasi diberikan secara tetap dengan laju 0,1 Vmin. Ihntibuih @olipropilen glikol50 % v/v) ditambahkan secara manual blla diperlukan. Sebagai inohIan digunakan C~iyr~ebacteriun? UBT 9 yang tumbuh pada fase eksponensial. Sel dipanen pada fase eksponensial dengan sentrihs (6.000 rpm) selma 1 jam. Sebelurn digunakan untuk analisis; sel-sel tersebut disimpm pada suhu -4 "C.
Pengukgmn pemmbuhan CoynebaefePr'um UBT 3. Pertumbuhan Couyrlebacteriun?
UE?T 9 selama proses fermentasi ditentukan dengm menggunakm satuan k e q a t a n optis (optic& deizsitylOD) pada panjang gelompang 436 m.
Peagukurm koatsemtrmr' asetmitrr'l dan prcPduk-prod~k deg~adasi~yur. Konsentrasi asesetonitd, asetamida, dm asam asetat diukur dengan menggunakan kromatogafi gas (Packard Model 430) yang ddengkapi dengan .flanle ioniznfiorl defecfor dan kolom berisi Porapak Q. Suhu oven adalah 200°C, suhu injektor dan detektor masing-masing 240°C. Sebagai gas pembawa adalah N2 dan sebagai gas detektor Hz dan masing-masing dipompakan dengan laju sebesar 1 1 ml/min. Untuk analisis, sebmyak 2 pl sampel diinjeksikm pada kolorn kromatografi. Konsentrasi masing-masing senyawa dihitung berdasarkan h w a standar.
Pemgukuraat aktir)i$gs e ~ z i m niM-hidrurtrese sel Co~meburcterk'i~m dlBT 9. Aktivitas enzim nitril-hidratase ditentukan dengan menguhr penurunan konsentrasi asetonitril dan kenaikan konsentrasi asetamida, asam asetat dan ammonium sebagai produk hidrolisis asetonitril. Substrat yang digunakan dalam pengujjian aktivitas ini adalah 100 mn/I asetonitril yang dilarutkan dalam 50 nib9 KK2PB4-NaOH, pH 7,2. Suspensi sel (0,1 ml) ditambahkan ke dalam substrat (0,9 ml) pada tabung reaksi dan diinkubasi selarna 30 menit pada suhu 30°C. Dalam selang wakcu 5 menit, 0,1 ml sampel diambil, kemudian dipusing dengan sentrihs (kecepatan 5000 rpm) selama 10 menit. Supematannya diinjeksikan pada kolom loomatogafi afiga Saatu unit aktivitas enzi~n (U)
Pusat Antar Universita~ Ilrnu Hayat I P B 1 73
Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelifian Bidang llmu Hayat
Tabel 1. Pengamh berbagai senyawa nitril terhadap pertumbuhan dan aktivitas nitril-hidratase sel Covynebacterium UBT 9
a) g sel bobot kering per liter medium turnbuh b) pmoI asetonitril per min. per mg sel bobot kering
6) tidak tumbuh
Selain itu Gambar 1A dan 2Ajuga memperlihatkan, bahwa waktu yang diperlukm untuk Substrat
Asetonitril Akrilonitril
mendegradasi asetonitril secara total dengan m e n g ~ n a k a n sel yang diinduksi dengan 2-pentenitd lebih cepat dlbandingkan dengan menggurrakan asetonitril. Dengan menggunakan sel yang diinduksi dengan 2-pentenitril, keselumhan asetonitril (10 % d v ) sudah terdegradasi hanya dalarn waktu 8 - 10 jam massa inkubasi, sedangkan dengan rnenggunakan sel yang diinduksi dengan asetonitril diperlukm waktu mtara 16-20 jam. Dengan dernikian, penggunaan sel yang diinduksi dengan 2-pentenitril dapat menghemat waktu proses degradasi sekitar 8
-
10 jam.Aktivitas Nitril-Kidratase (pmol.min-'. mg-') 0,92 - c/ _cl - 0,10 - cl -
-Seperti juga diperllhatkan pada Garnbar 1 A dan 2 A, secara keselumhan, laju degradasi asetonitril tertinggl terJadi pada dua jam pertama nlasa inkubasi, dan setelah itu itu Iaju degradasinya menumn secara drastis. Narnpahya, stabilitas enzirn sel yang diinduksi oleh 2- pentenitril tidak Iebih baik daripada sel yang diinduksi dengan asetonitril. Berdasarkan
% 2 1 cl P - c) 2
-
c) Biomassa selPusat Antar Universitas I l m u I-layat I P B 175
Bogor, 16 September 1999
-
cI C) 17 12 75 C)-
c)-
100 6 16 2 c j-
32 , (~'1)"' 0,40 -0)-
-Adiponitril - c) ' c/ P Bemonitril - c) %I 100-
c) Milsianida Allil-isothiosianat Benzilsia~da Butironitril Iso-butironitril Gotonitril Etil-isothiosianat Lauronitril 2-Pentenitril Pirnelonitril Propionitril SuberonitriI m-tolu~tril Valeronitril 0,40-
c/-
c) 0,34 0,04 0,14-
c)-
C) 0,17 0,20 0,39 100-
c)-
C) 8 5 9 3 5 C/ - C/ - 43 50 98 cl 0,75 0,52 3,30-
c;r C/-
4,40 0,26 0,72 0,10 cl - 1,41 0,201
50-
cl 0,39 C, I-
98Tingkat Degradasi (%) - * \ , P , r n O
0 0 0 0 0 0
Laju degradasi (rnmol/rng.jam)
? 0
0 ? N GI P
.~yruolas-e u-e'a'uap ~ s y n p u ~ ~ p SUVA las u~sun88uad u~'a'rrap u-eySu!pu-eqrp . rley . 5 ‘ ~ Jlelgas Iyruo4as-e ~ s c p e d a p n[q u~y~eySufuaw ~edlep ~pl~ualuad ue'a'uap Isynpurrp 'a'uelZ ps-las u~sun88uad 'u-eni[!wap u-e'a'rraa ' ( 3 2 ~ ~ q u r e ; 3 ) w ~ ~ ' a ' w / [ p ~ r u o ~ a s e lo ~ ~ ' 0 - t nveA 'vss~worq las 'a'w 02- %I 51 u-eyzqw-euad u-e8uap ~p-eQal r88urpa~ . .
p3molas"e . . r s ~ p e d a p nCe~ 'p~!ualuad u-e8uap isynpuIrp SueA p s m8uap m@uepas .(3 1 reqmg)
w ~ ~ ~ / I ~ J ~ o ~ ~ s B ~ o w w ~PO'O maqas W!EA '8uvay ~oqoq jas 8w 001 wqeqwauad u-e%uap . r p ~ h ~ a l .
; Prosiding Seminar Hasii-Hasil Peneiifian Bidang //mu Hayat
.. ..
..
.. .. .. ...-. 0 4 a t a n , o
Dalarn penelitian ini dapat diperlihatkan, bahvva Coy~~ebacteritlm UBT 9 rnampu tumbuh pada delapan dari enambelas senyawa nitril ymg diuji. Perolehm biomassa teeing@ diperlihatkan, bila Cory1.7ebncterilrm
IWT
9 ditumbuhkan pada asetonitril, allilsianida, butironitrii, danPusat Antar Universitas I l m u k y a t I P B 1 77
Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidang llmu Hayat
propionitril. Namun akivitas enzim nitril-hidratase tertinggi diperoleh dari sel yang ditumbuhkan pada 2-pentenitril sebagai induktor. Dapat diperlihatkan pula, bahwa laju degradasi asetonitril oleh sel yang diinduksi 2-pentenitd berlangsung sekitar l i a kali lebih cepat dibandingkm dengan Iaju degradasi oleh sel yang diinduksi asetonitril. Selain itu, untuk mendegradasi 10 (vlv) asetonitril secara total dengan menggunakan sel yang diinduksi dengan 2-pentenitril diperlukan biomassa lebih kecil, yaitu hanya 25 % dari biomassa sel yang diinduksi oleh asetonitril, dan proses degradasinya berlangsung dua kali lebih cepat.
Hagedorn, F & H. P. Gelbke. 1979. Aliphatische Nitrile. Dalm: Bartolomd, E., E. Biekert, H. Hellmam, H. Ley, W. M. Weigert, E. Weise (Eds.), Ullmms EnzyMopadie der technischen Chernie, Verlag Chemie, Weinheim, Band 17,323- 338
Meyer, 0. & H. 6. Schlegel. 1983. Biology of aerobic carbon monoxide oxidizing bacteria. Ann. Rev. Mcrobiol., 37, 277-3 10
Nagasawa, T., H. Nanaba, K. Ryuno, K. Takeuchi, H. Uamada. 1987. Nitrile hydratase of Pseudontofiras chlororaphis B23. Eur. J. Biochem., 162, 13 05- 13 12
Pfennig, N. 1974. Rhodopsezcdomoilas globiformis sp. n., a new species of the Rhodosspirill~ceae. k c h . Mhobiol., 100, 197-206
Sander, A. 1991. Charakerisiemng Taxonomisch Diverser Nitril-Abbauender Bakterien und Untersuchung der Am Nitrilabbau Beteilegten Enzyme. Doktcrrarbeit, Universitat Bayreuth. Jerman.
Sanarko, B. & (9. Meyer. 1989. -4 Microbial System for the DetoGfication of Acetonitrile in HPLC-Waste. p. 859-862. IF?: Behren, D. and A. J. Driesel (Eds.) Dechema BiotechnoIogy Conf , 3 . Verlag Chernie, 'bVeinheim.
Sunarko, B. 1995. Mkrobieller Abbau von Acetonitril und Vinylacetat, und Charakterisiemng von Vinylacetatesterase. p. 174. Dokforarbeit. Universitaet Bayreuth.
Sunarko, B. 1996. Kemampuan Berbagai Islat Bakteri Dalam Mendegradasi Asetonitril. J. Mikr-obiol. Dopika, 1 : 1 3- 1 9.
Wyatt, J. M., E. A. Linton. 1988. The industrial potensial of microbial nitrile biochemistry. Dalam: Mehnert, J., L. Brimer (eds.), Cyanide Compounds in Biology, John Wiley & Sons, Chichester, 32-42
Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat IPB 1 78 Bogor, 16 September 1999
