II. MATERI DAN METODE PENELITIAN
1. Materi Penelitian, Lokasi dan Waktu Penelitian 1.1. Materi Penelitian
1.1.1. Alat
Alat yang digunakan adalah akuarium berukuran 40 X 60 X 60 cm3 dan ketinggian air adalah 40 cm, aerator, timbangan dengan ketelitian 0,1 g, ember, seser kain kassa, baki, alat bedah, homogeniser listrik, sentrifuse, spektrofotometer, tabung reaksi, tabung eppendorf, rak tabung, refrigerator, inkubator, pipet tetes, micro pipette dan pipette tip.
1.1.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V.) diperoleh dari Desa Beji kecamatan Kedung Banteng kabupaten Banyumas, dengan kisaran berat 5-10 g, 11-25 g dan 35-50 g dan dengan kisaran panjang 9-10 cm, 11-12 cm dan 13-16 cm. pellet dengan kandungan protein 25%, larutan kasein 1% dalam air, akuades, buffer Glisin HCl (pH 2-3), buffer Na₂HPO₄ buffer (pH 8,0 – 9,0), 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7,2-8,0), larutan protein standar (0,05 mg/ml – 1,0 mg/ml kasein), pereaksi A (2 % Na2CO₃ dalam 0,1 M NaOH), pereaksi B (0,5 % CuSO₄.5H₂O dalam 1 % Na-K tartat), pereaksi C (campuran 50 ml pereaksi A dengan 1 ml pereaksi B), pereaksi D (larutan 1 N pereaksi Folon Ciocalteu), Larutan 0,1 M Glycine-HCl (pH 2,0 - 3,0), larutan 0,1 M Tris-HCl (pH 6,5–7,5), larutan 0,05 M Na₂HPO₄ buffer (pH 8,0 – 9,0), larutan 1 % (w/v) kasein, larutan 8 % (w/v)
trichloroacetic acid (TCA), larutan tyrosine standard (10 μg/ml – 250 μg/ml), larutan pati 1% dalam 20 mM natrium fosfat buffer pH 6,9, mengandung 6,0 mM NaCl sebagai substrat, sampel enzim (0,5 ml) dan 0,5ml dinitrosalicylic acid (DNS).
1.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian telah dilakukan di laboratorium Fisiologi Hewan Fakultas Biologi Unsoed. Uji aktivitas protease dan amilase akan dilakukan di laboratorium Riset Unsoed. Penelitian telah dilaksanakan selama enam bulan, dimulai pada bulan Januari sampai Juni 2013.
2. Metode Penelitian 2.1. Teknik Pengambilan Sampel
Metode yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode survei dengan pengambilan sampel dilakukan secara purposive random sampling yaitu mengambil sampel dengan ukuran tertentu yaitu besar, sedang dan kecil masing-masing 10 ekor, pengelompokan ikan ke dalam kisaran berat sebagai berikut berat 5-10 g, 11-25 g dan 35-50 g dan dengan kisaran panjang 9-10 cm, 11-12 cm dan 13-16 cm. Ikan dimasukkan ke dalam akuarium masing-masing 5 ekor, lalu diisolasi organ pencernaannya kemudian diambil hepatopankreas dan intestine (semua bagian).
2.2. Variabel yang diamati
Variabel yang digunakan adalah variabel bebas dan tergantung. Variable bebasnya adalah hepatopankreas dan intestine sedangkan variabel tergantungnya adalah aktivitas protease dan amilase. Parameter aktivitas protease dan amilase yang diukur berturut-turut adalah banyaknya mikro
gram tirosin per menit (protease) dan banyaknya mikro gram maltose per menit (amilase).
2.3. Cara kerja
Cara Kerja yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 2.3.1. Persiapan Akuarium
Akuarium yang digunakan dalam penelitian adalah akuarium fiber berukuran 40 x 60 x 60 cm³ yang diisi air tawar sebanyak ¾ akuarium dan diaerasi.
2.3.2. Pengadaan Ikan Uji
Ikan uji diperoleh dari Desa Beji kecamatan Kedung Banteng kabupaten Banyumas, dengan bobot awal sebesar 5-10 g, 11-25 g dan 35-50 g dan dengan kisaran panjang 9-10 cm, 11-12 cm dan 13-16 cm. 2.3.2. Penebaran Ikan Uji
Ikan Nilem (O. hasselti C.V.) dimasukkan ke dalam akuarium dengan padat penebaran sebanyak 5 ekor tiap akuarium yang terlebih dahulu diukur bobot dan panjangnya.
2.3.3. Aklimasi Ikan Uji
Ikan Nilem (O. hasselti C.V.) terlebih dahulu diaklimasi selama dua minggu di Laboratorium Fisiologi Hewan untuk penyesuaian terhadap kondisi laboratorium dan kualitas pakan uji. Selama aklimasi ikan Nilem diberi pakan buatan (pelet) dengan kandungan protein 25% dan dilakukan pengaturan media pemeliharaan untuk mendukung kebutuhan hidup ikan. Ikan Nilem diberi pakan sebesar 5% dari berat biomasa ikan dan diberikan sebanyak dua kali yaitu pada pagi (07.00
– 08.00 wib) dan sore hari (15.00 – 16.00 wib). Pengambilan sisa pakan diambil dengan cara penyiponan.
Gambar 2.1. Akuarium ikan uji 2.3.4. Pengukuran panjang dan bobot tubuh ikan
Pengukuran panjang tubuh ikan dilakukan menggunakan jangka sorong. Ikan diukur panjang tubuhnya dari ujung depan bagian moncong hingga ujung belakang bagian ekor. Bobot tubuh ikan diukur dengan menggunakan timbangan digital.
Gambar 2.2. Morfologi ikan nilem 2.3.5. Pembedahan ikan
Pembedahan ikan dimulai dari lubang anus sepanjang garis medio-ventral tubuh ke anterior sampai dekat sirip dada dengan menggunakan gunting.
Gambar 2.3. Saluran digesti ikan nilem
Pengguntingan dilakukan secara hati-hati agar organ yang terletak di sebelah dalam tidak ikut tergunting, kemudian daging bagian atas dibuka dengan pinset. Saluran digesti ikan diisolasi, setelah saluran digesti diperoleh lalu dimasukkan ke dalam botol film yang sudah diberi label lalu disimpan dalam lemari pendingin.
2.3.6. Preparasi homogenat hepatopankreas dan intestine (Natalia et al., 2004)
Saluran pencernaan ikan diisolasi dengan cara pembedahan dan dibersihkan diatas lempengan es, kemudian usus ikan dibagi menjadi 3 bagian yaitu usus depan, usus tengah dan usus belakang, hepatopankreas dan intestine lalu dilumatkan atau dihancurkan menggunakan homogeniser listrik dalam 50 mM Tris-buffer (pH 7,2-8,0) dingin dengan rasio 1 : 4 (w/v), homogenat yang diperoleh kemudian disentrifugasi menggunakan sentrifuse elektrik bersuhu -4°C pada kecepatan (5.500 rpm selama 20 menit atau 4.000 rpm selama 30 menit) fraksi lipid yang mengambang dikeluarkan dan
cairan supernatan ditampung untuk digunakan uji aktivitas enzim (Natalia et al., 2004). Kadar protein supernatan ditentukan dengan metode Lowry et al. (1951) dalam Furne et al. (2005). Larutan ekstrak enzim harus disimpan pada suhu sekitar 0°C atau dalam refrigerator.
Gambar 2.4. Preparasi saluran digesti dengan homogenizer listrik
2.3.7. Penentuan kadar protein ekstrak kasar hepatopankreas dan intestine dengan metode Lowry (Furne et al., 2005)
a. Bahan dan Pereaksi
1) Larutan protein standar (0,05 mg/ml–1,0 mg/ml kasein) 2) Pereaksi A = 2 % Na2CO₃dalam 0,1 M NaOH
3) Pereaksi B = 0,5 % CuSO₄.5H₂O dalam 1 % Na-K tartat
4) Pereaksi C = campuran 50 ml pereaksi A dengan 1 ml pereaksi B 5) Pereaksi D = larutan 1 N pereaksi Folin Ciocalteu.
b. Prosedur
Pengukuran kadar protein ekstrak kasar hepatopankreas dan intestine dengan metode Lowry yaitu lima buah tabung reaksi
disiapkan untuk larutan protein standar (kasein). Masing-masing tabung diisi 0,5 ml larutan standar dengan konsentrasi berurut-urut 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,50 mg/ml, dan 1,0 mg/ml. satu tabung untuk larutan sampel, ke dalam tabung sampel dimasukkan 0,5 ml larutan sampel (ekstrak vicera) yang kadarnya di bawah 0,25 mg/ml. Kesemua tabung (5 tabung standar dan semua tabung sampel) ditambah 5 ml pereaksi C. kemudian segera dikocok dan dibiarkan pada suhu kamar selama paling sedikit 10 menit, setelah 10 menit ditambahkan 0,5 ml pereaksi D, kocok segera dan dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit. Absorbansinya diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm, kemudian hasilnya dicatat dan dibuat kurva standarnya. Kadar protein sampel ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar.
2.3.8. Pengukuran Aktivitas Ekstrak Kasar Protease Digesti menggunakan Metode Hidrolisis Kasein (Hidalgo et al., 1999). a. Bahan dan pereaksi
1) Larutan 0,1 M Glycine-HCl (pH 2,0 - 3,0) 2) Larutan 0,1 M Tris-HCl (pH 6,5–7,5)
3) Larutan 0,05 M Na₂HPO₄buffer (pH 8,0–9,0) 4) Larutan kasein 1 % (w/v)
5) Larutan 8 % (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
6) Larutan tyrosine standard 1 % (w/v), dibuat konsentrasi dengan range antara 10 μg/ml – 250 μg/ml
b. Prosedur
Pengukuran aktivitas ekstrak kasar protease digesti menggunakan metode hidrolisis kasein yaitu disiapkan 7 buah tabung reaksi, masing-masing tabung diberi label. Satu buah tabung untuk sampel, satu buah tabung untuk kontrol, satu buah tabung untuk blanko dan 4 buah tabung keempat untuk standar dengan konsentrasi (larutan 0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml dan 0,25 mg/ml) larutan tirosin 1%. Tabung sampel diisi 0,35 ml larutan kasein 1%, 0,30 ml larutan buffer dan 0,10 ml larutan ekstrak kasar enzim; Diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C, reaksi dihentikan dengan menambahkan 0,75 ml larutan tricholoacetic acid (TCA) 8%.
Tabung kontrol diisi larutan buffer sebanyak 0,30 ml, 0,10 ml akuades dan ditambahkan 0,75 ml TCA 8%, kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C; Setelah inkubasi ditambahkan larutan kasein sebanyak 0,35 ml. Tabung blanko diisi dengan 0,30 ml buffer, 0,45 ml akuades, selanjutnya diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C. setelah inkubasi ditambahkan dengan 0,75 ml TCA.
Tabung standar diisi dengan 0,35 ml larutan tirosin standar, lalu ditambahkan 0,30 ml buffer, 0,10 ml akuades, dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C. Semua tabung dimasukkan kedalam refrigerator selama 1 jam, campuran reaksi disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit; Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 280 nm. Hasilnya dicatat dan dibuat kurva
standarnya. Aktivitas enzim ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar.
2.3.9. Pengukuran Aktivitas Amilase Digesti dengan metode Somogy-Nelson (Hidalgo et al., 1999).
Disiapkan 7 buah tabung reaksi, masing-masing tabung diberi label. Satu buah tabung untuk sampel, satu buah tabung untuk kontrol, satu buah tabung untuk blanko dan 4 buah tabung untuk standar dengan konsentrasi (larutan 0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml dan 0,25 mg/ml) larutan maltosa 1%. Masing-masing tabung standar diisi dengan 0,70 ml larutan maltosa standar 1%, kemudian ditambah 0,10 ml akuades. Ke dalam tabung sampel diisi 0,70 ml amilum 1% dan ekstrak kasar enzim 0,10 ml, ke dalam tabung blanko diisikan 0,80 ml akuades, tabung kontrol diisi dengan 0,10 ml akuades dan ditambahkan 0,70 ml dinitrosalicylic acid (DNS).
Masing-masing tabung (standar, sampel, kontrol dan blanko) diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah inkubasi ditambahkan 0,70 ml dinitrosalicylic acid (DNS) 2% ke dalam masing-masing tabung, kecuali pada tabung kontrol ditambahkan 0,70 ml amilum 1%. Semua tabung dimasukkan ke dalam air mendidih selama 5 menit, setelah dingin campuran disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 540 nm, hasilnya dicatat dan dibuat kurva standarnya. Aktivitas enzim ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar (Lampiran 1).
3. Metode Analisis
Metode analisis yang dilakukan untuk mengetahui aktivitas protease dan amilase adalah dengan one way analysis of variance (ANOVA). Hasil uji ANOVA yang berbeda nyata dan sangat nyata, uji dilanjutkan dengan uji BNT (Steel & Torrie, 1993).
