PENGARUH PEMBERIAN MADU KELENGKENG (Nephelium longata L.) TERHADAP RESPON HIPERSENSITIVITAS TIPE LAMBAT (DELAYED-TYPE HYPERSENSITIVITY/ DTH) PADA TIKUS PUTIH
JANTAN GALUR WISTAR
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Chrissa Hygianna
NIM : 098114046
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
i
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Chrissa Hygianna
NIM : 098114046
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
vi
LEMBAR PERSEMBAHAN
Janganlah takut, sebab AKU menyertai engkau, janganlah bimbang, sebab AKU ini ALLAHmu; AKU akan meneguhkan, bahkan akan menolong engkau; AKU
akan memegang engkau dengan tangan kanan-KU yang membawa kemenangan (Yesaya 41: 10)
“Tugas kita bukanlah untuk berhasil. Tugas kita adalah untuk mencoba karena di dalam mencoba itulah kita menemukan dan belajar membangun kesempatan
untuk berhasil”
“Berani lah untuk bermimpi, dan beranikan dirimu untuk mewujudkan semua impian kamu. Karena impian tidak akan tercapai tanpa keberanian”
– Mario Teguh –
Karya kecil ini kupersembahkan kepada
:
TUHAN YESUS KRISTUS, sebagai wujud syukurku atas penyertaan dan kasih-NYA yang
luar biasa.
PAPAH PENDI,
MAMAH WATI
, KAKAK IMA,
KAKAK VENTI
dan
ADE CHRIST
. Kalianlah
yang memberiku cinta, motivasi, dukungan yang luar biasa dan selalu mendoakanku. Tidak
akan ada yang bisa membalas semua jasa kalian.
ADDITYA TERSAYANG
, yang membawa kepercayaan dan membuat perubahan terbesar
dalam hidupku.
vii
PRAKATA
Puji syukur dan terima kasih penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus
Kristus, atas segala berkat dan anugerah-NYA sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini. Skripsi dengan judul “Pengaruh Pemberian Madu
Kelengkeng (Nephelium longata L.) Terhadap Respon Hipersensitivitas Tipe
Lambat (Delayed-Type Hypersensitivity/ DTH) Pada Tikus Putih Jantan Galur
Wistar” merupakan karya ilmiah penulis untuk memenuhi syarat memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma.
Dalam proses penyelesaian skripsi ini, banyak kesulitan yang penulis
hadapi, namun berkat dukungan, bimbingan, kritik dan saran dari berbagai
pihak, penulis dapat menyelesaikannya. Oleh karena itu, pada kesempatan ini
penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma.
2. Ibu CM. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm.,Apt., selaku Ketua Program Studi
Farmasi sekaligus Ketua Tim Panitia Skripsi Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma.
3. Ibu Yunita Linawati M.Sc, Apt selaku Dosen Pembimbing atas
kebijaksanaan, perhatian, dan kesabarannya dalam membimbing penulis
menyelesaikan skripsi ini.
4. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. dan dr. Fenty, M.Kes., Sp. PK selaku Dosen
Penguji yang telah memberikan saran yang menjadikan penulisan skripsi
menjadi lebih baik.
5. Teknisi LPPT UGM dan Balkes Yogyakarta: Bu Istini dan Bu Atika atas
semua bantuan yang telah diberikan.
6. Teman-teman seperjuangan penelitian yang selalu membantu dan
mengingatkan: Raisa Novitae, Defi Krishartantri, dan Inthari Alselusia.
7. Para sahabat terkasih yang menjadi tempat tawa dan keluh kesah penulis,
bersedia membantu serta berbagi suka dan duka: Retno Wahyu Ningsih,
viii
Sinaga, Kak Perthy Melati Kasih; Dewi 2’s: Yuningsih Wulan Oei, Ina Juni
Natasia, A.A.Istri Yulianty, Realita Rosada; Kelompok seperjuangan
praktikum dan tugas kelas: Berta Trifina Mardani, Listya Purbarini, Diah
Intan Sari.
8. Teman-teman angkatan 2009, khususnya FKK A dan FSM C 2009.
9. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, yang telah
membantu dalam kelancaran penyelesaian skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini jauh dari sempurna. Oleh karena
itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan demi
sempurnanya skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan
memberikan informasi bagi pembaca.
ix
2. Keaslian penelitian ... 4
3. Manfaat penelitian ... 6
a. Manfaat teoritis ... 6
b. Manfaat praktis ... 6
B. Tujuan Penelitian ... 6
x
1. Sistem imun nonspesifik ... 11
2. Sistem imun spesifik ... 11
a. Sistem imun spesifik humoral ... 13
b. Sistem imun spesifik selular ... 13
C. Hipersensitivitas Tipe Lambat ... 14
D. Inflamasi ... 16
E. Imunomodulator ... 17
F. Landasan Teori ... 18
G. Hipotesis ... 19
BAB III. METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 20
B. Variabel dan Definisi Operasional ... 21
1. Variabel penelitian ... 21
2. Definisi operasional ... 21
C. Bahan Penelitian ... 22
D. Alat Penelitian ... 22
E. Tata Cara Penelitian ... 23
1. Pengumpulan sampel ... 23
2. Tahap penentuan dosis madu kelengkeng ... 23
3. Penyiapan antigen ... 24
4. Tahap pra perlakuan hewan uji ... 25
5. Tahap orientasi dosis madu kelengkeng ... 25
6. Tahap percobaan ... 26
7. Pengukuran respon hipersensitivitas tipe lambat (Delayed-Type Hypersensitivity/ DTH) ... 27
F. Analisis Hasil ... 28
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Identifikasi Senyawa Uji ... 29
B. Penyiapan Antigen ... 31
xi
D. Pengaruh Pemberian Madu Kelengkeng Dosis 0,60 ml/ 200 g BB;
1,20 ml/ 200 g BB; dan 2,30 ml/ 200 g BB Pada Tahap Percobaan ... 37
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan ... 42
B. Saran ... 42
DAFTAR PUSTAKA ... 43
LAMPIRAN ... 46
xii
DAFTAR TABEL
Tabel I. Rata-rata ± SD Hasil Selisih Peningkatan Volume Bengkak Kaki
sebagai Respon DTH pada Tahap Orientasi ... 35
Tabel II. Rata-rata ± SD Hasil Selisih Peningkatan Volume Bengkak Kaki
sebagai Respon DTH Terhadap Pengaruh Pemberian Madu
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Gambaran Umum Sistem Imun ... 11
Gambar 2. Reaksi Hipersensitivitas Tipe I, II, III, dan IV Menurut Gell dan
Coombs ... 15
Gambar 3. Grafik Rata-rata±SD Hasil Selisih Peningkatan Volume Bengkak
Kaki sebagai Respon DTH pada Tahap Orientasi ... 36
Gambar 4. Grafik Rata-rata ±SD Hasil Selisih Peningkatan Volume Bengkak
Kaki sebagai Respon DTH Terhadap Pengaruh Pemberian Madu
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Kelaikan Etik ... 47
Lampiran 2. Surat Keterangan Ijin Penelitian/ Penggunaan Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma ... 48
Lampiran 3. Surat Keterangan Ijin Penelitian/ Penggunaan Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada ... 49
Lampiran 4. Foto Madu Kelengkeng PT. Madu Pramuka ... 50
Lampiran 5. Foto Pengujian Identifikasi Madu Kelengkeng ... 50
Lampiran 6. Foto Pembuatan Suspensi Sel Darah Merah (SDMD) 1% ... 51
Lampiran 7. Perhitungan Dosis Madu Kelengkeng Tahap Orientasi Dosis dan Percobaan ... 52
Lampiran 8. Pengujian Statistik Respon DTH Tahap Orientasi ... 53
xv
INTISARI
Sistem imun tubuh memberikan respon ketika mengenali molekul asing (antigen) terpajan. Aktivitas ini untuk mengeliminasi antigen, namun dapat menimbulkan kerusakan jaringan yang disebut respon hipersensitivitas tipe lambat/ Delayed-Type Hypersensitivity (DTH). Banyak bahan alam yang mampu mempengaruhi sistem imun (imunomodulator), salah satunya madu. Madu memiliki banyak jenis, diantaranya madu kelengkeng. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui pengaruh pemberian madu kelengkeng terhadap respon DTH pada tikus putih jantan galur Wistar.
Rancangan penelitian yang digunakan adalah eksperimental murni rancangan acak pola searah. Sebanyak 20 ekor tikus dibagi menjadi 4 kelompok, 1 kelompok kontrol negatif dan 3 kelompok perlakuan dengan pemberian madu kelengkeng dosis 0,60;1,20;2,30ml/200gBB secara per-oral selama 8 hari. Tikus diinjeksi pada hari ke-0 dengan antigen (suspensi Sel Darah Merah Domba(SDMD) 1%)secara peritoneal dan pada hari ke-8 secara subkutan di kaki tikus dengan sebelumnya mengukur bengkak kaki dengan jangka sorong digital sebagai data Pre-DTH dan setelah 24 jam antigen II dinjeksikan, diukur lagi sebagai data Post-DTH dan selisih dari keduanya digunakan dalam mengukur respon DTH. Data dievaluasi dengan metode Kolmogorov-Smirnov, dilanjutkan dengan uji one way ANOVA, jika terdapat perbedaan bermakna (p<0,05) lanjutkan dengan uji Tukey.
Hasil penelitian menunjukkan pemberian madu kelengkeng tidak memiliki pengaruh berupa peningkatan respon hipersensitivitas tipe lambat (Delayed-Type
Hypersensitivity/DTH) pada tikus putih jantan galur Wistar.
xvi
ABSTRACT
The body's immune system to respond when it recognizes foreign molecules (antigens) exposed. This activity is to eliminate the antigen, but can cause tissue damage called Delayed-Type Hypersensitivity response (DTH). Many natural ingredients that can affect the immune system (immunomodulators), one honey. Honey has many types, such as longan honey. The purpose of this study to determine the effect of longan honey on the DTH response in Wistar
white male rats.
The research design used was a randomized experimental design purely unidirectional pattern. A total of 20 mice were divided into 4 groups, 1 negative control group and 3 treatment groups by administering a dose of longan honey 0,60;1.20; 2.30 ml/200gBB per-orally for 8 days. Mice injected on day 0 with antigen (suspension Sheep Red Blood Cells (SRBC) 1%) in peritoneal and on day 8 mice subcutaneously in the leg with a swollen foot with a previous measure digital calipers as the data pre-DTH and after 24 hours since the injected antigen II, again measured as DTH and Data Post-difference of the two is used in measuring the DTH response. Data were evaluated with the Kolmogorov-Smirnov method, followed by one-way ANOVA test, if there is a significant difference (p <0.05) proceed with the Tukey test.
The results showed longan honey treatment has no effect in the form of an increase in Delayed-Type Hipersensitivity/ DTH in Wistar white male rats.
1
BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Tubuh manusia memiliki sistem imun yang memberikan respon dan
melindungi tubuh terhadap unsur - unsur patogen. Respon imun sangat tergantung
pada kemampuan sistem imun untuk mengenali molekul asing (antigen) yang
terdapat pada patogen potensial dan kemudian membangkitkan reaksi yang tepat
untuk menyingkirkan sumber antigen bersangkutan (Kresno, 2010).
Antigen yang terpajan pertama kali dalam tubuh segera dikenal oleh
sistem imun dan menimbulkan sensitasi, yaitu ketika sistem imun dibangkitkan
maka akan mempunyai memori atau daya ingat dan akan melakukan respon yang
lebih spesifik serta lebih aktif jika antigen tersebut masuk ke dalam tubuh untuk
kedua kalinya (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010). Sistem imun tubuh akan
mengaktivasi sel efektor yang diperantarai oleh sel T sebagai respon antigen yang
masuk. Sel T yang teraktivasi akan menghasilkan IFN-γ (Interferon) yang
selanjutnya mengaktivasi makrofag dan kemudian akan menghasilkan sitokin
yang dapat merangsang terjadinya reaksi inflamasi ke tempat yang terpajan.
Aktivasi ini dimaksudkan untuk melokalisir dan mengeliminasi patogen, namun
dapat menimbulkan kerusakan jaringan, dan reaksi ini dinamakan hipersensitifitas
tipe lambat atau Delayed-Type Hypersensitivity (DTH). Gejalanya baru tampak
sesudah 24 jam kontak dengan antigen kedua (Abbas, Litchman, dan Pillai, 2010).
Reaksi DTH adalah salah satu jenis dari reaksi hipersensitivitas yang merupakan
sebelumnya. Walaupun demikian, komponen sistem imun yang bekerja pada
proteksi sistem imun adalah sama dengan yang menimbulkan reaksi
hipersentitivitas (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010). Karena alasan inilah
respon DTH dapat digunakan untuk mengetahui teraktivasinya sel T yang terlibat
di respon imun spesifik dalam mengeliminasi patogen antigen dan sebagai salah
satu indikator terjadinya respon imun seluler. Hal ini dipertegas pada pernyataan
Ballal, Bhat, Sumalatha dan Acharya (2012) yang menyatakan respon DTH
banyak digunakan sebagai salah satu parameter untuk mengukur respon cell
mediated immune pada hewan.
Sistem imun tubuh mampu membangkitkan respon imun yang tepat bila
dipacu oleh suatu senyawa yang dapat mempengaruhinya, hal ini digolongkan
sebagai imunomodulator (Sari, 2008). Imunomodulator merupakan senyawa yang
mampu menormalkan kembali sistem kekebalan pada keadaan tertentu dimana
tubuh tidak berhasil menormalkan sistem kekebalannya (Abbas, Litchman, dan
Pillai, 2010). Imunomodulator dapat berasal dari senyawa alam dan salah satu
produk alam yang bermanfaat sebagai imunomodulator adalah madu (Mangan,
2009). Madu adalah cairan manis yang berasal dari nektar tanaman yang diproses
oleh lebah dan tersimpan dalam sel-sel sarang lebah (Suranto, 2007). Menurut
Tonks, dkk. (2007), berbagai jenis madu dapat merangsang sel manusia untuk
menghasilkan sitokin inflamasi (misalnya TNF-α), yang merupakan parameter
untuk mengukur peningkatan respon DTH.
Madu memiliki banyak ragam dan jenis, sesuai dengan bunga yang
madu yang berasal dari satu tumbuhan utama, contohnya adalah madu kelengkeng.
Dari survey pasaran yang dilakukan peneliti, masyarakat menyukai madu
kelengkeng karena rasanya lebih manis dan legit, selain itu salah satu khasiat
madu kelengkeng yang diketahui adalah meningkatkan daya tahan tubuh (Aden,
2010) sehingga dipilihlah madu kelengkeng sebagai senyawa yang ingin diuji
peneliti. Madu sendiri mengandung beberapa senyawa organik yang kemungkinan
berperan dalam sistem imun, salah satunya flavonoid. Penelitian Siddiqa (2008)
menunjukkan bahwa ditemukan flavonoid di dalam kandungan madu kelengkeng
dan menurut Kusmardi, Kumala, dan Triana (cit., Kasih, 2012), flavonoid dalam
tubuh manusia berfungsi sebagai antioksidan untuk melindungi sel. Penelitian
yang diacu Saifulhaq (cit. Senas, 2012) membuktikan bahwa senyawa antioksidan
yaitu flavonoid dapat dipercaya sebagai imunomodulator karena dapat
meningkatkan sistem kekebalan tubuh. Oleh karena itu, diduga flavonoid dari
madu kelengkeng inilah yang mungkin nantinya akan mempengaruhi sistem imun
dan peningkatan terhadap respon DTH nantinya dapat mengindikasikan bahwa
bahan alam yang digunakan peneliti ini, yaitu madu kelengkeng, memiliki efek
stimulan terhadap limfosit dan berbagai sel-sel lain yang berperan menimbulkan
respon tersebut (Singh, CPS, dan Noolvi, 2012).
Mengingat sejauh ini belum banyak publikasi yang menyebutkan tentang
pengaruh pemberian madu kelengkeng dengan melihat respon DTH di Indonesia,
maka dipandang perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui pengaruh
pemberian madu kelengkeng (Nephelium longata L.) pada sistem imun dengan
kiri tikus putih jantan galur Wistar setelah diinduksi dengan antigen dan diukur
menggunakan plethysmometrically atau jangka sorong digital berdasarkan metode
Puri, dkk. (cit. Chakraborthy, 2009), sehingga dapat diperoleh informasi mengenai
pengaruh penggunaan madu kelengkeng yang banyak digunakan oleh masyarakat.
1. Permasalahan
Apakah pemberian madu kelengkeng (Nephelium longata L.) memiliki
pengaruh berupa peningkatan respon hipersensitivitas tipe lambat (Delayed-Type
Hipersensitivity/DTH) pada tikus putih jantan galur Wistar?
2. Keaslian penelitian
Sejauh yang diketahui peneliti dan penelusuran pustaka yang sudah
dilakukan, penelitian yang telah ada sebelumnya yaitu:
a. Aktivitas Antiradikal Bebas serta Kadar Beta Karoten pada Madu Randu
(Ceiba pentandra) dan Madu Kelengkeng (Nephelium longata L.),
diperoleh bahwa pada aktivitas antiradikal bebas pada madu kelengkeng
lebih besar yaitu 82,10% dibandingkan dengan madu randu yaitu 69,37%
(Parwata, Ratnayani, dan Listya, 2010).
b. Penelitian tentang Aktivitas Imunomodulator Ekstrak Air dari Heracleum
persicum Desf. pada Mencit, diperoleh bahwa respon DTH mengalami
peningkatan pada dosis maksimum dan senyawa yang berperan adalah
furanokumarin, flavonoid dan beberapa alkaloid (Sharififar,
Pournourmohammadi, Arabnejad, Rastegarianzadeh, Ranjbaran, and
c. Penelitian mengenai Evaluasi Aktivitas Imunomodulator Antosianin dari
Dua Formula dari Brassica oleracea, diperoleh bahwa efek imunostimulan
yang diuji selama delapan hari dimediasi oleh aktivasi sel T dan B,
peningkatan jumlah sel darah putih dan peningkatan fagositosis (Gomathi,
Prameela, Kumar, Dan Rajendra, 2012).
d. Penelitian mengenai Aktivitas Imunomodulator dari Fraksi Gentiana
Olivieri Griseb. pada Mencit Balb/C, diperoleh bahwa efek meningkatkan
pada tanamanin ini aktif melalui imunitas selular (respon DTH dan
fagositosis) dan humoral (titer antibodi hemoglutinasi) (Singh, CPS,
Noolvi, 2012).
e. Penelitian mengenai Evaluasi Aktivitas Imunomodulator dari Aesculus indica,
diperoleh bahwa tanaman ini berpotensi pada imunitas selular dengan
memfasilitasi respon hipersensititas tipe lambat pada peningkatan volume
kaki dan tidak berefek pada imunitas humoral (Chakraborthy, 2009).
Dengan demikian, dapat dipastikan bahwa penelitian mengenai “Pengaruh
Pemberian Madu Kelengkeng (Nephelium longata L.) Terhadap Respon
Hipersensitivitas Tipe Lambat (Delayed-Type Hypersensitivy/ DTH) Pada Tikus
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat Teoretis. Memberikan sumbangan ilmiah bagi ilmu pengetahuan,
khususnya mengenai manfaat madu kelengkeng sebagai immunomodulator
untuk kesehatan.
b. Manfaat Praktis. Memberikan informasi dan menambah wawasan bagi
masyarakat mengenai manfaat madu kelengkeng sebagai salah satu cara
untuk meningkatkan kesehatan.
B. Tujuan penelitian 1. Tujuan umum
Memperoleh informasi mengenai pengaruh pemberian madu kelengkeng
(Nephelium longata L.) pada tikus jantan putih galur Wistar.
2. Tujuan khusus
Memperoleh informasi mengenai pengaruh pemberian madu kelengkeng
(Nephelium longata L.) berupa peningkatan respon Hipersensitivitas Tipe
Lambat (Delayed-Type Hypersensitivy/ DTH) pada tikus jantan putih galur
7
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Madu
Produk lebah sangat bermanfaat untuk meningkatkan daya tahan dan
kekebalan tubuh (imunomodulator) (Mangan, 2009). Madu adalah cairan manis
yang berasal nektar tanaman yang diproses oleh lebah dan tersimpan dalam sel-sel
sarang lebah (Hariyati, 2010). Berbagai kelebihan madu sebagai makanan
bernutrient tinggi sudah diketahui sejak zaman dahulu (Parwata dan Ratnayani,
2010).
1. Jenis madu
Madu memiliki banyak ragam dan jenis, sesuai dengan bunga yang
menjadi sumbernya. Lebah terkadang mengumpulkan cairan bunga dari ribuan
kuntum bunga yang jenisnya berbeda-beda, namun madu monoflora merupakan
madu yang diperoleh dari satu tumbuhan utama, seperti madu kelengkeng, madu
rambutan, dan madu randu, sedangkan madu poliflora adalah madu yang berasal
dari nektar berbagai jenis tumbuhan bunga, contoh dari madu ini adalah madu
hutan (Aden, 2010). Madu monoflora mempunyai wangi, warna dan rasa yang
spesifik sesuai dengan sumbernya (Hariyati, 2010).
Madu kelengkeng diproduksi secara kontinyu di Indonesia (Asih dan
Ratnayani, 2012). Madu bunga kelengkeng berkhasiat: meningkatkan daya tahan
tubuh, memperlancar urine atau berkemih, memperkuat fungsi ginjal, mengobati
sakit pinggang, mempercepat penyembuhan luka operasi, memperlancar fungsi
2. Komposisi madu
Madu merupakan sumber makanan utama, mengandung berbagai jenis
gula, seperti fruktorsa dan glukosa serta berbagai jenis mineral, seperti
magnesium, potasium, kalsium, klorid, sodium, belerang, zat besi, dan juga fosfor.
Kejernihan madu tergantung pada komposi kadar nektar dan putik yang
dikandungnya (Sulaiman, 2010). Selain itu, mengandung pula vitamin A, B1, B2,
B3, B5, B6, C, D, E, K, beta karoten, flavonoid, asam fenolik, asam urat dan asam
nikotinat. Mineralnya diperlukan tubuh agar tetap segar, vitaminnya berperan
dalam metabolisme protein dan mencegah penyakit kulit seperti eksim dan herpes.
Kandungan fruktosa madu berperan dalam mempercepat proses oksidasi alkohol
pada hati, sehingga dapat membantu menanggulangi kerusakan hati pada
peminum minuman beralkohol (Parwata dan Ratnayani, 2010).
Beberapa senyawa organik yang telah terindentifikasi di dalam madu
antara lain seperti polifenol, flavonoid, dan glikosida. Madu juga mengandung
berbagai jenis enzim, antara lain enzim glukosa oksidase dan enzim invertase
(Aljady, Kamaruddin, Jamal, danYassim, 2000).
Menurut Kusmardi, Kumala, dan Triana (cit., Kasih, 2012), flavonoid
dalam tubuh manusia berfungsi sebagai antioksidan untuk mencegah kanker dan
melindungi sel. Hal inilah yang menyebabkan flavonoid sebagai zat yang sangat
kuat menetralisir radikal bebas, mendukung sistem kekebalan tubuh alami
manusia pada tingkat seluler dan membantu regenerasi sel. Berdasarkan penelitian
Siddiqa (2008), madu kelengkeng memiliki pH 4,48; kadar gula 35,36%; kadar air
Madu juga mengandung dekstrosa (gula yang ditemukan dalam
tumbuhan), lilin, gen pembiakan, dan asam formik (Hariyati, 2010). Jenis gula
yang dominan dalam hampir semua madu adalah levulosa dan hanya sebagian
kecil madu yang kandungan dekstrosanya lebih tinggi dari levulosa, yaitu
mencakup 85 – 90 persen dari karbohidrat yang terdapat dalam madu dan
sebagian kecil oligosakharida dan polisakarida (Sihombing, 2005). Kadar gula
yang tinggi inilah yang memberikan rasa manis pada madu (Sulaiman, 2010).
3. Manfaat madu
Madu memiliki berbagai manfaat yang telah diketahui manusia sejak
dahulu. Madu telah menjadi makanan yang istimewa bagi setiap orang di
sepanjang masa (Hamad, 2007). Madu bermanfaat sebagai makanan kesehatan
yang dapat meningkatkan stamina tubuh sebagai energi seketika. Selain itu, madu
juga dapat digunakan sebagai pengganti gula atau suplementasi nutrisi (Hariyati,
2010). Madu merupakan obat terbaik karena ia adalah sumber nutrisi alami yang
memiliki dekstrosa dan tidak seperti umumnya obat yang menyebabkan efek
samping berbahaya (Sulaiman, 2010). Riset-riset ilmiah mengisyaratkan bahwa
khasiat-khasiat secara fisika dan kimia madu (seperti kadar asam dan efek-efek
osmosis) memainkan peranan penting dalam keefektifannya membunuh kuman.
Di samping itu madu juga memiliki khasiat anti-infeksi dan mendorong
respon - respon sistem imun di dalam luka. Khasiat madu yang mengandung
anti-infeksi dapat meringankan rasa sakit luka dengan cepat, sebagaimana ia juga
cairan dari luka (exudates) serta mengurangi munculnya bekas sesudah luka itu
sembuh (Al-‘Id, 2010).
Konsumsi madu untuk pencegahan penyakit pada manusia adalah 1-2
kali/hari satu sendok makan, sedangkan untuk menyembuhkan suatu penyakit,
dianjurkan untuk minum lebih banyak, yaitu 3-4 kali/hari satu sendok makan
(Suranto, 2007).
B. Sistem Imun
Sistem imun merupakan suatu bentuk pertahanan tubuh melawan infeksi
menular dari mikroba maupun zat asing yang mampu memicu respon imun atau
respon kekebalan tubuh. Respon imun merupakan reaksi terhadap komponen
mikroba serta makromolekul atau bahan kimia kecil lainnya yang dianggap suatu
benda asing oleh tubuh (Abbas, Litchman, dan Pillai, 2010). Imunitas adalah
resistensi terhadap penyakit terutama infeksi. Gabungan sel, molekul dan jaringan
yang berperan dalam resistensi terhadap infeksi disebut sistem imun. Reaksi yang
dikoordinasi sel-sel molekul-molekul dan bahan lainnya terhadap mikroba disebut
respon imun (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
Bila sistem imun terpapar pada zat yang dianggap asing, maka ada dua
jenis respon imun yang mungkin terjadi, yaitu: 1) respon imun nonspesifik dan 2)
Gambar 1. Gambaran Umum Sistem Imun (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010)
1. Sistem imun nonspesifik (innate immune system)
Imunitas nonspesifik berupa komponen normal tubuh, selalu ditemukan
pada individu sehat dan siap mencegah mikroba masuk tubuh dan dengan cepat
menyingkirkannya. Disebut nonspesifik karena tidak ditujukan terhadap mikroba
tertentu, telah ada dan siap berfungsi sejak lahir. Mekanismenya tidak
menunjukkan spesifisitas terhadap benda asing dan mampu melindungi tubuh
terhadap banyak patogen potensial. Sistem tersebut merupakan pertahanan
terdepan dalam menghadapi serangan berbagai mikroba dan dapat memberikan
respon langsung (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
2. Sistem imun spesifik (adaptive immune system)
Berbeda dengan sistem imun nonspesifik, sistem imun spesifik
mempunyai kemampuan untuk mengenal benda yang dianggap asing bagi dirinya.
Benda asing yang pertama kali terpajan dengan tubuh segera dikenal oleh sistem
dipajankan kedua kalinya maka akan dikenal lebih cepat dan kemudian
dihancurkan (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
Sistem kekebalan tubuh menghadapi berbagai tantangan untuk
menghasilkan tanggapan pelindung efektif terhadap infeksi patogen. Respon imun
adaptive (spesifik) dibagi ke dalam tiga fase yaitu pengenalan antigen, aktivasi
limfosit, dan fase efektor. Pertama, sistem harus mampu merespon sejumlah kecil
antigen yang berbeda yang dapat diperkenalkan pada setiap jaringan dalam tubuh.
Pengenalan antigen diikuti dengan dua respon imun spesifik yang utama yaitu
imunotas humoral dan seluler. Sel T bertanggung jawab terhadap imunitas seluler,
sedangkan sel B bertanggung jawab terhadap imunitas humoral (Putri, 2012).
Kedua, limfosit akan teraktivasi dan mengenali serta menanggapi antigen yang
masuk. Ketiga, mekanisme efektor sistem kekebalan tubuh (antibodi dan sel T
efektor) akan menemukan dan menghancurkan antigen di lokasi yang jauh dari
tempat infeksi awal. Sel limfosit T memiliki spesifikasi terhadap antigen. Sel ini
mengenali peptida dari protein asing yang berikatan dengan protein inang yang
disebut molekul MHC kemudian diekspresikan pada permukaannya. Sel T
mengenali dan memberikan respon terhadap sel permukaan dan bukan antigen yg
terlarut (Abbas, Litchman, dan Pillai, 2010). Sel T diklasifikasikan menjadi sel
CD4 dan CD8. CD4 akan mengenali antigen spesifik dan berasosiasi dengan
molekul MHC kelas II, CD8 mengenali antigen yang bergabung dengan molekul
MHC kelas I. Berdasarkan sitokin yang diproduksinya, sel CD4 terbagi menjadi
dan sel Th1 yang berperan dalam respon inflamasi terhadap benda asing (Putri,
2012).
Sistem imum spesifik terdiri atas sistem humoral dan sistem selular
(Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
a. Sistem imun spesifik humoral
Pemeran utama dalam sistem imun spesifik humoral adalah limposit B
atau sel B. Humor berarti cairan tubuh. Sel B berasal dari sel asal multipoten di
sumsum tulang (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
Sel B yang dirangsang oleh benda asing akan berproliferasi,
berdiferensiasi dan berkembang menjadi sel plasma yang memproduksi antibodi.
Antibodi yang dilepas dapat ditemukan dalam serum. Fungsi utama antibodi ialah
pertahanan terhadap infeksi ekstraselular, virus dan bakteri serta menetralkan
toksinnya (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
b. Sistem imun spesifik selular
Pemeran utamanya adalah limfosit T atau sel T. Sel ini juga berasal dari
sel yang sama seperti sel B. Fungsi utama sistem imun spesifik selular ialah
pertahanan terhadap bakteri yang intraselular, virus, jamur, parasit dan keganasan.
Berbeda dengan sel B, sel T terdiri atas beberapa subset sel dengan fungsi yang
berlainan yaitu sel CD4+ (Th1, Th2), CD8+ atau CTL atau Tc dan Ts atau sel Tr
atau TH3. Sel CD4+ mengaktifkan sel Th1 yang selanjutnya mengaktifkan
makrofag untuk menghancurkan mikroba. Sel CD8+ memusnahkan sel terinfeksi
C. Hipersensitivitas Tipe Lambat
Respon imun, baik nonspesifik maupun spesifik pada umumnya
menguntungkan bagi tubuh, biasanya berfungsi sebagai protektif terhadap infeksi
atau pertumbuhan kanker, tetapi dapat pula menimbulkan hal yang tidak
menguntungkan bagi tubuh, berupa penyakit yang disebut reaksi hipersensitivitas.
Komponen sistem imun yang bekerja pada proteksi adalah sama dengan yang
menimbulkan reaksi hipersentitivitas. Hipersensitivitas adalah peningkatan
reaktivitas atau sensitivitas terhadap antigen yang pernah dipajankan atau dikenal
sebelumnya (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
Reaksi hipersensitivitas oleh Robert Coombs dan Philip HH Gel (1963)
dibagi dalam empat tipe reaksi dan hipersensitivitas tipe lambat atau
Delayed-Type Hypersensitivity/DTH termasuk hipersensitivitas tipe IV (Baratawidjaja dan
Rengganis, 2010). Reaksi tipe IV berbeda dengan ketiga reaksi lainnya karena
reaksi ini tidak melibatkan antibodi tetapi melibatkan sel-sel dari limfosit T
(Kresno, 2010). Dalam mekanisme yang diaktivasi sel T, respon DTH termasuk
hipersensitivitas tipe IV A karena CD4+ sel T merespon antigen yang masuk
dengan menghasilkan sitokin yang dapat menstimulasi terjadinya inflamasi dan
mengaktifkan fagositosis, yang menyebabkan kerusakan jaringan (Abbas,
Gambar 2. Reaksi Hipersensitivitas Tipe I, II, III, dan IV menurut Gell dan Coombs
(Baratawidjaja dan Rengganis, 2010)
Reaksi khas DTH mempunyai dua fase yang dapat dibedakan yaitu fase
sensitasi dan fase efektor. Pada fase sensitasi sel T diaktifkan oleh APC (
Antigen-Presenting Cell) melalui MHC-II dan membutuhkan 1-2 minggu setelah kontak
primer dengan antigen. Berbagai APC seperti sel Langerhans dan makrofag akan
menangkap antigen dan membawanya ke kelenjar limfoid untuk dipresentasikan
ke sel T. Sel T yang aktif, umumnya CD4+ terutama Th1. Pajanan berulang
dengan antigen ini dapat menginduksi sel efektor. Pada fase efektor, sel Th1
melepas berbagai sitokin (IFN-γ dan TNF) yang mengerahkan dan mengaktifkan
makrofag dan sel inflamasi lainnya ke tempat infeksi. Fungsi dari produk-produk
tersebut adalah sebagai mediator inflamasi (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
Reaksi DTH dapat terjadi sebagai kerusakan tambahan selama proses dari respon
injeksi antigen dan maksimal pada 24 sampai 48 jam (Abbas, Lichtman, and Pillai,
2010).
D. Inflamasi
Reaksi radang atau inflamasi adalah reaksi tubuh terhadap infeksi,
antigen lain atau kerusakan jaringan (Wahab dan Julia, 2002).
Reaksi inflamasi termasuk dalam karakteristik reaksi DTH. TNF dan
IL-1 yang merupakan sitokin dari sel Th1 yang biasanya berperan pada peristiwa ini
(Murphy et aL., 2008; Abbas, Litchman, dan Pillai, 2010; Baratawidjaja dan
Rengganis, 2010). Pada inflamasi terjadi peningkatan aliran darah karena
vasodilatasi di tempat terjadinya infeksi atau kerusakan jaringan sehingga
pembuluh kapiler menjadi permeabel dan membuat cairan dapat keluar dari
pembuluh kapiler ke jaringan dan bergerak ke tepat sasaran akibat khemotaksis
tadi. Akibat proses di atas maka gambaran klinis dari inflamasi adalah: kemerahan
(rubor), panas (kalor), pembengkakan (tumor) dan rasa sakit (dolor) (Kresno,
2010) dan functio laesa (kehilangan fungsi) (Pratiwi, 2011). Setelah terjadi cedera
jaringan, ditemukan vasodilatasi yang menghasilkan peningkatan volume darah di
jaringan tempat terkena sehingga menimbulkan perdarahan. Permeabilitas
vaskular yang meningkat menimbulkan kebocoran cairan pembuluh darah yang
menimbulkan edema (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
Proses inflamasi diperlukan sebagai pertahanan pejamu terhadap
mikroorganisme yang masuk tubuh serta penyembuhan luka yang membutuhkan
perbaikan jaringan. Reaksi inflamasi dapat berhenti sendiri atau responsif
terhadap terapi (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
E. Imunomodulator
Imunomodulator merupakan senyawa yang mampu mempengaruhi
sistem imun atau sistem kekebalan tubuh. Berdasarkan efek yang ditimbulkannya,
imunomodulator terbagi menjadi imunostimulan dan imunosupresan (Sari, 2008).
Imunostimulasi atau imunopotensiasi adalah cara memperbaiki fungsi
sistem imun dengan menggunakan imunostimulan, yaitu bahan yang merangsang
imun (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010). Imunostimulan dikategorikan dalam
dua bagian, yaitu imunostimulan spesifik dan imunostimulan nonspesifik.
Imunostimulan spesifik adalah suatu bahan yang bersifat antigenik spesifik dalam
memberikan respon imun, seperti vaksin dan beberapa antigen, sedangkan
imunostimulan nonspesifik adalah zat yang beraksi tidak hanya pada satu
antigenik spesifik untuk menambah respon imun dari antigen lain atau dapat
meningkatkan komponen dari sistem imun tanpa sifat antigenik spesifik, seperti
adjuvan (Sari, 2008).
Imunosupresi adalah suatu tindakan untuk menekan respons imun dengan
imunosupresan. Bahan obat yang mengandung imunosupresi digunakan pada
pasien yang akan menjalani transplantasi dan penyakit autoimun karena
kemampuannya dalam menekan respon imun (Baratawidjaja dan Rengganis,
2010). Sangat berguna dalam klinik terutama pada translpantasi dalam usaha
menimbulkan kerusakan atau gejala sistemik, seperti autoimun dan autoinflamasi.
Pengaruh senyawa tertentu untuk menaikkan maupun menekan respon imun dapat
tergantung pada dosis, rute pemberian atau waktu pemberian. Tipe aktivitas dari
senyawa-senyawa tersebut tergantung pula pada mekanisme aksi ataupun tempat
aksinya (Bellanti, 1993).
F. Landasan Teori
Madu kelengkeng adalah madu jenis monoflora, yang diperoleh dari satu
tumbuhan utama saja. Produk alam dari lebah ini sangat bermanfaat untuk
meningkatkan daya tahan dan kekebalan tubuh (imunomodulator). Madu sendiri
mengandung berbagai senyawa organik dan senyawa yang diduga dapat
meningkatkan sistem imun adalah flavonoid. Flavonoid bersifat antioksidan, yang
di dalam tubuh manusia menjadi zat yang sangat kuat untuk mendukung sistem
kekebalan tubuh alami manusia pada tingkat seluler, oleh karena itu diduga
flavonoid dari madu kelengkeng inilah yang nantinya akan mempengaruhi sistem
imun. Bila ada antigen yang masuk, sistem imun tubuh akan mengaktivasi sel
efektor yang diperantarai oleh sel T, sel T melepas berbagai sitokin yang
mengerahkan dan mengaktifkan makrofag dan sel inflamasi lainnya ke tempat
infeksi. Inflamasi ini bertujuan untuk memusatkan agen pertahanan tubuh ke
lokasi yang terinfeksi dan mengeliminasi antigen tersebut, namun di sisi lain dapat
menimbulkan kerusakan jaringan, dan reaksi ini dinamakan hipersensitifitas tipe
lambat atau Delayed-Type Hypersensitivity (DTH). Peningkatan terhadap respon
yaitu madu kelengkeng, memiliki efek stimulan terhadap limfosit dan berbagai
sel-sel lain yang berperan menimbulkan respon tersebut, khususnya respon
hipersensitivitas tipe lambat yang menimbulkan inflamasi.
G. Hipotesis
Pemberian madu kelengkeng (Nephelium longata L.) memiliki pengaruh
berupa peningkatan respon hipersensitivitas tipe lambat (Delayed-Type
20
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian ini adalah eksperimental murni dengan rancangan acak
pola searah. Eksperimental murni adalah penelitian dengan memberikan
percobaan terhadap kelompok perlakuan dan dibandingkan dengan kelompok
kontrol yang tidak dikenai perlakuan. Rancangan acak merupakan cara
menetapkan sampel yang digunakan dalam penelitian dengan pengacakan agar
setiap sampel memperoleh kesempatan yang sama untuk dapat masuk ke dalam
kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Pola searah ditunjukkan dengan
diberikannya perlakuan yang sama pada kelompok perlakuan, yaitu pemberian
larutan madu kelengkeng. Penelitian ini menggunakan subjek uji tikus putih
jantan galur Wistar yang diperoleh dari Laboratorium Imono Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta. Kriteria inklusi yaitu tikus putih jantan, berat badan lebih
kurang 200-300g, berumur 2-3 bulan, sehat, bergalur Wistar. Kriteria eksklusi
adalah tikus mati selama perlakuan. Penelitian dilakukan di Laboratorium
B. Variabel dan Definisi Operasional A. Variabel penelitian
a. Variabel utama
1) Variabel bebas : dosis madu kelengkeng
2) Variabel tergantung : peningkatan volume bengkak pada telapak
kaki kiri tikus
b. Variabel pengacau
1) Variabel yang dikendalikan : jenis makanan, variasi genetik, jenis
kelamin, berat badan, umur dan
galur tikus.
2) Variabel yang tidak terkendali : kondisi psikologis dan
patofisiologis tikus
B. Definisi operasional
a. Madu kelengkeng. Madu kelengkeng (Nephelium longata L.) atau madu
monoflora merupakan madu yang diperoleh dari satu tumbuhan utama.
b. Hipersensitivitas tipe lambat. Hipersensitivitas adalah peningkatan
reaktivitas atau sensitivitas terhadap antigen yang pernah dipejankan atau
dikenal sebelumnya. Reaksi lambat terlihat sampai sekitar 48 jam setelah
terjadi pajanan dengan antigen yang terjadi oleh aktivasi sel Th. Pada DTH,
sitokin yang dilepas sel T mengaktifkan sel efektor makrofag yang
menimbulkan kerusakan jaringan dan menyebabkan inflamasi.
c. Inflamasi. Inflamasi didefinisikan sebagai reaksi lokal jaringan terhadap
reaksi DTH. Inflamasi merupakan respons fisiologis terhadap berbagai
rangsangan seperti infeksi dan cedera jaringan.
C. Bahan Penelitian 1. Madu kelengkeng (Nephelium longata L.)
Madu yang digunakan adalah madu kelengkeng yang diperoleh dari salah
satu distributor madu di Yogyakarta, yaitu PT. Madu Pramuka.
2. Hewan uji
Tikus putih jantan galur Wistar umur 2-3 bulan berat 200-300 g yang
diperoleh dari Laboratorium Imono Hayati Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
3. Antigen
Sel Darah Merah Domba (SDMD) sebagai antigen yang dibuat dalam
bentuk suspensi dengan konsentrasi 1% dengan pelarut Phosphate Buffer
Saline (PBS) steril pH 7,2.
4. Bahan uji respon Delayed-Type Hypersensitivity (DTH)
Suspensi SDMD 1% sebagai antigen.
D. Alat penelitian
Alat yang digunakan dari preparasi sampel sampai pengujian respon
Delayed-Type Hypersensitivity (DTH) adalah gelas beker, mikropipet (Gilson),
pipet ukur, effendorf tube, Laminar Air Flow (Nuraire), sentrifuge (Primo R),
(Terumo), alat timbang hewan uji, pletismometer atau jangka sorong (Digital
Caliper “Wipro” 0-150mm).
E. Tata Cara Penelitian 1. Pengumpulan sampel
Madu kelengkeng yang digunakan diperoleh dari salah satu
distributor madu di Yogyakarta, yaitu PT. Madu Pramuka.
2. Tahap penentuan dosis madu kelengkeng
Menurut penelitian Kasih (2012) yang diacu dari (Suranto, 2007),
penggunaan madu untuk pencegahan penyakit pada manusia adalah 1-2 kali
sehari. Satu sendok makan berarti 15 mL dan disini peneliti mengambil
dosis penggunaan madu yang maksimum, yaitu dua sendok makan (30 mL)
dan bila dikonversikan dari manusia 70 kg ke tikus 200 g dengan faktor
konversi 0,018 (Laurence & Bacarach, 1964) maka akan ditemukan dosis
yang sesuai untuk tikus adalah sebagai berikut:
Dosis madu kelengkeng untuk tikus 20 g adalah:
= 0,018 x 30 mL
= 0,54 mL/200 g BB tikus ≈ 0,60 mL/200 g BB
Mengambil secukupnya madu kelengkeng dari wadahnya dan
masukkan dalam gelas beker. Suntikkan secara oral pada tikus selama
3. Penyiapan antigen
Antigen yang digunakan adalah suspensi Sel Darah Domba Merah
(SDMD) 1% yang SDMD nya diperoleh dari Balai Kesehatan (Balkes)
Yogyakarta dan pembuatannya menjadi supsensi SDMD 1% dilakukan di
Lembaga Pengembangan Penelitian Terpadu (LPPT) Unit III Universitas
Gadjah Mada Yogyakarta.
Berdasarkan penelitian Kumala (2012) dan Achyat (2008), darah
domba segar yang telah diberi antikoagulan disentrifugasi dengan kecepatan
3000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan plasma dari sel darah merah.
Lapisan bagian atas yang berupa plasma dibuang dengan pipet ukur maupun
mikropipet dan lapisan bagian bawah yang berupa endapan sel darah merah
ditambahkan larutan Phosphate Buffer Saline (PBS) steril pH 7,2 sebanyak
tiga kali volume SDMD yang tersisa. Tabung yang sudah berisi campuran
endapan SDMD dan PBS dibolak-balik dengan perlahan-lahan sampai
SDMD tersuspensi secara homogen dan disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 3000 rpm. Prosedur ini diulang sampai lapisan atas benar-benar
jernih. Lapisan atas yang jernih dibuang dan lapisan bawah yang digunakan
dan merupakan suspensi SDMD 100%. Jika akan digunakan ambil 0,5 ml
suspensi SDMD 100% lalu tambahkan PBS dengan volume yang sama
sehingga didapat suspensi SDMD 50%. Untuk mendapatkan suspensi
4. Tahap pra perlakuan hewan uji
Sebelum penelitian dilaksanakan semua hewan uji ditimbang
beratnya dengan tujuan hewan uji yang digunakan memang sudah masuk
kriteria inklusi. Kemudian, hewan uji diadaptasi selama satu minggu di
Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta untuk penyesuaian diri terhadap lingkungannya.
5. Tahap orientasi dosis madu kelengkeng
Tikus dibagi secara random menjadi empat kelompok, yaitu satu
kelompok kontrol negatif dan tiga kelompok perlakuan, dengan
masing-masing kelompok berjumlah tiga ekor, sehingga total tikus yang digunakan
ada 12 ekor. Kelompok-kelompok tersebut antara lain:
Kelompok kontrol negatif : kelompok tikus yang tidak diberi perlakuan
apapun, hanya diberi makan AD II dan minum aquadest.
Kelompok perlakuan 1 : kelompok tikus yang diberi larutan madu
kelengkeng dengan dosis 0,60 mL/200 g BB tikus.
Kelompok perlakuan 2 : kelompok tikus yang diberi larutan madu
kelengkeng dengan dosis 1,20 mL/200 g BB tikus.
Kelompok perlakuan 3 : kelompok tikus yang diberi larutan madu
kelengkeng dengan dosis 2,30 mL/200 g BB tikus.
Semua hewan uji, kecuali kelompok kontrol negatif, diperlakukan
dengan diberi larutan madu kelengkeng secara per oral selama delapan hari.
Hari ke-0, semua hewan uji terlebih dahulu diinjeksi dengan antigen I
madu kelengkeng dan hari ke-8 dilakukan injeksi antigen II sebanyak 0,5
mL pada telapak kaki sebelah kiri secara subkutan, namun sebelum diinjeksi
antigen dan diberi larutan madu kelengkeng, telapak kaki kiri hewan uji
diukur dahulu secara plethysmometrically atau menggunakan jangka sorong
digital sebagai data pre-DTH. Setelah 24 jam sejak antigen II dinjeksikan,
telapak kaki kiri hewan uji diukur menggunakan jangka sorong digital
sebagai data post-DTH. Hasil percobaan dari tahap orientasi dosis ini akan
digunakan pada tahap percobaan berikutnya.
6. Tahap percobaan
Tikus dibagi secara random menjadi empat kelompok, yaitu satu
kelompok kontrol dan tiga kelompok perlakuan, dengan masing-masing
kelompok berjumlah lima ekor, sehingga total jumlah tikus yang digunakan
sebanyak 20 ekor. Kelompok-kelompok tersebut antara lain:
Kelompok kontrol negatif : kelompok tikus yang tidak diberi perlakuan
apapun, hanya diberi makan AD II dan minum aquadest.
Kelompok perlakuan 1 : kelompok tikus yang diberi larutan madu
kelengkeng dengan dosis 0,60 mL/200 g BB tikus.
Kelompok perlakuan 2 : kelompok tikus yang diberi larutan madu
kelengkeng dengan dosis 1,20 mL/200 g BB tikus.
Kelompok perlakuan 3 : kelompok tikus yang diberi larutan madu
kelengkeng dengan dosis 2,30 mL/200 g BB tikus.
Semua hewan uji, kecuali kelompok kontrol negatif, diperlakukan
Hari ke-0, semua hewan uji terlebih dahulu diinjeksi dengan antigen I
berupa suspensi SDMD 1% 2 mL secara peritoneal sebelum diberi larutan
madu kelengkeng dan hari ke-8 dilakukan pula injeksi antigen II sebanyak
0,5 mL pada telapak kaki sebelah kiri secara subkutan, namun sebelum
diinjeksi antigen dan diberi larutan madu kelengkeng, telapak kaki kiri
hewan uji diukur dahulu secara plethysmometrically atau menggunakan
jangka sorong digitalsebagai data pre-DTH. Setelah 24 jam sejak antigen II
dinjeksikan, telapak kaki kiri hewan uji diukur menggunakan jangka sorong
digital sebagai data post-DTH.
7. Pengukuran respon hipersensitivitas tipe lambat (Delayed-Type Hypersensitivity/ DTH)
Pada hari ke-8 telapak kaki kiri tikus secara plethysmometrically
atau menggunakan jangka sorong digital sebagai data pre-DTH. Pada hari
ke-9, tepat 24 jam sejak antigen II diinjeksikan, telapak kaki kiri tikus
diukur lagi secara plethysmometrically atau menggunakan jangka sorong
digital sebagai data post-DTH dengan melihat seberapa peningkatan volume
bengkak telapak kaki kiri tikus. Selisih dari peningkatan volume bengkak
telapak kaki kiri tikus berdasarkan data pre dan post ini lah yang digunakan
F. Analisis Hasil
Data yang diperoleh selanjutnya dievaluasi secara statistik dengan
melakukan uji normalitas dengan metode Kolmogorov-Smirnov dan Levene
test untuk melakukan uji homogenitas data. Data yang terdistribusi normal
dan bervarian homogen (p >0,05) dilanjutkan dengan uji one way ANOVA
dengan taraf kepercayaan 95%, selanjutnya jika terdapat perbedaan yang
29
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian madu
kelengkeng terhadap respon hipersensitivitas tipe lambat atau Delayed-Type
Hypersensitivity (DTH). Respon DTH dapat dilihat dari selisih peningkatan
volume bengkak telapak kaki kiri tikus putih jantan galur Wistar yang merupakan
gejala klinis dari inflamasi dan hasil pengukurannya dianalisis secara statistik
menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui apakah distribusi
normal data, dilanjutkan dengan Levene test untuk mengetahui homogenitas data,
untuk selanjutnya diuji dengan one way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95%.
Jika terdapat perbedaan bermakna pada data dapat dilanjutkan dengan uji post hoc
Tukey.
A. Identifikasi Senyawa Uji
Senyawa uji yang digunakan adalah madu kelengkeng yang diperoleh
dari salah satu distributor madu di Yogyakarta, yaitu PT. Madu Pramuka
(lampiran 3). Tujuan dilakukan identifikasi senyawa uji adalah untuk mengetahui
kebenaran dan keaslian dari madu kelengkeng yang digunakan peneliti, apakah
Ada beberapa cara sederhana untuk mengidentifikasi keaslian madu,
yaitu:
1) Menguji keaslian madu menurut Ihsan (2011), dengan menuangkan madu ke
segelas air, madu murni langsung mengendap dan tidak bercampur dengan
air, jadi air tetap jernih.
2) Menurut Sulaiman (2010), dengan mencairkannya di dalam air yang
massanya lima kali lipat. Biarkan sampai keesokan hari, jika didalamnya
terdapat zat-zat aneh yang mengendap di dasar wadah, berarti madu tersebut
bukan madu yang bagus.
3) Menurut Al-‘Id (2010), bila madu ditumpahkan dalam sebuah bejana atau
wadah dan tetesannya menjadi seperti benang dan tidak terputus, maka madu
yang diuji bukan madu palsu.
4) Cara paling gampang untuk menguji madu adalah dengan mencium bau
madunya, jika tercium aroma madu bercampur dengan aroma tumbuhan yang
madunya dihisap oleh lebah – di mana aroma akan tercium seperti aroma
tumbuhan tersebut – berarti madu itu asli (Sulaiman, 2010).
Hasil yang dilakukan peneliti dengan menggunakan keempat cara di atas
menunjukkan madu kelengkeng yang diuji penguji adalah madu asli, dengan
menunjukkan cairan madu tetap jernih dan langsung mengendap tanpa bercampur
dengan air, tidak terdapat zat-zat asing yang mengendap di dasar wadar ketika
dibiarkan sampai keesokan hari, tetesan madu ketika ditumpahkan ke wadah
peneliti tercium aroma buah kelengkeng sehingga semakin menegaskan madu
yang digunakan peneliti adalah benar dan asli (Lampiran 4).
B. Penyiapan Antigen
Sistem imun tubuh memiliki kemampuan mengenali molekul asing
(antigen) dan membangkitkan respon imun untuk memberikan reaksi yang tepat
dan digunakanlah suspensi Sel Darah Domba Merah (SDMD) 1% sebagai antigen
untuk membangkitkan respon imun tersebut.
SDMD merupakan imunogen, yaitu antigen yang berasal dari gen spesies
lain. Suspensi SDMD 1% dipilih untuk imunisasi karena sifat antigeniknya yang
tinggi dan mudah diperoleh. SDMD juga mudah diukur dan ketika terjadi lisis
maka bisa dibuat lagi dengan mudah serta lebih aman bila dibandingkan dengan
bakteri bila digunakan sebagai antigen.
Pada pembuatan SDMD menjadi supsensi SDMD 1%, dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dengan tujuan untuk
mengendapkan sel darah merah dan memisahkannya dengan bagian plasma.
Lapisan bagian atas yang berupa plasma dibuang dan lapisan bagian bawah yang
berupa endapan sel darah merah ditambahkan larutan Phosphate Buffer Saline
(PBS) steril pH 7,2 sebanyak 3 kali volume SDMD yang tersisa untuk dilakukan
pencucian supaya memastikan semua komponen sel penyusun darah yang
dibutuhkan telah mengendap pada dasar tabung dan menggunakan PBS dengan
pH 7,2 supaya antara darah dan larutan pencuci tetap isotonis dan tidak terjadi
dibolak-balik sampai SDMD tersuspensi secara homogen dan disentrifugasi kembali.
Prosedur ini diulang sampai lapisan atas benar-benar jenih pada lapisan atasnya.
SDMD ini dapat disimpan selama 30 hari dalam kulkas atau es (4oC)
(Mulyaningsih, 2007).
C. Tahap Orientasi Dosis Madu Kelengkeng
Tahap orientasi dosis bertujuan untuk mengetahui dosis yang dapat
mempengaruhi respon DTH, yang selanjutnya akan digunakan pada tahap
percobaan.
Pada penelitian ini, kontrol negatif dibandingkan dengan kelompok
perlakuan dengan tujuan untuk melihat kemampuan tikus dalam merespon reaksi
DTH tanpa dan dengan adanya pengaruh suatu senyawa yang dapat meningkatkan
respon imun.
Penyuntikan perlakuan yaitu pemberian madu kelengkeng secara oral
dengan 3 peringkat dosis, yang dilakukan selama delapan hari berturut-turut
sebagai masa penyesuaian tubuh tikus terhadap pemberian madu kelengkeng yang
diharapkan dapat menimbulkan pengaruh, yaitu berupa peningkatan ataukah
penurunan volume bengkak kaki yang muncul pada telapak kaki kiri tikus ketika
diberikan antigen I pada hari ke-1 dan antigen II pada hari ke-8.
Menurut Subowo (cit., Sasmito, 2006), induksi antigen dilakukan
bertujuan untuk membangkitkan imunitas yang efektif sehingga terbentuk sel-sel
sel-sel memori yang terbentuk akan semakin banyak dan semakin cepat
menimbulkan respon imun yang tepat.
Dalam penelitian ini, induksi SDMD 1% dilakukan sebanyak dua kali
dengan tujuan menurut Hia (2007), induksi pertama akan menghasilkan respon
imun primer yang bertujuan untuk mengenalkan antigen dan mampu membentuk
sel memori yang dapat hidup lama yang berfungsi untuk mengingat antigen ketika
antigen yang sama dipaparkan kedua kalinya.
Induksi antigen I secara peritoneal yang diberikan pada hari ke-0 dan
menurut penelitian dilakukan Zurmiati (2008), pengenalan antigen dilakukan pada
hari pertama bertujuan agar proses pengenalan antigen oleh sel T lebih cepat dan
membentuk sel memori untuk mengingat antigen yang sama ketika dipajankan
untuk kedua kalinya. Diinduksi dengan metode penyuntikan secara peritoneal
dikarenakan metode ini paling sering dipakai dan rongga peritoneal yang relatif
besar sehingga volume antigen yang diinjeksikan dapat lebih banyak dibanding
teknik lainnya. Jika disuntikkan secara intravena dikhawatirkan akan menyumbat
pembuluh darah dan jika disuntikkan secara intramuskular dikhawatirkan dapat
menimbulkan kerusakan lokal jaringan atau otot karena otot yang relatif lebih
kecil areanya. Fase ini disebut fase sensitasi, dimana sel T diaktifkan oleh APC
(Antigen-Presenting Cell) melalui MHC-II dan kemudian mengaktfikan CD4+
terutama Th1. Th1 kadangkala dikenal sebagai limfosit peradangan (Subowo,
2009). Membutuhkan 1-2 minggu setelah kontak primer dengan antigen dan
Pada fase efektor, pemberian antigen kedua atau induksi kedua akan
menghasilkan respon sekunder yang akan mengaktifkan sel-sel memori pada
respon imun primer sebelumnya sehingga menghasilkan respon imun yang lebih
cepat dan lebih spesifik. Induksi antigen II diberikan pada hari ke-8 secara
subkutan di kaki kiri tikus dengan tujuan mempercepat respon DTH pada lokasi
pengukuran bengkak telapak kaki tikus dan hari ke-8 dianggap tepat untuk
diinduksi antigen kedua, karena pada fase efekctor, sel Th1 melepas berbagai
sitokin dan sel-sel imun yang berperan dalam respon DTH dikerahkan menuju
lokasi yang telah diinduksi.
Sebelum disuntik antigen II, kaki kiri tikus diukur dengan jangka sorong
digital sebagai data pre-DTH. setelah disuntik antigen II dan gejalanya baru
tampak sesudah 24 jam, maka diukur lagi sebagai data post-DTH. Tujuan adanya
data pre-DTH adalah berguna sebagai kontrol seberapa besar pembentukan sel
memori dalam pengenalan antigen I dan dibandingkan dengan data post-DTH
setelah penyuntikan antigen II yang dapat menimbulkan respon imun lebih cepat
(dengan membuat bengkak di telapak kaki kiri tikus yang pada penelitian ini
merupakan gambaran klinis dari inflamasi yang diukur) akibat sel memori
sebelumnya yang menjadi aktif. Selisih antara data pre dan post ini lah yang
digunakan dalam pengukuran respon DTH yang nantinya akan menunjukkan
seberapa besar respon DTH yang terjadi. Bila ada antigen (agen infeksi) yang
masuk, maka akan melakukan invasi disertai proses inflamasi pada tempat infeksi
(Basuki, 2005). Reaksi inflamasi termasuk dalam karakteristik reaksi DTH.
respon DTH dapat digunakan sebagai salah satu parameter untuk mengukur
terjadinya respon imun seluler.
Berdasarkan hasil uji Kolmogorov-Smirnov data aktivitas selisih
peningkatan bengkak kaki kiri tikus sebagai respon DTH menunjukkan bahwa
data terdistribusi normal dengan nilai signifikan p= 0,58 (p>0,05) dan dilanjutkan
dengan hasil Levene test menunjukkan varian data yang homogen dengan nilai
p= 0,25 (p>0,05) (Lampiran 8).
Tabel I. Rata-rata±SD Hasil Selisih Peningkatan Volume Bengkak Kaki sebagai Respon DTH pada Tahap Orientasi
Kelompok N Rata-rata ± SD p Kontrol negatif 3 0,84±0,63
Perlakuan I 3 0,84±0,84 0,35(BTB) Perlakuan II 3 1,52±0,52
Perlakuan III 3 1,06±0,55 Ket. Kontrol negatif : tanpa perlakuan
Gambar 3. Grafik Rata-rata±SD Hasil Selisih Peningkatan Volume Bengkak Kaki sebagai Respon DTH pada Tahap Orientasi
Ket. Kontrol negatif : tanpa perlakuan
Perlakuan I : madu kelengkeng dosis 0,60 mL/200 g BB Perlakuan II : madu kelengkeng dosis 1,20 mL/200 g BB Perlaukan III : madu kelengkeng dosis 2,30 mL/ 200 g BB
Hasil pengujian statisik menggunakan one way ANOVA (Tabel 1)
menunjukkan perbedaan tidak bermakna p=0,35 (p>0,05) antara kelompok
perlakuan madu kelengkeng dengan kelompok kontrol negatif. Dilihat pada tabel I
dan gambar 3, dosis pemberian madu kelengkeng 1,20 mL/200 g BB
menunjukkan peningkatan, yang berarti pada pemberian madu kelengkeng dosis
tersebut sudah bisa meningkatkan respon DTH walaupun pada kelompok
perlakuan I madu kelengkeng dosis 0,60 mL/200 g BB dan perlakuan III madu
kelengkeng dosis 2,30 mL/ 200 g BB menunjukkan penurunan nilai rata-rata
dibandingkan kelompok kontrol negatif, namun hasil dari tahap orientasi ini bisa
mendasari untuk dilakukan ke tahap percobaan. 0
Kontrol Negatif Perlakuan I Perlakuan II Perlakuan III
Pertimbangan tetap melanjutkan ke tahap percobaan dengan
mempertahankan dosis pemberian madu kelengkeng yang sudah diteliti di tahap
orientasi dikarenakan beberapa hal, yaitu 1) pemberian madu kelengkeng dosis III
2,30 mL/ 200 gBB menunjukkan penurunan nilai rata-rata (Tabel I) yang berarti
terjadi penurunan respon DTH dan apabila dosis pemberian madu kelengkeng
ditingkatkan dimungkinkan akan semakin menurunkan respon DTH, selain itu
bila dinaikkan dosisnya satu kali lagi menjadi 4,60 mL/200 g BB maka akan
mencapai volume maksimum pemberian oral pada tikus, yaitu 5,00 mL dan
membuat larutan madu kelengkeng akan semakin susah dikeluarkan melalui squit
serta ditakutkan bisa memicu terjadinya stres dan kematian di hewan uji; 2)
pemberian madu kelengkeng dosis I 0,60 mL/200 g BB menunjukkan nilai
rata-rata yang sama dengan nilai rata-rata-rata-rata kontrol negatif (Tabel I) yang berarti pada
dosis I belum bisa memicu terjadinya peningkatan respon DTH yang signifikan
dan apabila dosis diturunkan, dikhawatirkan akan semakin tidak menunjukkan
hasil peningkatan respon DTH.
D. Pengaruh Pemberian Madu Kelengkeng Dosis 0,60 ml/ 200 g BB; 1,20 ml/ 200 g BB; dan 2,30 ml/ 200 g BB Pada Tahap Percobaan
Berdasarkan hasil uji Kolmogorov-Smirnov data aktivitas selisih
peningkatan bengkak kaki kiri tikus sebagai respon DTH menunjukkan bahwa
data terdistribusi normal dengan nilai signifikan p=0,503 (p>0,05) dan hasil
Levene test menunjukkan varian data sudah homogen dengan nilai signifikan
Tabel II. Rata-rata±SD Hasil Selisih Peningkatan Volume Bengkak Kaki sebagai Respon DTH Terhadap Pengaruh Pemberian Madu Kelengkeng
Kelompok n Rata-rata±SD P Kontrol negatif 5 1,28±0,36
0,60(BTB) Perlakuan I 5 1,40±0,24
Perlakuan II 5 1,52±0,49 Perlakuan III 5 1,35±0,43 Ket. Kontrol negatif : tanpa perlakuan
Perlakuan I : madu kelengkeng dosis 0,60 mL/200 g BB Perlakuan II : madu kelengkeng dosis 1,20 mL/200 g BB Perlaukan III : madu kelengkeng dosis 2,30 mL/ 200 g BB (BTB) : berbeda tidak bermakna
Gambar 4. Grafik Rata-rata ±SD Hasil Selisih Peningkatan Volume Bengkak Kaki Sebagai Respon DTH Terhadap Pengaruh Pemberian Madu Kelengkeng Ket. Kontrol negatif : tanpa perlakuan
Perlakuan I : madu kelengkeng dosis 0,60 mL/200 g BB Perlakuan II : madu kelengkeng dosis 1,20 mL/200 g BB Perlaukan III : madu kelengkeng dosis 2,30 mL/ 200 g BB
Hasil selisih peningkatan volume bengkak kaki kiri tikus sebagai tanda
respon DTH terhadap pengaruh pemberian madu kelengkeng menggunakan
statistik one way ANOVA (Tabel II) menunjukkan nilai p = 0,60 (p>0,05),
yang berarti antara kelompok kontrol negatif dengan kelompok perlakuan
pemberian madu kelengkeng terdapat perbedaan tidak bermakna. Dilihat pada 0
Kontrol Negatif Perlakuan I Perlakuan II Perlakuan III
tabel II dan gambar 4, terlihat adanya peningkatan yang lebih tinggi terhadap
respon DTH pada pemberian dosis madu kelengkeng 1,20 mL/200 gBB
dibandingkan dosis pemberian madu kelengkeng 0,60 mL/ 200 gBB dan
mengalami penurunan terhadap respon DTH pada dosis pemberian madu
kelengkeng 2,30 mL/ 200g BB, walaupun masih bisa dikatakan meningkat bila
dibandingkan kelompok kontrol negatif.
Hal ini kemungkinan terjadi karena pengaruh pemberian madu
kelengkeng dalam meningkatkan respon imun dalam tubuh (imunostimulan)
hanya sampai batas tertentu saja, yang apabila batas tersebut sudah tercapai
maka efeknya akan menurun (imunosupressan). Hal ini didukung oleh
pernyataan Sriningsih (2006) yang menjabarkan beberapa contoh penelitian
efek imunitas dari ekstrak ataupun tanaman herbal yang menunjukkan bahwa
efek yang muncul sangat tergantung dari dosis uji, dimana efek
imunosupressan (menekan sistem imun) akan muncul ketika pengujian
dilakukan pada dosis tinggi dan efek imunostimulan (menstimulasi sistem
imun) akan muncul pada dosis rendah. Dikuatkan pula dengan pendapat Sakai
(cit., Ermantianingrum, et al., 2013) bahwa pemberian imunostimulan dengan
dosis tinggi mungkin tidak dapat menaikkan respon sistem pertahanan tubuh,
namun menghambatnya dan menurut Radiati, dkk. (2008), dosis senyawa uji,
teknik pemberian dosis senyawa uji ke dalam tubuh hewan maupun waktu
pemberian antigen yang dapat menentukan kekuatan respon imun yang
Penyebab madu kelengkeng bisa menimbulkan 2 pengaruh yang berbeda
dalam waktu yang bersamaan dimungkinkan karena kandungan senyawa
golongan flavonoid yang berdasarkan penelitian Siddia (2008), memang
ditemukan flavonoid dalam kandungan madu kelengkeng. Menurut Chiang,
Ng, Chiang, Chang, dan Lin (2003), salah satu senyawa yang digunakan
sebagai imunomodulator antara lain flavonoid dan Middleton et all (2000) juga
melaporkan bahwa flavonoid dapat berefek pada sel-sel imun seperti sel T, sel
B, makrofag, sel NK, basofil, sel mast, neutrofil, eosinofil, dan platelet.
Flavonoid dapat mempengaruhi respon imun spesifik secara kompleks karena
memiliki aksi bifase, yaitu flavonoid dapat menstimulasi proliferasi limfosit
pada konsentrasi rendah, namun pada konsentrasi tinggi justru menghambat
(Putri, 2012) dan menurut pendekatan yang dilakukan pada penelitian Arsani
(2010) dalam beberapa kasus, terjadi perbedaan aktivitas dari masing-masing
senyawa, khususnya flavonoid, dalam suatu ekstrak tanaman. Dosis yang
berbeda terkadang juga dapat memberikan efek yang berbeda, misalnya
Scutellaria baicalensis yang mengandung wogonin (salah satu jenis flavonoid)
yang pada konsentrasi rendah dapat meningkatkan produksi nitric oxide
sedangkan pada konsentrasi tinggi dapat menghambbat produksinya. Hal ini
yang mungkin menjelaskan mengapa madu kelengkeng yang mengandung
flavonoid pada dosis 1,20 mL/200 gBB dapat meningkatkan respon DTH,
sedangkan pada dosis yang lebih tinggi tidak mampu meningkatkan respon
Secara keseluruhan, hewan uji yang diberi perlakuan madu kelengkeng
pada berbagai dosis tidak menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna. Hal
ini berarti bahwa pemberian madu kelengkeng tidak memiliki pengaruh berupa
peningkatan respon hipersensitivitas tipe lambat (Delayed-Type
Hipersensitivity/DTH) pada tikus putih jantan galur Wistar. Akan tetapi, hasil
penelitian ini tidak dapat menunjukkan bahwa pemberian madu kelengkeng
tidak mampu mempengaruhi sistem imun karena penelitian ini hanya melihat
salah satu respon imun saja, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
terhadap parameter imunitas lain.
Adapun kelemahan atau kekurangan dari penelitian ini adalah tidak
dilakukannya standardisasi cara pengukuran, baik itu pada alat ukur yang
digunakan maupun pada pemeriksa atau orang yang melakukan pengukuran
sehingga pada penelitian selanjutnya bisa dilakukan pelatihan terhadap
pengukur maupun pemeriksa yang melakukan pengukuran supaya cakap dan
tepat untuk melakukan pengukuran dan kalibrasi pada alat yang bertujuan
untuk menghindari terjadinya bias pengukuran pada metode yang digunakan,
baik itu bias pemeriksa atau pengukur maupun bias alat ukur. Selain itu, dalam
penelitian ini hewan uji digunakan secara bersama dalam dua penelitian
sekaligus, sehingga dikhawatirkan hasil penelitian yang diperoleh saling
mempengaruhi, sehingga hal ini menjadi saran dalam penelitian selanjutnya
akan lebih baik jika tidak digunakan hewan uji secara bersama jika dilakukan
dua penelitian sekaligus agar hasil penelitian yang diperoleh bisa memberikan
42
A. Kesimpulan
Pemberian madu kelengkeng tidak memiliki pengaruh berupa
peningkatan respon hipersensitivitas tipe lambat (Delayed-Type
Hipersensitivity/DTH) pada tikus putih jantan galur Wistar.
B. Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap parameter imunitas lain yang
tidak diamati pada penelitian ini, seperti melakukan uji pengukuran titer
antibodi dan proliferasi limfosit.
2. Perlu dilakukan standardisasi cara pengukuran, baik itu pada alat ukur yang
digunakan maupun pada pemeriksa atau orang yang melakukan pengukuran.
3. Pada penelitian imun selanjutnya, akan lebih baik menggunakan hewan uji
yang terpisah atau tidak menggunakan hewan uji secara bersama dalam
