BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Rancangan penelitian
Jenis penelitian ini adalah analitik observasional, rancangan penelitian cross sectional(potong lintang) dimana variabel bebas dan tergantung diukur padawaktu yang bersamaan.
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara (FK-USU)/RSUP Haji Adam Malik Medan. Penelitian dilakukan pada bulan Maret 2016 sampai dengan akhir Mei 2016.Penelitian dihentikan bila jumlah sampel minimal tercapai atau waktu pengambilan sampel telah mencapai tiga bulan.
3.3. Populasi dan SubjekPenelitian 3.3.1. Populasi Penelitian
Populasi Penelitian adalah pasien dewasa yang datang berobat ke Hematologi di RSUP Haji Adam Malik Medan yang memeriksakan darah lengkap di Departemen Patologi Klinik pada bulan Maret 2016 - Mei 2016.
3.3.2SubjekPenelitian :
Subjek penelitian adalahpasien dewasa penderita β-thalassemia trait yang memenuhi kriteria inklusi.
3.3.2.1. Kriteria Inklusi:
1. Usia reproduktif di atas 18 tahun. 2. Nilai MCV ≤ 80 fl , MCH ≤ 27 pg
3. Pemeriksaan denganHb Elektroforesis nilai HbA2 > 3,5 %
4. Penderita bersedia ikut dalam penelitian dengan menandatangani inform consent. 3.3.2.2. Kriteria Eksklusi12 1. Penyakit Keganasan : 2. Kehamilan 3. Penyakit infeksi 4. Penyakit kelainan hati
5. Penyakit kekurangan zat besi
3.4. Cara Pengambilan Sampel Penelitian
Pengambilan sampel dilakukan secara konsekutif terhadap semua populasi. Jumlah sampel minimal sesuai perkiraan jumlah sampel atau sampai batas waktu pengumpulan sampel yang ditentukan.
3.4.1. Rumus Besar Sampel
Perkiraan besar sampel minimum dan sampel yang diteliti dipakai rumus uji hipotesa untuk proporsi dengan subjek tunggal.
(
)
(
)
2 2 ) 1 ( ) 2 / 1 ( (1 ) ) (1 ) a o a a o o P P P P Z P P Z n − − + − ≥ −α −β Dimana : ) 2 / 1 (−αZ = Deviat baku alpha, untuk
α
= 0,05maka nilai baku normalnya 1,96
) 1 (−β
Z = Deviat baku β, untuk β = 0,10 maka nilai baku normalnya 1,282
0
P
=Proporsi β-thalassemia traitsebesar 0,0407β.a
P
7
=Perkiraan proporsi thalassemia yang diteliti,
ditetapkan sebesar0,25
0
0
P
P
−
= Beda proporsi yang signifikan ditetapkan sebesar 0,20933.5. Variabel Penelitian 3.5.1. Variable Bebas
Hepcidin dan Soluble transferrin reseptor(sTfR)
3.5.2. Variabel Terikat β-Thalassemiatrait
3.6. Ethical Clearance dan Informed Consent
Ethical clearance diperoleh dari Komite Penelitian Bidang Kesehatan FK-USUdi RSUP-Haji Adam Malik Medan No: 315/TGL/KEPK FK USU-RSUP HAM/2016. Inform consent diminta secara tertulis dari subjek penelitian yang menyatakan bersedia ikut dalam penelitian setelah mendapat penjelasan mengenai maksud dan tujuan dari penelitian ini.
3.7.Analisa Data
Analisa data untuk melihat korelasi antara kadar hepcidin dan kadar sTfR pada β-thalassemia trait menggunakan Uji Korelasi Pearsonjika berdistribusi normal, atau Uji Spearman’s rho jika tidak berdistribusi normal. Untuk pemeriksaan dengan test Normality menggunakan cara Shapiro Wilk jika kecil dari 50 sampel dan cara Kolmogrof smirnov jika lebih besar dari 50 sampel.
3.8.Bahan dan Cara Kerja 3.8.1. Bahan yang diperlukan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah darah dengan antikoagulan EDTA dan darah tanpa antikoagulan.
3.8.2. Anamnese dan Pemeriksaan Fisik
Anamnese dilakukan dengan wawancara berpedoman pada daftar pertanyaan pada status dan keterangan yang ada pada status. Pemeriksaan fisik dilakukan pada posisi penderita berbaring. Seluruh data dan hasil pemeriksaan dicatat dalam status khusus penelitian.
3.8.3. Pengambilan dan Pengolahan Sampel 3.8.3.1. Pengambilan SampelDarah
Penelitian dilakukan di RSUP Haji Adam Malik Medan.Sampel darah diambil dari vena mediana cubiti. Tempat punksi vena terlebih dahulu dilakukan tindakan aseptik dengan alkohol 70% dan dibiarkan kering, kemudian dilakukan punksi dengan menggunakan venoject. Pegambilan darah dilakukan tanpa statis yang berlebihan. Sejumlah 7 ml darah vena diambil dan dibagi kedalam tiga tabung masing – masing vacutainer K2EDTA pertama 2 ml, vacutainer K2EDTA kedua 2 ml, dan vacutainer Gel clot activator 3 ml.
3.8.3.2. Pengolahan dan Pemeriksaan Sampel
Darah dengan antikoagulan EDTA pertama dilakukan pemeriksaan FBC dengan menggunakan hematology analyzer untuk memperoleh nilai MCV≤80 fl dan MCH≤27pg. Vacutainer K2EDTA kedua dilakukan pemeriksaan Hemoglobin Elektroforesis. Darah tanpa antikoagulan dibiarkan dalam suhu ruangan selama 30 menit, kemudian disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan serum yang jernih.
3.8.3.2.1.Pemeriksaan Hematologi
Pemeriksaan darah lengkap sebanyak 2ml darah dalam vacutener K2EDTA pertama di homogenkan perlahan. Analisa dengan pemeriksaan full blood count( FBC ) dilakukan dengan menggunakan automatic cell counting Sysmex XN-1000i untuk memperoleh nilai Hb, MCV, MCH dan RDW.
3.8.3.2.2. Pemeriksaan Nilai Kuantitasi HbA2
Sejumlah 2 ml darah dalam vacutener K2EDTA dilakukan analisa Hemoglobin Elektroforesis Kapiler untuk melihat nilai kuantitasi HbA2 dengan menggunakan alat Minicapilarry electrophoresis dari Sebia (Sebia, Norcross, GA).Pada metode minicapilarry electrophoresis HbA2 dapat dipisahkan dari HbE, HbC dan HbS. Sistem MINICAP menggunakan prinsipelektroforesis kapiler pada larutan bebas.
denganmolekul yang bermuatan dipisahkan berdasarkan mobilitas elektroforesis pada larutan buffer alkali elektroosmotik yang bergerak menuju katoda, sehingga akan menyebabkan aliran buffer dari anoda ke katoda.
3.8.3.2.3. PemeriksaanHepcidin
Pemeriksaan hepcidin serum dengan alat Chemwell analyzer menggunakan metode ELISA.Sampel dikumpulkan dan dilakukan sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatant yang diperoleh segera disimpan pada suhu -200 C(2 bulan).Pengukuran dilakukan dengan menggunakan spectrophotometer dengan panjang gelombang 450 nm (warna biru).Kadar normal hepcidin 27 – 158 ng/mL.56
hepcidin Cat No.Qy-E01240, Lot:04/2016(96T)
Sebelum menjalankan sampel terlebih dahulu dilakukan kurva kalibrasi dengan pengenceranstandard diluent dengan konsentrasi : 120; 60; 30; 15; 7,5; 0 ng/ml (gambar 3.1. grafik kalibrasi hepcidin).
Gambar 3.1.grafik kalibrasi hepcidin Bahan yang digunakan pemeriksaan hepcidin
1. Reagen (2-80 2. 96 wells
C)
3. Standard 120ng/ml
4. Standard diluent (ready to use) 5. Special diluent (ready to use)
6. HRP (Horseradish peroxidase)-Conjugate reagent (ready to use) 7. Wash solution
8. Chromogen Solution A&B (ready to use) 9. Stop Solution (ready to use)
10. Microplate Sealers
Cara kerja hepcidin :
1. Sebelum menggunakan sampel dan reagen tersebut terlebih dahulu, bahan yang beku dibiarkan mencair sampai pada suhu ruang, kemudian disama-ratakan dengan vortex. Larutan standard juga disamakan dengan suhu ruang (20-25̊ C).
2. Persiapkan standard diluent dengan konsentrasi : 120; 60; 30; 15; 7,5; 0 ng/ml
3. Setelah bahan disiapkan, siapkan strip mikroplat untuk pemeriksaan.
4. Tambahkan 40μL special diluent, dan 10μL sampel dan 50μL HRP 60 menit.
5. Cuci mikroplat 5 kali dan tambahkan Chromogen Solution A dan B, inkubasi selama 10 menit pada suhu 370
6. Tambahkan 50μL stop solution, tunggu selama 5 menit. C.
7. Kalkulasikan.
8. Tentukan densitas optiknya dalam 15 menit menggunakan pembaca mikroplat sampai 450nm.
9. Semuanya dilakukan secara automatic oleh alat.
3.8.3.2.4. Pemeriksaan sTfR
Pemeriksaan sTfR serum dengan alat Chemwell analyzer menggunakan metode ELISA. Sampel dikumpulkan dan dilakukan sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatant yang diperoleh segera disimpan pada suhu -20 0 C (2 bulan). Pengukuran dilakukan dengan menggunakan spectrophotometer dengan panjang gelombang 450 nm (warna biru).Kadar normal dewasa sTfR adalah 2800 – 8500 ng/mL.57Sebelum menjalankan sampel terlebih dahulu dilakukan kurva kalibrasi dengan pengenceranstandard diluent dengan konsentrasi : 1000; 500; 250; 125; 62,5; 0 ng/ml(gambar 3.2. grafik kalibrasi sTfR)
sTfR Cat No.Qy-E02439, Lot:04/2016(96T)
Gambar 3.2. Grafik kalibrasi sTfR
Bahan yang digunakan pemeriksaan sTfR : 1. Reagen (2-80
2. 96 wells
C)
3. Standard 1000ng/ml
4. Standard diluent (ready to use) 5. Special diluent (ready to use)
6. HRP (Horseradish peroxidase)-Conjugate reagent (ready to use) 7. Wash solution
8. Chromogen Solution A&B (ready to use) 9. Stop Solution (ready to use)
Cara kerja sTfR :
1. Sebelum menggunakan sampel dan reagen tersebut terlebih dahulu, bahan yang beku dibiarkan mencair sampai pada suhu ruang, kemudian disama-ratakan dengan vortex. Larutan standard juga disamakan dengan suhu ruang (20-25̊ C).
2. Persiapkan standard diluent dengan konsentrasi : 1000; 500; 250; 125; 62,5; 0 ng/ml
3. Setelah bahan disiapkan, siapkan strip mikroplat untuk pemeriksaan.
4. Tambahkan 40μL special diluent, dan 10μL sampel dan 50μL HRP 60 menit.
5. Cuci mikroplat 5 kali dan tambahkan Chromogen Solution A dan B, inkubasi selama 10 menit pada suhu 370
6. Tambahkan 50μL stop solution, tunggu selama 5 menit. C.
7. Kalkulasikan.
8. Tentukan densitas optiknya dalam 15 menit menggunakan pembaca mikroplat sampai 450nm.
Gambar 3.3.Skema Prosedur Kerja
3.9. Pemantapan Kualitas
Pemantapan kualitas dilakukan untuk menjamin dan mendapatkan hasil pemeriksaan yang baik. Sebelum dilakukan pemeriksaan terlebih dahulu dilakukan persiapan yang cukup untuk menghindari kesalahan dalam pemeriksaan. Prosedur yang harus diperhatikan adalah preanalitik, analitik dan postanalitik.
3.9.1. Pemantapan KualitasPemeriksaan FBC
Dilakukan dengan menjalankan program kontrol pada Sysmex XN-1000imenggunakan bahan kontrol berbentuk cair yang sudah siap pakai yang telah diketahui nilainya, yaitu bahan kontrol rendah, normal dan tinggi.
Tabel.3.1. Kontrol kualitas Pemeriksaan Hematologi XN-1000-1-A
Tanggal Bahan Lot No. Running
17/03/2016 s/d 01/04/2016
Kontrol rendah QC-60251101 15 sampel Kontrol normal QC-60251102
Kontrol tinggi QC-60251103 01/04/2016
s/d 15/04/2016
Kontrol rendah QC-60251101 10 sampel Kontrol normal QC-60251102
Kontrol tinggi QC-60251103 19/04/2016
s/d 03/05/2016
Kontrol rendah QC-60811101 3 sampel Kontrol normal QC-60811102
Kontrol tinggi QC-60811103
(Grafik hasil kontrol kualitas pemeriksaan hemaologi XN-1000-1-A terlampir)
3.9.2. Pemantapan Kualitas Pada Pemeriksaan Hb Elektroforesis Sebelum menjalankan sampel dijalankan bahan kontrol normal berbentuk cair yang sudah siap pakai yang telah diketahui nilainya, dimana HbA terletak pada zona 9 dengan nilai 96,8-97,8% dan HbA2 terletak pada zona 3 dengan nilai 2,2-3,2%.
3.10. Batasan Definisi Operasional
β-thalassemia trait : Kelainan herediter yang ditandai dengan ketidak seimbangan sintesa rantai globin-β.
Hepcidin
7,31
: Hormonyang disekresikan oleh sel hepar atau hepatosit. Hepcidin bersirkulasi di dalam plasma darah dan dieksresikan melalui urin.
Nilai normalHepcidin: 27 – 158 ng/mL. 14,15
sTfR
56
: (Soluble transferrin reseptor)
Suatu glikoprotein dengan berat molekul sekitar 95 kDa, yang merupakan komponen ekstra membran dari reseptor transferin yang terlepas dan terlarut dalam serum dan beredar dalam sirkulasi.
Nilai normal sTfRdewasa : 2800 – 8500 ng/mL.
46
Ineffektif Eritropoiesis
57
: Sejumlah sel eritroid mati sebelum atau segera setelah lepas dari sumsum tulang.29
3.11. Kerangka Kerja
Subjek Penelitian: Dewasa β-thalassemia trait
di RSUP-Medan Anamnesa Insklusi :
Sampel penelitian
Hepcidin
sTfR
Eksklusi :BAB IV
HASIL PENELITIAN 4.1. Karakteristik Subjek Penelitian
Dari 28 penderita β-thalassemia trait yang datang memeriksakan darah lengkap di Departemen Patologi Klinik pada bulan Maret 2016 - Mei 2016 ke RSUP - H. Adam Malik Medan. Pada penelitian ini didapati 28 penderita β-thalassemia trait dengan kisaran umur 24 – 57 tahun dan rerata umur 34,5 tahun, menunjukan sebagian besar subjek penelitian adalah laki-laki sebanyak 15 orang, dibanding perempuan sebanyak 13 orang (dapat dilihat pada tabel 4.1).
Tabel 4.1. Karakteristik subjek berdasarkan Jenis Kelamin dan Umur
Karakteristik Satuan Hasil
n Umur - Min-Max - Median Jenis Kelamin − Laki-laki − Perempuan Orang Tahun Tahun Orang Orang 28 24 - 57 34,5 15 13
4.2. Hasil pemeriksaan laboratorium Skrining Thalassemia
Pada penelitian ini, subjek β-thalassemia trait di dapati nilai rerata Hb adalah 12,3±1,42 g/dl.Nilai rerata MCV adalah 70,4±6,89 fl, nilai rerata MCH adalah 22,1±2,82 pg, dengan morfologi eritrositmikrositer hipokrom. Nilai Median (Min - Max) RDW adalah 15,1 (13 - 22,50) % dan nilai rerata HbA2 adalah 4,4 ± 0,37 % di dapati peningkatan HbA2 > 3,5%.
Tabel 4.2. Hasil Pemeriksaan Indeks Eritrosit Penderita
Karakteristik Satuan Hasil
Hb (Mean±SD) MCV (Mean±SD) MCH (Mean±SD)
RDW Median (Min - Max) HbA2 (Mean±SD) g/dl fl pg % % 12,3±1,42 70,4±6,89 22,1±2,82 15,1 (13 - 22,50) 4,4± 0,37
4.3.Hubungan antara kadar hepcidin dan kadar sTfR pada β-thalassemia trait
Untuk mengetahui hubungan antara kadar hepcidin dan kadar sTfR pada β-thalassemia trait dilakukan dengan Uji Spearman's rho. Diperoleh hasil koefisien korelasi positif kuat yaitu(r=0,613), yang signifikan mempunyai nilai statistik p=0,001 (signifikan bila p< 0,01). Pada tabel 4.3 dapat dilihat dari subjek penelitian nilai Median (Min-Max) hepcidin adalah
11,1(5,35-36,8)ng/mL, nilai Median (Min – Max) sTfR adalah 58,8(21,4-239,9)ng/mL.
Tabel 4.3. Hasil Pemeriksaan Hepcidin dan sTfR pada Subjek Penelitian
Karakteristik Satuan Hasil
hepcidin Median(Min-Max) ng/mL 11,1 (5,35-36,8)
sTfR (Min-Max) ng/mL 58,8(21,4-239,9)
Korelasi antara hepcidin dan sTfR pada penelitian ini dari subjek 28 penderita β-thalassemia trait dapat dilihat pada grafik 4.1 menunjukkankoefisien korelasi positif kuat antara kadar hepcidin dan sTfR pada penderita β-thalassemia trait, dengan hasil Uji Spearman's rho (r=0,613).yang signifikan dengan nilai statistik p=0,001 (signifikan bila p< 0,01)
Gambar 4.1. Grafik korelasi antara hepcidin dan sTfRpada penderitaβ-thalassemia trait
BAB V PEMBAHASAN
Dari penelitian didapati nilai rerata MCV adalah 70,4 fl, nilai rerata MCH adalah 22,1 pg, nilai ini didukung penelitian dari Long X et all tahun 2014, dimanapada pemeriksaan darah lengkap di jumpai nilai MCV≤80 fl dan nilai MCH≤27 pg, anemia mikrositer hipokrom. Dan nilai ini sesuai dengan standard emas yang direkomendasikan oleh WHO (1994).
Hepcidin yang ditemukan pada tahun 2000, memperluas pemahaman para ilmuwan mengenai gangguan homeostasis besi pada anemia dengan iron-overload, seperti yang terjadi padathalassemia.
7,39,40
9,12
Penelitian tentang hepcidin oleh Origa R dan peneliti dari University of California pada tahun 2007, kadar hepcidin pada β-thalassemiaintermedia menurun oleh karena eritropoiesis inefektif. Sebaliknya kadar hepcidin pada β-thalassemia mayor meningkat karena adanya transfusi darah yang rutin maka akan menginduksi akumulasi besi di jaringan, tetapi menghambat aktivitas eritropoiesis.12
Pada β-thalassemiatraitdengan anemia dapat terjadi penumpukan zat besi (iron-overload) dengan melihat kadarhepcidinyang menurun. Peningkatan aktivitas eritropoietik dan penyesuaiannya dengan
Pada penelitian ini nilai kadar hepcidinmenurun adalah Median (Min-Max) 11.1 (5,35-36,8)ng/mL, nilai ini berdistribusi tidak normal dinilai dengan tests of Normality menggunakan Shapiro-Wilk dengan sampel kecil dari 50, sesuai dengan penilitian sebelumnya.
berkurangnya hepcidin yang disebabkan oleh iron-overload menekan signal untuk tidak memproduksi hepcidin. Peningkatan aktivitas eritropoietik yang secara signifikanmengurangi kadar hepcidin. Iron serum merupakan suatu signal induksi untuk produksi hepcidin dan mempengaruhi soluble transferrin reseptor.
Kadar sTfR berhubungan langsung dengan peningkatan massa precursor eritroid dibandingkan dengan ambilan (uptake) transferrin eritroid. Ini menunjukan bahwa sTfR dapat dipakai sebagai ukuran kuantitatif eritropoesis total.
48,58
14,15
Pada penelitian ini nilai sTfR menurundengan Median (Min-Max) 58,8 (21,4- 239,9) ng/mL, nilai ini berdistribusi tidak normal dinilai dengan tests of Normality menggunakan Shapiro-Wilk nilai ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Zimmerman 2008. Ekspresi hepcidin diregulasi terutama oleh peningkatan aktivitas eritropoesis daripada dibandingkan iron- overload dan hepcidin memainkan peran penting dalam mengatur sirkulasi besi dan toksisitas besi pada penderita thalassemia. Dengan kombinasi kedua parameter ini akan lebih tepat untuk menentukan hubungan eritropoesis inefektif pada thalassemia trait antara kadar Hepcidin dan kadar sTfR.
Manifestasi klinis β-thalassemia trait biasanya ringan dan umumnya pasien memiliki kualitas hidup yang baik.
17
39,58
Pada penelitian ini terdapat hubungan positif kuat antara kadar hepcidin dan sTfR pada penderita β-thalassemia trait dengan hasil Uji Spearman's rho (r=0,613),
dan menunjuk bahwa terdapat korelasi yang signifikan mempunyai nilai statistik p=0,001 (signifikan bila p< 0,01).
Zat besi yang berlebihan di dalam tubuh akan membawa sejumlah kerugian, antara lain adalah terbentuknya radikal bebas. Oleh karena itu diperlukan mekanisme regulasi yang dapat mengatur jumlah zat besi yang beredar. Salah satu protein yang bertanggung jawab untuk meregulasi kadar zat besi adalah hepcidin.
Pada penelitian ini menunjukkan bahwa pada β-thalassemia traitterjadi iron-overload dapat dilihat dengan menurunnya kadar hepcidin dan berkurangnya kadar sTfR terlebih dahulu yang diakibatkan oleh aktivitas eritropoeisis yang inefektif.
BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan
Pada penelitian ini terdapat hubungan positif kuat antara kadarhepcidin dan sTfR pada penderita β-thalassemia trait. Dari penelitian ini didapati median(Min-Max) Umur adalah 34,5(24-57). Ditinjau dari karakteristik jenis kelamin didapati lebih besar jumlah penderita laki-laki dibanding jumlah penderita perempuan.Nilai median (Min-Max) hepcidin adalah 11,1(5,35-36,8)ng/mL dan nilai median (Min-Max) sTfR adalah 58,8(21,4-239,9) ng/mL.
6.2. Saran
Oleh karena penelitian tentang hepcidin dan sTfR masih sangat sedikit maka dianjurkan untuk melakukan penelitian pada kasus – kasus yang lain.
