INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO 4 )

INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA

DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO

4

)

Oleh

RHENI HAFIDIANA F34102016

2006

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan

Tembaga Sulfat (CuSO

4

)

Ringkasan

Sukrosa (glucose-1,2 fructose) merupakan pemanis yang banyak dikonsumsi dalam kehidupan manusia. Gula biasanya diartikan sebagai sukrosa untuk penggunaan komersial. Sumber sukrosa umumnya didapatkan dari nira, seperti nira tebu, nira kelapa, nira siwalan maupun dari bit. Kandungan sukrosa dalam masing-masing nira tersebut berbeda, yaitu nira tebu mengandung 14 - 20% sukrosa, nira kelapa mengandung 15 - 20% sukrosa dan nira siwalan mengandung 10 - 15% sukrosa.

Degradasi sukrosa merupakan hal yang harus dihindari pada industri gula karena mempersulit proses kristalisasi. Hal ini disebabkan oleh hidrolisis sukrosa menjadi gula invert, disebut juga gula pereduksi (glukosa dan fruktosa) atau senyawa turunan lainnya pada produk-produk gula seperti sukrosa, merupakan penyebab menurunnya kualitas produk tersebut. Inhibisi aktivitas enzim telah dilakukan dengan mengkombinasikan suhu dan tekanan tinggi, namun mempengaruhi kualitas produk. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu, pH, konsentrasi enzim konsentrasi substrat, serta adanya inhibitor. Inhibitor dapat berupa bahan alami, seperti kentang, tomat dan tembakau. Akan tetapi, selain mengandung inhibitor, bahan tersebut masih mengandung bahan lain, sehingga perlu pemurnian. Kation Cu (II) dalam bentuk garam logam CuCl2 talah diteliti

dapat menghambat aktivitas invertase. Terdapat garam Cu (II) lainnya, yaitu CuSO4. Aktivitas invertase dengan penambahan garam logam CuSO4 pada

kondisi konsentrasi, konsentrasi substrat, pH, suhu dan lama pemanasan yang berbeda perlu diteliti, sehingga diketahui kemampuan inhibisi garam logam tersebut. Selain itu, dapat diketahui model kinetika inhibisi yang penting untuk keperluan rekayasa proses.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan hubungan perubahan pH, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu inkubasi dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa. Penelitian ini

juga bertujuan untuk menentukan parameter kinetika laju degradasi (KM dan

Vmaks) sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4. Keseluruhan pengujian

menggunakan metode pengukuran gula pereduksi yang dihasilkan akibat hidrolisis sukrosa menggunakan DNS (dinitro salicylic acid). Pengaruh perubahan faktor pada setiap taraf ditentukan dengan menggunakan analisis sidik ragam (Anova) dan uji lanjut Duncan. Model dan parameter kinetika inhibisi yang paling sesuai ditentukan dengan menggunakan software SigmaPlot.

Inhibisi oleh CuSO4 terhadap invertase dipengaruhi oleh perubahan

konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan. Pada rasio konsentrasi invertase terhadap sukrosa 1 : 5000 dan pH larutan invertase 4.5, CuSO4 0.75-1.25 mM berperan sebagai aktivator invertase, sedangkan mulai

konsentrasi 2.5 mM berperan sebagai inhibitor. Konsentrasi CuSO4 0.125 mM

pH 3 dan pH 7 ke atas serta turun signifikan hingga 20 detik pemanasan. Inhibisi oleh CuSO4 0.125 mM terjadi pada lama pemanasan 0 – 10 detik.

Kinetika inhibisi laju degradasi sukrosa oleh CuSO4 yang dilakukan pada

pH 7 dengan tiga titik suhu (40°C, 50°C, 60°C) menghasilkan nilai KM dan Vmaks

yang berbeda. Kecepatan reaksi meningkat dengan kenaikan suhu. Model kinetika inhibisi invertase oleh CuSO4 berbeda pada setiap suhu yang diujikan. Model

inhibisi oleh CuSO4 pada suhu 40°C adalah mixed (partial), dengan nilai KM 8.6

g/l, Vmaks 288.4 µM/menit turun menjadi 64.1 µM/menit, Ki 0.5817 mM, α 75.1, β

3.1. Model inhibisi oleh CuSO4 pada suhu 50°C juga mixed (partial) dengan nilai

KM 21.1 g/l, Vmaks 356.6 µM/menit turun menjadi 69.02 µM/menit, Ki 2.873e-9

mM, α 1201.3, β 232.5. Model inhibisi pada suhu 60°C bersifat kompetitif (full), dengan nilai KM 3555e+6 g/l naik menjadi 4.622e+6 g/l, Vmaks 1.732e+7

Inhibition on Invertase Activity in Sucrose Using

Copper Sulphate (CuSO

4

)

Summary

Sucrose (glucose-1,2 fructose) is the most commonly used as sweetener for human consumption. In commercial usage, the term “sugar” usually refers to sucrose. There are a number of sugar’s sources, such as sugarcane, coconut-palm juice, fan-palm juice and sugar beets which content of sucrose are different. Sugarcane contains 14-20% sucrose, coconut-palm juice contains 15-20% sucrose, while 10-15% in fan-palm juice.

Sucrose is widely used in industry for various purpose, but the degradation of sucrose is easily occured. Sucrose is converted into invert sugar, called reducing sugar or other derived compounds in many sugar products can cause decreasing quality of sugar. Enzyme inhibition is done by combining the temperature and high pressure, but it’s influence the quality of the product. Enzyme activity was influenced by temperature, pH value, enzyme concentration, substrate concentration, and presence of inhibitors. Inhibitors can be found natural sources, such as potato, tomato, and tobacco. Besides containing inhibitor, they still contain other ingredients, therefore purification is needed. Cu (II) cation as CuCl2 metal salt is known as element which can inhibit the activity of invertase.

There are another Cu (II) as metal salt, it is CuSO4. The activity of invertase with

addition of CuSO4 in different enzyme concentration, substrate concentration, pH,

temperature and heat treatment should be learn, in order to recognize the inhibition capability of CuSO4. Besides that, the inhibition kinetic model can be

figured out, which is needed for process engineering.

The objective of this research is to obtain the influence of substrate concentration, enzyme concentration, pH value, incubation temperature and heat treatment with present of CuSO4 concerning to sucrose degradation. Besides that,

it was also to determine the inhibition kinetic parameter (KM and Vmaks) of the rate

of sucrose degradation with addition of CuSO4. The whole research uses the

reducing sugar measurement method, as a result of sucrose hydrolisis using DNS (dinitro salicylic acid). The influence of factor’s changes in each level are determined by using analysis of variance (ANOVA) and Duncan test. The most suitable model and parameter of inhibition kinetic is determined by using SigmaPlot software.

CuSO4 concentration, substrate concentration, enzyme concentration, pH

value, incubation temperature and heat treatment affect inhibition by CuSO4. At

the ratio of invertase to sucrose is 1 : 5000, CuSO4 0.75 - 1.25 mM can be used as

an invertase activator, while as invertase inhibitor with the minimum concentration 2.5 mM. CuSO4 0.125 mM give maximum inhibition (95.1%) at

60°C, pH value of invertase is 4.5, ratio of invertase to sucrose is 1 : 2500. Invertase activity is very low at pH 3 and more than pH 7. The activity was also decreases significantly until 20 second of heat treatment. Inhibition was occured by 0 – 10 second of heat treatment.

The kinetic inhibition of of sucrose degradation rate by CuSO4 0.125 mM

done at pH 7 with three temperature treatment (40°C, 50°C, 60°C) make KM and

Vmaks value are vary. The reaction rate of it increases as well as the temperature.

The inhibition kinetics model of invertase is different in each temperature. It is mixed (partial) when the temperature at 40°C. KM 8.6 g/l, Vmaks 288.4 µM/min

decrease to 64.1 µM/min, Ki 0.5817 mM, α 75.1, β 3.1. The inhibition kinetic model when the temperature at 50°C was also mixed (partial). KM 21.1 g/l, Vmaks

356.6 µM/menit decrease to 69.02 µM/menit, Ki 2.873e-9 mM, α 1201.3, β 232.5, while competitive (full) at 60°C with KM 3555e+6 g/l increase to 4.622e+6 g/l,

SURAT PERNYATAAN

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul “Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO4)”

adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen Pembimbing Akademik, kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya.

Bogor, 31 Agustus 2006 Yang membuat pernyataan,

Rheni Hafidiana F34102016

INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA

DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO

4

)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

Pada Departemen TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh

RHENI HAFIDIANA F34102016

2006

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO4)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

Pada Departemen TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh

RHENI HAFIDIANA F34102016

Dilahirkan pada tanggal 18 Juni 1984 di Boyolali

Tanggal lulus : 24 Agustus 2006

Menyetujui, Bogor, September 2006

Prayoga Suryadarma, STP, MT. Pembimbing Akademik

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Boyolali pada tanggal 18 Juni 1984. Penulis adalah anak ketiga dari empat bersaudara

dari pasangan Widodo (Alm) dan Muslichah. Pada tahun 1996, penulis menyelesaikan pendidikan sekolah dasar

di SDN 3 Boyolali. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah di SLTPN 1 Boyolali pada tahun 1999. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMUN 1 Boyolali dan lulus pada

tahun 2002.

Penulis melanjutkan pendidikan di Perguruan Tinggi Negeri, Institut Pertanian Bogor tahun 2002 melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) di Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian. Selama kuliah di IPB, penulis pernah menjadi asisten praktikum pada mata kuliah Laboratorium Lingkungan periode 2005/2006 dan Teknologi Minyak Atsiri dan Kosmetika periode 2005/2006.

Penulis melaksanakan praktek lapang pada tahun 2005 dengan topik “Penerapan Aspek Pengawasan Mutu pada Proses Produksi Biskuit Bayi di PT. Arnott’s Indonesia-Bekasi, Jawa Barat”. Untuk menyelesaikan tugas akhir ini, penulis melakukan penelitian yang dituangkan dalam skripsi berjudul ”Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO4)”.

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan berkat, rahmat, dan hidayah serta kemudahan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Skripsi ini dibuat sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian.

Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada: 1. Prayoga Suryadarma, STP, MT selaku dosen pembimbing akademik yang

telah banyak memberikan arahan dan bimbingan , pada saat penelitian dan dalam penyusunan skripsi ini.

2. Dr. Ir. Erliza Noor selaku dosen penguji atas masukannya untuk penyempurnaan skripsi ini.

3. Drs. Purwoko, MSi selaku dosen penguji atas masukannya untuk penyempurnaan skripsi ini.

4. Ibu, kakak dan saudara kembarku yang selalu memberikan dukungan, semangat dan doa.

5. Teman sebimbingan (Rian, Annisa, Mba Fitri, dan Pak Ikhsan) atas bantuan dan kebersamaannya.

6. Teman-teman TIN 39 dan semua pihak yang telah memberikan bantuan kepada penulis baik selama penelitian maupun semenjak menjadi mahasiswa TIN yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang dapat membangun dan bermanfaat demi perbaikan skripsi ini. Semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi pembaca.

Bogor, Agustus 2006

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR... x

DAFTAR ISI... xi

DAFTAR TABEL ... xiii

DAFTAR GAMBAR... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xvii

I. PENDAHULUAN ... 1

A. LATAR BELAKANG ... 1

B. TUJUAN... 2

II. TINJAUAN PUSTAKA ... 3

A. SUKROSA... 3

B. INVERTASE ... 3

C. AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM... 4

D. FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI LAJU DEGRADASI SUKROSA ... 5

1. Pengaruh Suhu ... 5

2. Pengaruh pH... 5

3. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Enzim ... 6

4. Pengaruh Perubahan Kondisi Lingkungan ... 7

5. Pengaruh Inhibitor ... 7 E. KINETIKA ENZIMATIK ... 10 III. METODOLOGI ... 15 A. ALAT... 15 B. BAHAN ... 15 C. METODE PENELITIAN ... 15 1. Tahapan Penelitian ... 15 2. Prosedur Percobaan ... 17

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... 21

A. Aktivitas Invertase... 21

B. Pengaruh Konsentrasi CuSO4... 22

C. Hubungan Pengaruh Perubahan Faktor Terhadap Degradasi Sukrosa ... 24

1. Pengaruh Konsentrasi Substrat ... 24

2. Pengaruh Konsentrasi Enzim... 27

3. Pengaruh pH... 30

4. Pengaruh Suhu ... 33

5. Pengaruh Lama Pemanasan ... 36

D. Kinetika Inhibisi Reaksi Invertase ... 38

V. KESIMPULAN DAN SARAN... 45

A. KESIMPULAN... 45

B. SARAN... 45

DAFTAR PUSTAKA... 46

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1. Pengaruh jenis logam dan bahan kimia pada konsentrasi

0.005 M terhadap aktivitas invertase ... 8

Tabel 2. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 40°C... 39

Tabel 3. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 50°C... 41

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase ... 3

Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) ... 5

Gambar 3. Pengaruh nilai pH terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) ... 6

Gambar 4. Ikatan ion logam bivalen (M2+) dan grup sulfhidril... 9

Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (Lehninger, 1988)... 10

Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk ... 11

Gambar 7. Mekanisme inhibisi kompetitif ... 12

Gambar 8. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif ... 12

Gambar 9. Mekanisme inhibisi nonkompetitif. ... 13

Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif. ... 13

Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif. ... 13

Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif. ... 14

Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian. ... 16

Gambar 14. Kurva aktivitas invertase berdasarkan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 25 g/l. Persamaan garis linier y = 3.2267 x, r2 = 0.9721. ... 21

Gambar 15. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit ... 22 Gambar 16. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi substrat terhadap

Gambar 17. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada

konsentrasi substrat yang berbeda, dengan konsentrasi

invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit ... 26

Gambar 18. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi enzim terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit ... 28

Gambar 19. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada konsentrasi enzim yang berbeda, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit... 29

Gambar 20. Kurva pengaruh perubahan nilai pH terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit ... 30

Gambar 21. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada nilai pH yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit ... 33

Gambar 22. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertasi 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit... 34

Gambar 23. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 pada suhu yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit... 36

Gambar 24. Kurva pengaruh lama pemanasan terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit ... 37

Gambar 25. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 pada lama pemanasan yang berbeda dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit ... 38

Gambar 26. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 40°C. ... 39

Gambar 27. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 40°C... 40

Gambar 28. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 50°C. ... 41

Gambar 29. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 50°C... 42

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Prosedur penelitian... 49

Lampiran 2. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan penentuan konsentrasi CuSO4... 50

Lampiran 3. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi substrat ... 51

Lampiran 4. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi substrat yang berbeda ... 54

Lampiran 5. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi enzim... 55

Lampiran 6. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi enzim yang berbeda ... 58

Lampiran 7. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh pH... 59

Lampiran 8. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada pH yang berbeda ... 62

Lampiran 9. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh suhu ... 64

Lampiran 10. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada suhu yang berbeda... 67

Lampiran 11. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh lama pemanasan ... 69

Lampiran 12. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada lama pemanasan yang berbeda... 71

Lampiran 13. Data kinetika inhibisi suhu 40°C ... 73

Lampiran 14. Data kinetika inhibisi suhu 50°C ... 74

I. PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Sukrosa, dengan nama sistematisnya β-D-fructofuranosyl-α-D-glucopyranoside termasuk kelompok disakarida nonpereduksi. Senyawa organik ini merupakan sejenis karbohidrat yang manis, putih dan termasuk bahan dasar makanan. Sumber sukrosa umumnya didapatkan dari nira, seperti nira tebu, nira kelapa, nira siwalan maupun dari bit. Kandungan sukrosa dalam masing-masing nira tersebut berbeda. Nira tebu mengandung 14 - 20% sukrosa, nira kelapa mengandung 15 - 20% sukrosa dan nira siwalan mengandung 10 - 15% sukrosa.

Sukrosa banyak digunakan untuk berbagai keperluan dalam industri, namun kerusakan sukrosa mudah terjadi. Proses degradasi sukrosa menjadi gula invert, disebut juga gula pereduksi (glukosa dan fruktosa) sering terjadi karena lamanya waktu menunggu sebelum nira tebu diproses di industri gula. Selain degradasi sukrosa, senyawa-senyawa hasil degradasi sukrosa tersebut dapat mengganggu proses kristalisasi pada industri gula (sukrosa), sehingga dapat menurunkan rendemen gula sukrosa. Astawan (2001) menyatakan bahwa pembentukan gula invert juga tidak diharapkan pada pengolahan gula semut. Jika kadar gula pereduksinya lebih dari 3 persen maka gula yang dihasilkan akan menjadi lembek dan sangat higroskopis.

Kerusakan gula atau sukrosa dapat disebabkan oleh aktivitas enzim, mikroorganisme ataupun perlakuan proses (misalnya asam, suhu tinggi, dan lainnya). Invertase, merupakan salah satu enzim yang dihasilkan pada nira tebu atau hasil aktivitas ekstraseluler mikroorganisme yang turut memicu kerusakan sukrosa. Aktivitas invertase pada ekstrak nira tebu adalah 417.6 unit, sedangkan aktivitas spesifiknya 2.86 unit/mg (Rahman, 2004). Upaya penghambatan perlu dilakukan untuk mengurangi kerusakan sukrosa, salah satunya dengan menurunkan aktivitas invertase yang mendegradasi sukrosa.

Upaya penghambatan laju kerusakan sukrosa melalui penurunan aktivitas invertase telah dilakukan dengan perlakuan suhu, tekanan serta

penambahan inhibitor. Cavaille dan Didier (1996) mengkombinasikan perlakuan tekanan tinggi dengan suhu untuk menginaktivasi invertase, sedangkan Causette et al. (1998) melakukan inaktivasi enzim dengan menggunakan gelembung gas inert. Akan tetapi, perlakuan suhu dan tekanan yang tinggi akan mempengaruhi kualitas produk (sukrosa) akibat terjadinya reaksi lain yang tidak diinginkan (lateral reaction). Inhibitor invertase juga ditemukan di dalam umbi kentang (Ewing et al., 1977 dan Pressey, 1966), tembakau, dan tomat (Pressey ,1994 dan Weil et al., 1994 dalam Greiner et al., 1998). Inhibitor dari bahan alami tersebut juga memiliki kelemahan, yaitu masih terdapat bahan lain selain inhibitor, bahkan mengandung invertase. Jenis inhibitor lain yang dapat menghambat aktivitas invertase adalah beberapa jenis garam logam, terutama HgCl2, FeCl2, CuCl2, dan CdCl2, yang

dapat menurunkan aktivitas hingga 45-99% (Rahman et al., 2004).

Terdapat garam logam lain, seperti CuSO4 yang juga tersusun dari

kation logam bivalen. Penggunaan garam logam ini memerlukan kondisi tertentu agar dihasilkan kinerja inhibisi invertase yang optimal. Perubahan faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim, seperti konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan perlu dilakukan pada saat garam logam CuSO4 ditambahkan. Perlakuan tersebut diharapkan dapat

menghasilkan profil inhibisi aktivitas invertase dalam mendegradasi sukrosa serta diperoleh model kinetika inhibisi yang penting untuk keperluan rekayasa proses.

B. TUJUAN

Adapun tujuan penelitian ini antara lain untuk menentukan:

1. Pengaruh perubahan pH, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu inkubasi dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO4

terhadap degradasi sukrosa

2. Parameter kinetika (KM dan Vmaks) laju degradasi sukrosa dengan adanya

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. SUKROSA

Sukrosa (glucose-1,2 fructose) merupakan pemanis yang banyak dikonsumsi dalam kehidupan manusia. Salah satu sumber sukrosa terpenting adalah tebu karena mengandung sukrosa hingga 20% (Glazer dan Nikaido, 1995 dalam Filho 1999). Sukrosa, dikenal sebagai gula meja (table sugar), merupakan disakarida yang terbentuk dari satu molekul α-D-glukosa dan satu molekul β-D-fruktosa yang dihubungkan oleh ikatan α-1,2-glikosidik (Rahman et al., 2004).

Degradasi sukrosa dapat terjadi melalui hidrolisis asam atau secara enzimatis oleh invertase (Monsan et al., 1984 dalam Filho et al., 1999). Degradasi secara enzimatis terjadi ketika ikatan α-1,2-glikosidik dihidrolisis oleh enzim invertase (D-fructofuranosidase, EC 3.2.1.26) atau sucrose synthase (UDP glucose: D-fructose 2-D-glucosyltransferase, EC 2.4.1.13). Hidrolisis sukrosa menghasilkan campuran glukosa dan fruktosa yang disebut dengan gula invert (invert sugar) (Rahman et al., 2004). Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase (juga disebut sebagai sucrase atau saccharose) dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase

B. INVERTASE

Sistem tatanama untuk invertase adalah beta-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26), menunjukkan bahwa reaksi dikatalisasi oleh enzim ini adalah reaksi

hidrolisis (Wang, 2002). Invertase terdapat dalam jumlah yang beragam pada tanaman maupun hewan dengan varietas yang luas. Sumber utama invertase berasal dari ragi (yeast) dan fungi lainnya. Reed (1966) dalam Pancoast dan Junk (1980) menyatakan bahwa ragi Saccharomyces cerevisiae dan S. carlsbergensis merupakan sumber utama penghasil invertase untuk aplikasi industri. Aspergillus orizae dan A. Niger adalah fungi yang juga merupakan sumber invertase. Tanaman penghasil enzim ini antara lain tebu (Rahman et al., 2004), buah mangga (Rahman et al., 2001), buah anggur (Nakanishi et al., 1990), buah tomat (Konno et al., 1993 dalam Rahman et al., 2001), padi (Isla et al., 1995) dan umbi kentang (Pressey et al., 1966).

Berbeda dengan sebagian besar enzim, invertase memiliki aktivitas yang relatif tinggi pada kisaran pH yang luas antara 3.5 sampai 5.5, dengan aktivitas optimum pada pH 4.5. Aktivitas maksimum dicapai pada suhu 55°C. Nilai Michaelis-Menten untuk jenis enzim yang berbeda bervariasi, tetapi kebanyakan enzim memiliki nilai KM antara 2 mM – 5 mM (Wang, 2002).

C. AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM

Aktivitas enzim didefinisikan sebagai kecepatan pengurangan substrat atau kecepatan pembentukan produk pada kondisi optimum. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai satu mikromol (µmol; 10-6 mol) substrat yang bereaksi atau produk yang dikatalisis setiap menit (Rodwell, 1981).

Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, pH, dan suhu. Setiap enzim berfungsi optimal pada suhu, pH dan konsentrasi substrat tertentu. Konsentrasi substrat yang rendah menyebabkan daerah aktif pada enzim tidak semuanya terikat pada substrat. Terdapat suhu optimal dimana reaksi berlangsung sangat cepat. Ketika suhu di atas suhu optimal, kecepatan reaksi menurun tajam karena enzim sebagai protein akan terdenaturasi, sedangkan pada suhu terlalu rendah, beberapa enzim tidak dapat bekerja. Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh pH karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah dipengaruhi pH (Pelczar dan Chan, 1986).

Enzim merupakan salah satu jenis protein globular. Stabilitas dan aktivitas enzim ditentukan oleh konformasi tiga dimensinya yang dipengaruhi

oleh struktur tertier protein. Terdapat empat jenis interaksi yang menstabilkan struktur tersebut pada suhu, pH dan konsentrasi ion normal, antara lain ikatan hidrogen, gaya tarik ionik, interaksi hidrofobik dan jembatan kovalen. (Lehninger, 1988).

D. FAKTOR – FAKTOR YANG MEMPENGARUHI LAJU DEGRADASI SUKROSA

Laju degradasi sukrosa dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain suhu, pH, lama pemanasan, konsentrasi substrat dan konsentrasi enzim. Laju degradasi sukrosa dapat diperlambat atau bahkan dihambat dengan penambahan inhibitor.

1. Pengaruh Suhu

Peningkatan suhu pada reaksi enzim memiliki dua pengaruh yang tidak seimbang. Pengaruh tersebut adalah peningkatan laju reaksi dan di sisi lain dapat menyebabkan inaktivasi enzim (Stauffer, 1989). Aktivitas enzim invertase meningkat secara perlahan dengan kenaikan suhu. Suhu maksimum aktivitas invertase adalah 60°C, peningkatan suhu lebih lanjut menyebabkan penurunan laju degradasi sukrosa (Rahman et al., 2004). Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase di dalam tebu dapat dilihat pada Gambar 2. 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 suhu (o_C) A k ti vi ta s r e la ti f ( % )

Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004)

2. Pengaruh pH

Invertase memberikan aktivitas maksimum pada pH 7.2. Aktivitas turun perlahan pada pH asam, tetapi turun secara cepat pada pH basa.

Observasi ini menunjukkan bahwa enzim relatif stabil pada kisaran pH asam sampai pH netral (Rahman et al., 2004). Nilai pH optimum invertase dari benih padi adalah 7.0 (Chungliang et al. dalam Rahman et al., 2004). Gambar 3 menunjukkan pengaruh pH terhadap aktivitas invertase pada tebu (Rahman et al., 2004).

Gambar 3. Pengaruh nilai pH terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004)

Stauffer (1989) menyatakan bahwa perubahan pada laju reaksi enzim oleh pH mungkin dapat disebabkan oleh tiga faktor, yakni:

a. Protonasi sisi aktif rantai asam amino pada kompleks enzim-substrat (ES) berubah, menghasilkan perubahan kemampuan ES dalam menghasilkan produk.

b. Perubahan muatan ion pada molekul substrat atau sisi aktif enzim yang dapat mengubah kecenderungan dari dua molekul tersebut untuk membentuk kompleks ES.

c. Perubahan pH dari netral dapat melemahkan stabilitas protein, mempercepat denaturasi enzim yang bersifat irreversible.

3. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Enzim

Invertase dapat mengkatalisis sukrosa pada konsentrasi di atas 59%wt/vol. Peningkatan konsentrasi sukrosa lebih lanjut sampai 80%wt/vol menurunkan aktivitas enzim secara signifikan, mungkin disebabkan oleh konsentrasi air rendah, inhibisi oleh substrat atau agregasi substrat (Somiari dan Bielecki, 1995 dalam Filho et al., 1999).

Brown pada tahun 1902 melakukan penelitian tentang invertase, menyatakan bahwa jika konsentrasi sukrosa lebih tinggi daripada

konsentrasi enzim, kecepatan reaksi menjadi tidak tergantung pada konsentrasi sukrosa (Pancoast, 1980). Aktivitas enzimatik akan menurun pada konsentrasi substrat yang tinggi dan cenderung membentuk asimtot. Jenis penghambatan ini akan membentuk kompleks (dead end complex), satu sisi molekul substrat terikat pada enzim dan molekul substrat lain terikat pada sisi lain (sekunder) enzim (Suryani dan Mangunwidjaya, 2002).

4. Pengaruh Perubahan Kondisi Lingkungan

Inaktivasi enzim dan mikroorganisme dapat dilakukan dengan perlakuan suhu yang tinggi. Akan tetapi perlakuan suhu yang tinggi juga dapat menyebabkan perubahan produk, sehingga kualitasnya menurun. Metode lain yang dapat digunakan untuk menurunkan aktivitas enzim dan mikroorganisme tanpa merusak produk yang diinginkan adalah dengan cara pemberian gelembung gas inert. Pemberian gelembung gas inert nitrogen mampu menurunkan aktivitas enzim (Causette et al., 1998).

5. Pengaruh Inhibitor

Banyak bahan yang dapat mengubah aktivitas suatu enzim dengan menggabungkannya dalam suatu jalur yang mempengaruhi ikatan substrat. Bahan-bahan yang mereduksi aktivitas suatu enzim dengan cara ini dikenal sebagai inhibitor. Inhibitor terbagi menjadi dua jenis, yakni inhibitor reversible yang membentuk kompleks dinamik dengan enzim dan inhibitor irreversible yang dikenal dengan racun pengkatalis (contohnya beberapa logam berat, seperti merkuri, Hg2+). Inhibitor mengikat molekul enzim dan menurunkan aktivitasnya (Flickinger dan Drew, 1999). Stauffer (1989) juga membagi inhibitor menjadi 3 golongan berdasarkan affinitasnya terhadap molekul enzim sebagai berikut:

a. Inhibitor beraffinitas rendah

Molekul inhibitor ini memiliki konstanta affinitas antara 1 M hingga 106 _{M. Inhibitor ini sering menyerupai substrat dengan}

b. Inhibitor beraffinitas tinggi

Molekul inhibitor ini memiliki konstanta affinitas antara 106 M hingga 1012 M. Inhibitor ini menjadi transisi dari kompleks enzim-substrat menjadi kompleks enzim-produk atau sebagai molekul yang mengikat kuat pada sisi aktif enzim.

c. Inhibitor irreversible

Molekul inhibitor ini membentuk ikatan kovalen dengan molekul pada sisi aktif enzim. Ikatan yang dibentuk bersifat stabil. Reaksi lebih jauh lagi dari enzim dengan inhibitor ini (inhibitor berlebih) menyebabkan enzim menjadi tidak aktif.

Penambahan garam logam dan senyawa kimia lainnya dapat menyebabkan peningkatan atau penurunan aktivitas enzim. Peningkatan dan penurunan aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh jenis garam logam ataupun senyawa kimia yang ditambahkan. Pengaruh penambahan beberapa jenis garam logam dan senyawa kimia lainnya terhadap aktivitas enzim dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Pengaruh jenis garam logam dan bahan kimia pada konsentrasi 0.005 M terhadap aktivitas invertase

No. Garam/bahan kimia Aktivitas relatif (%)

1 Tanpa bahan tambahan 100.00

2 MgCl2 115.00 3 KCl 110.82 4 NaCl 120.00 5 MnCl2 120.00 6 CaCl2 114.24 7 HgCl2 1.02 8 CuCl2 30.00 9 FeCl2 20.25 10 ZnCl2 68.27 11 CdCl2 55.26 12 AgNO3 80.00 13 AlCl3 78.00 14 EDTA 52.74 15 Glukosa 76.00 16 Asam asetat 45.30

Hampir semua ion logam selalu berinteraksi dengan kompleks protein secara cepat. Interaksi kompleks antara ion logam dengan protein ada dua bentuk:

1. Metaloenzim

Ikatan ini merupakan subkelas dari metaloprotein. Protein berikatan kuat dengan ion logam sehingga dianggap sebagai ikatan yang sangat stabil dan lama. Ion logam menjadi bagian dari struktur protein dan hanya dapat dilepas dalam keadaan tertentu.

2. Metal protein

Sistem ikatan ini memungkinkan ion logam mudah saling bertukar dengan protein lain (reversible). Laju pertukaran ion logam dengan kondisi larutan lingkungannya sangat mudah. Ion logam sulit dalam menempati sisi protein yang tepat karena ion logam ini bersifat sangat labil.

Kekuatan ikatan ion logam dengan protein tergantung pada muatan kation yang mengikatnya. Semakin tinggi muatan kation dari logam maka semakin kuat ikatannya dengan protein, sehingga ikatan tersebut lebih stabil dan konstan (Darmono, 1995).

Hochster dan Quastel (1963) menyatakan, ikatan ion logam bivalen dengan grup sulfhidril yang terdapat pada enzim kemungkinan terjadi sebagai berikut:

E dll S

E-SH E-S- _{+ H}+ _{E-S -M}

+ M 2+

E-SH E-SH E-S- + H+

Gambar 4. Ikatan ion logam bivalen (M2+_{) dan grup sulfhidril}

Keterangan:

E-SH = enzim yang memiliki grup sulfhidril H+ = ion H+ yang terlepas

E. KINETIKA ENZIMATIK

Enzim merupakan katalisator sejati. Molekul ini dapat meningkatkan kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa adanya enzim akan berlangsung lambat. Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal apabila konsentrasi enzim dijaga konstan (Lehninger, 1988).

Setiap enzim memiliki sifat yang khas, dinyatakan dalam suatu tetapan yaitu KM (tetapan Michaelis-Menten). Hampir semua enzim memiliki kurva

kecepatan reaksi dengan bentuk umum yang hampir sama yaitu hiperbola. Oleh sebab itu, Michaelis-Menten mendefinisikan suatu tetapan untuk menyatakan hubungan antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik. KM didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat

enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Persamaan Michaelis-Menten adalah:

Vmaks [S]

V0 =

KM + [S]

Keterangan:

V0 = kecepatan awal pada konsentrasi substrat [S]

Vmaks = kecepatan maksimum

KM = tetapan Michaelis-Menten enzim pada substrat tertentu

[S] = konsentrasi substrat

Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (Lehninger, 1988)

Nilai KM dan Vmaks sulit untuk ditentukan secara tepat dari grafik

tidak dapat diketahui nilai yang sebenarnya. Nilai KM yang lebih tepat dapat

diperoleh dengan memetakan data yang sama dengan cara yang berbeda, yakni pemetaan kebalikan-ganda, didapat dari transformasi aljabar persamaan Michaelis-Menten. Hasil transformasi persamaan Michaelis-Menten dikenal dengan persamaan Lineweaver-Burk.

1 KM 1 1

= +

Vo Vmaks [S] Vmaks

Selain dapat menentukan Vmaks secara lebih tepat, persamaan ini bermanfaat

dalam menganalisa penghambatan enzim (Lehninger, 1988). Persamaan Lineaweaver-Burk menghasilkan kurva yang ditunjukkan pada Gambar 6.

Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk

Kinetika inhibisi enzim menyangkut penentuan fungsi laju reaksi terhadap konsentrasi substrat dengan inhibitor pada berbagai konsentrasi. Kurva Lineweaver-Burk memungkinkan untuk menentukan jenis inhibisi yang bersifat reversible, antara lain sebagai berikut.

1. Inhibisi Kompetitif

Inhibitor pada model inhibisi ini bersaing dengan substrat untuk memasuki sisi aktif enzim. Struktur kimia inhibitor umumnya menyerupai substrat. Oleh sebab itu, inhibitor tersebut dapat berikatan secara reversible dengan enzim (Rodwell, 2000). Mekanisme inhibisi kompetitif dapat dilihat pada Gambar 7 .

Gambar 7. Mekanisme inhibisi kompetitif

Penyajian garis lurus pada kurva Lineweaver-Burk memotong sumbu ordinat pada titik yang sama. Vmaks tidak dipengaruhi oleh inhibitor

(Suryani dan Mangunwidjaja, 2002). Kurva Lineweaver-Burk untuk model inhibisi kompetitif ditunjukkan pada Gambar 8.

Gambar 8. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif

2. Inhibisi Nonkompetitif

Model inhibisi nonkompetitif tidak menunjukkan adanya persaingan antara inhibitor dengan substrat. Struktur inhibitor biasanya tidak atau sedikit menyerupai struktur substrat. Inhibitor nonkompetitif menurunkan kecepatan reaksi maksimal yang diperoleh pada pemberian sejumlah enzim (Vmaks yang lebih rendah), tetapi biasanya tidak

mempengaruhi nilai KM, ditunjukkan oleh kurva Lineweaver-Burk pada

Gambar 10. Mekanisme reaksi inhibisi nonkompetitif dapat dilihat pada Gambar 9. EI (inaktif) ES (aktif) E + P E ±I ±S Ditambah inhibitor Tanpa inhibitor 1/V1 -1/KM -1/K’M 1/Vmaks 1/[S] 0

Gambar 9. Mekanisme inhibisi nonkompetitif

Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif

3. Inhibisi Unkompetitif

Inhibisi ini terjadi jika kompleks EI hilang, tetapi kompleks EIS terbentuk. Inhibitor mengikat langsung pada kompleks enzim-substrat (ES), bukan enzim bebas (Flickinger dan Drew, 1999). Mekanisme inhibisi unkompetitif ditunjukkan pada Gambar 11.

Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif

ES E ±S ±I EIS E + P EI ES E ±I ±S E + P EIS ±S Ditambah inhibitor Tanpa inhibitor 1/Vmaks 1/[S] 1/V1 -1/KM -1/Vmaks 0

Inhibitor yang bersifat unkompetitif akan mempengaruhi fungsi enzim, tetapi tidak terhadap ikatannya dengan substrat. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif adalah linier dengan kemiringan atau slope KM/Vmaks seperti pada reaksi tanpa inhibitor, dapat dilihat pada

Gambar 12 (Simanjutak dan Silalahi, 2003).

Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif

1/[S] 1/V1 -1/KM -1/Vmaks 0 Ditambah inhibitor Tanpa inhibitor 1/Vmaks

III. METODOLOGI

A. ALAT

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain peralatan gelas (pipet tetes, corong, tabung reaksi); peralatan ukur (pipet mikro, pipet volumetri, labu takar, termometer, spektrofotometer, stopwatch dan timbangan); serta peralatan pendukung (water bath dan vortex).

B. BAHAN

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sukrosa, invertase (Sigma-Aldrich 19253: pH 4.5, 55°C, 355 units/mg solid), dan larutan CuSO4. Sedangkan bahan yang digunakan untuk analisa adalah NaOH

0.1 N, HCl 0.1 N, indikator PP, glukosa, fruktosa, buffer pH 3-11, pereaksi DNS (dinitro salicylic acid) dan aquades.

C. METODE PENELITIAN

Metode penelitian ini dibagi menjadi tahapan penelitian dan prosedur percobaan. Tahapan penelitian menjelaskan tentang langkah-langkah yang harus dilalui untuk mencapai tujuan penelitian, sedangkan prosedur percobaan merupakan urutan kegiatan dan tatacara yang secara teknis dikerjakan dalam setiap tahapan penelitian.

1. Tahapan Penelitian

Penelitian dilakukan dalam empat tahap, yaitu (1) Penentuan

aktivitas invertase, (2) Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4,

(3) Penentuan hubungan perubahan faktor konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO4

terhadap degradasi sukrosa, (4) Penentuan parameter kinetika (KM dan

Vmaks) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4.

Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian

a. Penentuan aktivitas invertase

Aktivitas enzim diukur berdasarkan definisi satu unit aktivitas

invertase, yaitu banyaknya invertase yang dapat membebaskan 1 mikromol gula pereduksi dari substrat sukrosa selama 1 menit pada

kondisi percobaan. Kondisi yang digunakan adalah kondisi optimum invertase, yaitu pada suhu 55°C, di dalam larutan buffer asetat pH 4.5. Slope yang diperoleh dari gula pereduksi yang dihasilkan pada setiap konsentrasi yang diujikan merupakan besarnya aktivitas enzim.

b. Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4

CuSO4 dengan konsentrasi yang berbeda diujikan pada reaksi

invertase dengan sukrosa. Nilai gula pereduksi yang lebih rendah dari kontrol (perlakuan invertase tanpa CuSO4) menunjukkan adanya

inhibisi, sebaliknya jika lebih tinggi dari kontrol menunjukkan aktivasi. Pengaruh yang berbeda nyata diukur berdasarkan analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan.

Mulai

Penentuan aktivitas invertase

Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4

Penentuan pengaruh perubahan faktor dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa

Penentuan parameter kinetika (KM dan Vmaks) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4

c. Penentuan pengaruh hubungan faktor dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa

Uji karakterisasi invertase yang dilakukan antara lain pengaruh konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan dengan ditambahkan CuSO4. Pengaruh yang diidentifikasi adalah

adanya kenaikan atau penurunan konsentrasi gula pereduksi pada setiap taraf yang diujikan berdasarkan analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan. Inhibisi invertase diukur berdasarkan perbandingan dengan perlakuan tanpa CuSO4, dinyatakan dalam bentuk persen.

d. Penentuan parameter kinetika laju degradasi (KM dan Vmaks)

sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4

Penentuan parameter kinetika dilakukan pada tiga suhu yang berbeda dan pH tertentu yang optimum bagi inhibisi invertase. Model kinetika inhibisi diidentifikasi berdasarkan jenis perubahan nilai parameter kinetika (KM dan Vmaks) yang diperoleh dari plot

Lineweaver-Burk. Nilai KM diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu x,

sedangkan nilai Vmaks diperoleh dari perpotongan garis linier dengan

sumbu y.

2. Prosedur Percobaan

Prosedur percobaan yang dilakukan pada penelitian ini adalah sebagai berikut.

a. Penentuan aktivitas invertase

Larutan invertase 0.01 g/l dan larutan sukrosa 50 g/l disiapkan pada tabung reaksi yang terpisah. Masing-masing tabung reaksi kemudian diinkubasi di dalam water bath suhu 55°C sehingga suhu tersebut dicapai oleh larutan di dalam tabung reaksi. Selanjutnya sukrosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi invertase dan mulai diukur waktu reaksi (t = 0). Reaksi dihentikan pada masing-masing waktu yang diujikan, yaitu 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 (detik), dengan memasukkan 2 ml pereaksi DNS. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95°C. Setelah

10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

b. Penentuan konsentrasi inhibitor

Larutan CuSO4 dibuat dalam beberapa konsentrasi, 0 mM-

3.75 mM. Masing-masing larutan CuSO4 dalam berbagai konsentrasi

dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dan divortex. Selanjutnya ditambahkan 1 ml invertase 0.01 g/l pada masing-masing tabung reaksi (t = 0). Pada saat t = 5 menit, reaksi dihentikan dengan perekasi DNS. Prosedur untuk menghentikan reaksi mengikuti prosedur sebelumnya pada penentuan aktivitas.

c. Penentuan pengaruh perubahan faktor

Penentuan pengaruh perubahan faktor dilakukan dengan maupun tanpa adanya penambahan inhibitor. Prosedur yang dilakukan pada perlakuan tanpa inhibitor sama halnya dengan pengujian pada karakterisasi invertase dengan inhibitor, hanya tidak ditambahkan larutan CuSO4. Total volume larutan dalam tiap tabung reaksi tetap

sama yakni 2 ml, sehingga volume yang ditambah adalah aquades dan buffer.

1. Pengaruh konsentrasi enzim

Larutan invertase 0.01 g/l disiapkan pada berbagai konsentrasi sebanyak 0.0 - 0.83 ml dan ditambahkan larutan buffer pH 7 hingga volumenya 1 ml. Kemudian ditambahkan larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml pada masing-masing tabung

reaksi. Selanjutnya larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 1 ml dimasukkan pada tiap-tiap tabung tersebut, dan mulai dihitung waktunya (t = 0 menit). Pada waktu t = 5 menit, dimasukkan 2 ml pereaksi DNS untuk menghentikan reaksi. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95°C selama 10 menit. Setelah 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

2. Pengaruh konsentrasi substrat

Larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml dimasukkan pada

masing-masing tabung reaksi yang berisi larutan sukrosa 50 g/l dalam konsentrasi yang berbeda. Kemudian aquades ditambahkan hingga volume campuran mencapai 2.0 ml. Larutan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke masing-masing tabung reaksi (t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.

3. Pengaruh pH

Invertase 0.01g/l sebanyak 1.0 ml dilarutkan dengan menggunakan buffer pH yang bervariasi (pH 3 - 11) pada tabung reaksi. Selanjutnya masing-masing tabung reaksi ditambahkan larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml dan0.9 mllarutan sukrosa

50 g/l (t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.

4. Pengaruh suhu

Penangas air mulai suhu 0 - 90oC disiapkan dengan interval suhu 10oC. Pada setiap kelipatan suhu 10oC tersebut, diuji aktivitas invertase. Larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml, 0.4 ml air dan

larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalam setiap tabung untuk setiap kelipatan suhu 10oC. Tabung reaksi selanjutnya dimasukkan ke dalam penangas air pada rentang suhu tersebut dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml ke dalam masing-masing tabung reaksi (t = 0 menit) pada suhu inkubasi. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.

5. Pengaruh lama pemanasan

Larutan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi dan dipanaskan dengan waktu yang bervariasi dari 0 - 5 (menit). Setelah waktu yang diperlukan dicapai, tabung reaksi dikeluarkan dari water bath dan didinginkan.

Setelah itu larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml dan larutan

sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalamnya (t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.

d. Penentuan parameter kinetika

Kondisi inhibisi invertase oleh CuSO4 yang optimum dipilih

(suhu dan pH) yang kemudian pada selang konsentrasi substrat tertentu diuji aktivitasnya dalam menghidrolisis sukrosa.. Hasil yang diperoleh kemudian diplotkan pada kurva kinetika (Lineweaver-Burk), dan dihitung parameter kinetikanya (KM dan Vmaks) serta dibandingkan

antara perlakuan tanpa CuSO4 dan dengan penambahan CuSO4. Nilai

KM dan Vmaks dapat diperoleh dari persamaan linier plot kurva

Lineweaver-Burk. Slope yang diperoleh merupakan KM/Vmaks,

sedangkan intersep menunjukkan 1/Vmaks. Bentuk kurva

Lineweaver-Burk yang diperoleh menunjukkan model kinetika ihibisi. Penentuan model kinetika menggunakan alat bantu program SigmaPlot 2004 for Windows Version 9.01. Program ini menentukan model kinetika inhibisi yang paling tepat berdasarkan nilai r2 _tertinggi.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Kemampuan hidrolisis sukrosa oleh invertase dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim tersebut, sedangkan kemampuan inhibisi garam logam CuSO4

dilihat pada setiap perubahan faktor yang berpengaruh (konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan) terhadap aktivitas enzim serta perubahan parameter kinetika (KM dan Vmaks) inhibisi degradasi sukrosa.

A. Aktivitas Invertase

Penentuan aktivitas invertase penting dilakukan untuk mengetahui seberapa besar perubahan mikromol sukrosa menjadi gula pereduksi setiap menit reaksi. Slope yang diperoleh dari persamaan garis linier adalah 3.2267, yang berarti bahwa invertase mampu menghidrolisis sukrosa 3.2267 µM menjadi glukosa dan fruktosa dalam satu detik atau perubahan 0.3872 µmol sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dalam satu menit. Aktivitas invertase digambarkan dalam bentuk kurva pada Gambar 14.

0 200 400 600 800 1000 1200 0 50 100 150 200 250 300 350

lama reaksi (detik)

k o ns e n tr a s i gu la pe re du k s i ( u M )

Gambar 14. Kurva aktivitas invertase berdasarkan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 25 g/l. Persamaan garis linier y = 3.2267 x, r2 _{= 0.9721}

B. Pengaruh Konsentrasi CuSO4

Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4 sebagai inhibitor dilakukan

berdasarkan uji daya inhibisi CuSO4 terhadap aktivitas invertase. Adanya

inhibisi invertase ditunjukkan dengan menurunnya gula pereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis sukrosa oleh invertase. Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa konsentrasi yang diujikan memberikan pengaruh yang nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dapat dilihat pada Lampiran 2. Konsentrasi gula pereduksi tertinggi diperoleh dari penambahan larutan CuSO4 1.25 mM sebesar 2064.5 µM, sedangkan konsentrasi gula

pereduksi terkecil ditunjukkan oleh penambahan larutan CuSO4 3.75 mM

sebesar 1052 µM. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap aktivitas

invertase dapat dilihat pada Gambar 15.

0 500 1000 1500 2000 2500 0 0.75 1 1.25 1.5 1.875 2.25 2.5 3.75 konsentrasi CuSO4 (mM) k ons e n tr as i gul a pe reduk s i ( u M )

Gambar 15. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap konsentrasi gula

pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit

Hasil uji daya inhibisi menunjukkan bahwa tidak semua konsentrasi CuSO4 yang diujikan menunjukkan adanya penghambatan aktivitas invertase.

Gula pereduksi meningkat signifikan dengan penambahan larutan CuSO4

0.75 mM. Hal ini menunjukkan bahwa CuSO4 pada konsentrasi yang rendah

tidak memberikan pengaruh inhibisi terhadap aktivitas invertase. CuSO4

kecil. Perubahan muatan pada enzim akibat penambahan CuSO4 menyebabkan

enzim mudah dalam mengikat substrat. Hal ini sesuai dengan teori bahwa logam yang ditambahkan dalam bentuk garam organik memberikan kestabilan enzim dengan cara menetralkan kelebihan muatan elektrostatik yang melindungi molekul enzim sehingga konformasi enzim dapat dipertahankan (Monsan dan Combess, 1984). Kation seperti Cu (II) kemungkinan terlibat langsung dalam proses katalisis enzim, yaitu dalam pengikatan substrat ke sisi aktif enzim, dalam menjaga konformasi enzim dan kestabilan substrat (Whitaker, 1996).

Berdasarkan Gambar 15, besarnya penghambatan setelah aktivitas invertase mencapai maksimum meningkat sedikit demi sedikit hingga akhirnya mengalami inhibisi pada konsentrasi CuSO4 2.5 mM. Kemampuan

aktivasi enzim menurun dengan semakin tingginya konsentrasi CuSO4.

Besarnya inhibisi ini berbeda nyata dengan kontrol berdasarkan uji lanjut Duncan, dapat dilihat pada Lampiran 2. Gula pereduksi yang dihasilkan pada konsentrasi CuSO4 2.5 mM adalah 1503.25 µM, sedangkan invertase tanpa

CuSO4 (kontrol) menghasilkan gula pereduksi 1669.5 µM, sehingga inhibisi

yang diberikan sebesar 9.96 %.

Inhibisi terhadap aktivitas invertase disebabkan oleh penghambatan substrat untuk memasuki daerah katalitik enzim dimana kation logam Cu (II) terikat pada sisi aktif enzim. Inhibisi dapat terjadi pada sisi aktif enzim maupun sisi sekunder enzim. Jika inhibitor terikat pada sisi aktif enzim, substrat tidak dapat membentuk kompleks dengan enzim, sehingga produk tidak akan terbentuk. Inhibisi juga dapat terjadi selain pada sisi aktif enzim, yaitu pada sisi sekunder enzim. Pengikatan inhibitor pada sisi sekunder enzim menyebabkan perubahan konformasi enzim, sehingga affinitas enzim pada substrat berkurang. Inhibisi pada fungsi katalitik enzim dapat terjadi pada residu asam amino, yang dapat terletak pada sisi aktif enzim. Hal ini sesuai dengan teori bahwa grup sulfhidril terdapat pada sisi aktif maupun di dekat sisi aktif invertase yang penting dalam menjalankan fungsi katalitik enzim tersebut (Sturm, 1999 dalam Hsiao et al., 2001).

Inhibisi terhadap aktivitas invertase juga disebabkan oleh adanya asam yang terbentuk dari anion SO42- yang berikatan dengan kation H+ dari grup

sulfhidril invertase membentuk senyawa asam H2SO4. Penambahan CuSO4

dengan konsentrasi yang lebih tinggi menyebabkan terbentuknya senyawa asam sulfat semakin banyak yang mengubah pH larutan menjadi lebih asam. Hal ini sesuai dengan teori bahwa ion H+ yang berlebihan mempengaruhi keseimbangan muatan pada sisi aktif enzim, sehingga kemampuan enzim untuk mengikat substrat berkurang (Rodwell, 1981).

Jika konsentrasi CuSO4 dinaikkan maka inhibisi akan semakin besar,

seperti yang ditunjukkan oleh penambahan konsentrasi CuSO4 3.75 mM.

Inaktivasi bahkan dapat terjadi jika konsentrasi tersebut masih dinaikkan, karena semakin banyak grup sulfhidril invertase yang terikat oleh kation logam Cu (II) atau semakin banyak senyawa asam yang terbentuk. Hal ini membuktikan bahwa kation logam Cu (II) bersifat sangat reaktif terhadap grup sulfhidril pada kondisi konsentrasi yang tinggi. Hasil penelitian ini sesuai dengan teori bahwa pengaruh inhibisi dari ion-ion logam disebabkan oleh affinitas (kereaktifan) ion logam. Affinitas enzim terhadap ion logam berbeda disesuaikan dengan sifat ikatan spesifik grup enzim yang terlibat. Kereaktifan unsur-unsur atau senyawa untuk melakukan ikatan kompleks ditunjukkan oleh konstanta pembentukan (log k1) (Klotz, 1954). Konstanta pembentukan kation

logam Cu (II) dengan gugus sulfida adalah 41.5 (Gurd dan Wilcox, 1954).

C. Hubungan Pengaruh Perubahan Faktor Terhadap Degradasi Sukrosa Aktivitas invertase dalam mendegradasi sukrosa dipengaruhi oleh beberapa faktor. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim antara lain konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu inkubasi dan lama pemanasan. Perubahan faktor-faktor tersebut dengan penambahan CuSO4

dibahas sebagai berikut.

1. Pengaruh Konsentrasi Substrat

Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi sukrosa memberikan pengaruh yang nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dapat dilihat pada Lampiran 3.

Semakin tinggi konsentrasi sukrosa diberikan, semakin tinggi konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji menunjukkan rentang gula pereduksi dari 0 µM hingga 2157 µM, dengan konsentrasi paling rendah pada perlakuan tidak diberikan sukrosa dan konsentrasi tertinggi pada sukrosa 20.75 g/l tanpa penambahan CuSO4. Hasil pengujian pengaruh

perubahan konsentrasi sukrosa terhadap aktivitas invertase dapat dilihat pada Gambar 16. 0 500 1000 1500 2000 2500 0 4.25 8.25 12.5 16.75 20.75 konsentrasi sukrosa (g/l) k o ns ent ras i gul a pereduk s i (uM )

Perlakuan konsentrasi substrat dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Perlakuan konsentrasi substrat tanpa CuSO4

Gambar 16. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi substrat terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit

Peningkatan konsentrasi sukrosa meningkatkan gula pereduksi yang dihasilkan. Peningkatan terjadi dengan curam dari invertase yang tidak ditambahkan sukrosa (sukrosa 0 g/l) hingga sukrosa 12.5 g/l, baik pada perlakuan tanpa maupun dengan penambahan CuSO4. Rasio

invertase terhadap sukrosa pada konsentrasi sukrosa 12.5 g/l adalah 1 : 2500. Selanjutnya, peningkatan secara landai terjadi dari konsentrasi sukrosa 12.5 g/l hingga 16.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 3350) pada perlakuan tanpa CuSO4. Hal ini disebabkan oleh enzim yang bekerja

semakin aktif jika substrat yang diberikan semakin banyak, karena semakin banyak substrat yang berpeluang untuk berikatan dengan sisi aktif enzim. Lehninger (1988) menyatakan bahwa pada konsentrasi substrat

yang rendah, kecepatan reaksi akan sangat rendah, tetapi kecepatan ini akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat.

Aktivitas invertase menjadi tidak berbeda nyata dari konsentrasi sukrosa 16.75 g/l - 20.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 4150). Hal ini disebabkan karena hampir semua sisi aktif invertase telah berikatan dengan sukrosa membentuk kompleks enzim-substrat. Laju reaksi meningkat dengan nilai yang semakin kecil hingga akhirnya tercapai titik batas tertentu. Hal ini sesuai dengan teori bahwa bagaimanapun tingginya konsentrasi substrat yang diberikan setelah titik batas ini tercapai, kecepatan reaksi akan mendekati, tetapi tidak akan pernah mencapai garis maksimum. Pada batas ini disebut dengan kecepatan maksimum (Vmaks),

enzim menjadi jenuh oleh substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger, 1988).

Kedua perlakuan, baik tanpa maupun dengan penambahan CuSO4

menunjukkan pola aktivitas invertase yang hampir sama, hanya berbeda pada tingkat gula pereduksi yang dihasilkan. Konsentrasi CuSO4 mampu

menghambat aktivitas invertase dari taraf konsentrasi sukrosa 4.25 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 850) hingga konsentrasi sukrosa tertinggi 20.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 4150). Besar inhibisi yang diberikan pada berbagai konsentrasi sukrosa, dapat dilihat pada Gambar 17.

31.1 13.0 9.2 37.2 2.4 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 0 4.25 8.25 12.5 16.75 20.75 konsentrasi s ukrosa (g/l) in h ib is i ( % ) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 s u bs et

Gambar 17. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada

konsentrasi substrat yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit

Perbedaan konsentrasi sukrosa berpengaruh nyata terhadap besarnya inhibisi aktivitas invertase berdasarkan analisis sidik ragam, dapat dilihat pada Lampiran 4. Inhibisi berbeda nyata ketika konsentrasi sukrosa dinaikkan dari sukrosa 0 g/l hingga 4.25 g/l. Penambahan CuSO4

menyebabkan kation logam Cu (II) terikat pada grup sulfhidril enzim invertase, sehingga inhibisi terjadi. Inhibisi tidak berbeda nyata dengan kenaikan konsentrasi sukrosa 8.25 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 1650). Hal ini menunjukkan bahwa kenaikan konsentrasi sukrosa menjadi 8.25 g/l belum menurunkan kemampuan inhibisi oleh CuSO4 0.125 mM.

Kemampuan inhibisi turun secara tajam dengan kenaikan konsentrasi sukrosa menjadi 12.5 g/l. Hal ini disebabkan karena pada konsentrasi tersebut, laju pembentukan enzim-substrat pada perlakuan tanpa CuSO4 masih meningkat, sehingga menghasilkan nilai gula

pereduksi yang tinggi di titik yang hampir sama dengan aktivitas enzim invertase dengan CuSO4 0.125 mM. Aktivitas invertase dengan

penambahan CuSO4 0.125 mM pada rasio invertase terhadap sukrosa

1 : 2500 telah jenuh oleh substrat. Hal ini juga merupakan penyebab inhibisi kembali meningkat dengan kenaikan sukrosa dari 12.5 g/l hingga 16.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 3350).

2. Pengaruh Konsentrasi Enzim

Hasil hidrolisis sukrosa semakin meningkat dengan kenaikan konsentrasi invertase, baik pada perlakuan tanpa CuSO4 maupun dengan

penambahan CuSO4. Gula pereduksi yang dihasilkan berada pada rentang

80.75 µM hingga 1725.75 µM, dapat dilihat pada Gambar 18. Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa konsentrasi enzim yang diujikan menunjukkan pengaruh nyata terhadap gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji statistik tersebut dapat dilihat pada Lampiran 5.

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 0 0.15 0.85 1.65 2.5 3.35 4.15 konsentrasi invertase (mg/l) k ons ent ra s i gul a p e re d u k s i ( u M )

Perlakuan konsentrasi enzim dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Perlakuan konsentrasi enzim tanpa CuSO4

Gambar 18. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi enzim terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit

Aktivitas invertase pada konsentrasi enzim 0 mg/l hingga 0.15 mg/l (invertase : sukrosa = 1 : 1.67 x 105) tidak memberikan respon pengaruh yang berbeda nyata, baik pada perlakuan dengan mupun tanpa CuSO4.

Kedua taraf konsentrasi enzim tersebut memiliki kemampuan yang hampir sama dalam menghidrolisis sukrosa. Hal ini dapat disebabkan oleh sisi aktif enzim telah berikatan dengan sejumlah substrat dan menjadi jenuh, sehingga produk yang dihasilkan sedikit. Hal ini sesuai dengan teori bahwa konsentrasi enzim yang terbatas membuat substrat berlebih. Substrat dapat berperan sebagai inhibitor jika substrat mengikat sisi lain dari enzim karena dapat mengubah konformasi enzim. Substrat yang

berlebih akan membatasi laju reaksi katalisis enzim (Suryani dan Mangunwidjaya, 2002).

Peningkatan aktivitas terjadi ketika konsentrasi enzim invertase dinaikkan menjadi 0.85 mg/l ( invertase : sukrosa = 1 : 2.9 x 104_{) pada}

perlakuan dengan penambahan CuSO4 0.125 mM, dan 1.65 mg/l pada

perlakuan tanpa CuSO4. Peningkatan gula pereduksi masih terjadi hingga

taraf konsentrasi enzim tertinggi yaitu 4.15 mg/l (invertase : sukrosa = 1 : 6 x 103), baik pada perlakuan dengan maupun tanpa penambahan CuSO4. Akan tetapi, peningkatan yang terjadi pada perlakuan tanpa

CuSO4 lebih curam. Hal ini menunjukkan bahwa kation logam Cu (II)

mampu menghambat laju pembentukan kompleks enzim-substrat. Semakin tinggi konsentrasi enzim, semakin banyak sisi aktif enzim yang berikatan dengan sukrosa sehingga semakin tinggi gula pereduksi yang dihasilkan. Hal ini sesuai dengan teori bahwa kecepatan reaksi tergantung pada konsentrasi enzim yang berperan sebagai katalisator di dalam suatu reaksi. Peningkatan konsentrasi enzim umumnya akan meningkatkan hidrolisis substrat menjadi produk (Simanjutak dan Silalahi, 2003).

Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perbedaan taraf konsentrasi enzim berpengaruh nyata terhadap persen inhibisi, dapat dilihat pada Lampiran 6. Inhibisi oleh garam logam CuSO4 mulai terjadi

pada konsentrasi invertase 2.5 mg/l (invertase : sukrosa = 1 : 104), dapat dilihat pada Gambar 19. Konsentrasi enzim di bawah konsentrasi tersebut belum menunjukkan inhibisi. Hal ini dapat terjadi karena adanya penurunan laju inversi oleh konsentrasi substrat yang berlebih, sehingga kation Cu (II) tidak dapat memasuki sisi aktif invertase. Inhibisi pada konsentrasi invertase 2.5 mg/l mulai terlihat karena substrat tidak berlebih atau telah diimbangi dengan kenaikan konsentrasi enzim, sehingga kompetisi mulai terjadi antara sukrosa dengan kation Cu (II) dalam mengikat sisi aktif enzim.

15.8 41.8 54.8 -130.7 -62.1 -88.8 -55.5 -200.0 -150.0 -100.0 -50.0 0.0 50.0 100.0 0 0.15 0.85 1.65 2.5 3.35 4.15 konsentrasi invertase (mg/l) inhi b is i ( % ) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 su b s e t

Gambar 19. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada

konsentrasi enzim yang berbeda, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit

dengan konsentrasi invertase 3.35 – 4.15 mg/l. Hal ini menunjukkan bahwa untuk mencapai inhibisi yang lebih besar, diperlukan konsentrasi CuSO4 yang lebih tinggi untuk mengikat sisi aktif enzim yang masih

bebas.

3. Pengaruh pH

Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perubahan nilai pH memberikan pengaruh yang nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Perubahan pH menyebabkan perubahan muatan pada gugus residu asam amino dan sisi aktif enzim. Gugus residu asam amino merupakan asam atau basa lemah yang dapat terprotonasi atau terionisasi oleh pengaruh pH lingkungan.

Pengujian pengaruh nilai pH dilakukan pada rasio invertase terhadap sukrosa 1 : 4500, dan konsentrasi CuSO4 0.125 mM, sedangkan

perlakuan tanpa CuSO4 menggunakan invertase : sukrosa 1 : 5000. Gula

pereduksi yang dihasilkan berbeda pada rentang 85.75 µM hingga 2267 µM, dapat dilihat pada Gambar 20. Konsentrasi gula pereduksi paling rendah diperlihatkan pada pH 11, perlakuan tanpa penambahan CuSO4 dan konsentrasi tertinggi pada pH 5, perlakuan dengan

penambahan CuSO4 0.125 mM. Hasil uji statistik pengaruh pH dapat

dilihat pada Lampiran 7.

0 500 1000 1500 2000 2500 0 2 4 6 8 10 12 pH k ons ent ra s i gul a per edu k s i (u M )

Perlakuan pH dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Perlakuan pH tanpa CuSO4

Gambar 20. Kurva pengaruh perubahan nilai pH terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit

Invertase dengan maupun tanpa penambahan CuSO4 menunjukkan

pola aktivitas yang hampir sama, yaitu aktivitas invertase meningkat dari pH 3 sampai titik optimum pada pH 5. Aktivitas menurun dengan peningkatan pH sampai pH 8 untuk invertase tanpa CuSO4 dan pH 7 untuk

invertase dengan penambahan CuSO4 0.125 mM, setelah itu enzim

menjadi inaktif.

Adanya penambahan CuSO4 memberikan tambahan asam pada

larutan, akan tetapi diimbangi dengan adanya buffer pH yang mempertahankan nilai pH. Hal ini sesuai dengan teori bahwa penambahan ion H+ _{atau OH}- _{ke dalam buffer hanya menyebabkan perubahan kecil}

pada nisbah konsentrasi relatif asam lemah dan anionnya. Penurunan salah satu komponen dari sistem buffer dengan penambahan sedikit asam diimbangi dengan tepat oleh peningkatan komponen lainnya. Jumlah komponen buffer tidak berubah, yang berubah hanya nisbahnya (Lehninger, 1988).

Aktivitas hidrolisis sukrosa oleh invertase sangat rendah pada pH yang sangat asam (pH 3) dan basa tinggi (pH 8 - 11). Hal ini menunjukkan bahwa pada pH yang sangat asam, gugus fungsionil pada sisi aktif enzim terganggu oleh adanya ion H+ yang berlebihan, sedangkan pada pH basa tinggi aktivitas invertase rendah karena ion OH- _{yang berlebihan.}

Perubahan pH akan menyebabkan suatu bentuk kurva seperti yang diperlihatkan pada Gambar 20. Bentuk kurva tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor sebagai berkut.

1. Denaturasi enzim pada pH yang sangat tinggi atau rendah

Hasil pengujian perubahan pH, denaturasi enzim terjadi pada pH 3 ke bawah untuk pH asam dan pH 8 ke atas untuk pH basa. Hal ini terlihat pada Gambar 20, konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan pada pH 8 ke atas sangat rendah dan tidak berbeda nyata. Denaturasi enzim menyebabkan konformasi enzim rusak, karena struktur protein globular terbuka tanpa memecah ikatan kovalen dalam kerangka polipeptida. Ikatan hidrogen antara gugus residu atom nitrogen pada asam amino menjadi terbuka karena muatannya menjadi

tidak seimbang oleh pengaruh pH. Hal ini sesuai dengan teori bahwa enzim terdenaturasi di suhu ruang pada pH tinggi atau rendah, sehingga enzim kehilangan aktivitasnya yang bersifat tidak dapat balik (irreversible) (Stauffer, 1989).

2. Pengaruh terhadap keadaan muatan substrat atau enzim

Enzim merupakan protein yang sangat dipengaruhi oleh pH. pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus asam amino, yang menyebabkan enzim tidak dapat berinteraksi dengan substrat atau sebaliknya, menjadi mudah berikatan dengan substrat. Rodwell (1981) menyatakan bahwa perubahan muatan pada enzim dapat mempengaruhi aktivitas baik dengan perubahan struktur maupun dengan perubahan muatan pada residu asam amino yang berfungsi mengikat substrat atau katalisis. Tingkat pH yang rendah menyebabkan enzim mengalami protonasi dan kehilangan muatan negatif:

Enz - + H+ Enz-H

Tingkat pH yang tinggi menyebabkan ion substrat (SH+_{) mengalami}

ionisasi dan kehilangan muatan positif:

SH+ S + H+ 3. Perubahan konformasi enzim

Perubahan konformasi enzim juga dipengaruhi oleh perubahan muatan asam amino. Aktivitas dapat menjadi rendah pada pH yang sangat tinggi atau sangat rendah atau sebaliknya menjadi maksimum pada pH tertentu. Berdasarkan Gambar 20, perubahan konformasi enzim yang berpengaruh pada tingginya aktivitas di pH 5 dapat terjadi karena struktur enzim menjadi lebih kompak. Rodwell (1981) menyatakan, suatu gugus yang bermuatan jauh dari bagian dimana substrat terikat, mungkin perlu untuk mempertahankan struktur tersier atau kuartener yang aktif. Apabila muatan pada gugus ini diubah, molekul protein dapat terbuka atau menjadi lebih kompak.

Inhibisi oleh CuSO4 terhadap invertase tidak terjadi pada pH yang

diujikan kecuali pada pH 7. Akan tetapi persen inhibisi yang dihasilkan pada pH 7 tidak berbeda nyata dengan pH 4 – 6, dapat dilihat pada Lampiran 8. Hal ini membuktikan bahwa ikatan antara enzim invertase dengan kation logam Cu (II) sangat dipengaruhi oleh tingkat pH. Perubahan pH menyebabkan kereaktifan Cu (II) berkurang karena perubahan muatan pada enzim, sehingga inhibisi tidak terjadi.

15.0 -6.8 -14.2 -196.0 -29.6 -261.4 -186.8 -255.0 -281.3 -400.0 -350.0 -300.0 -250.0 -200.0 -150.0 -100.0 -50.0 0.0 50.0 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH in hi bi s i ( % ) 0 1 2 3 4 5 su b s e t

Gambar 21. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada nilai

pH yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit

4. Pengaruh Suhu

Pengujian pengaruh perubahan suhu dilakukan pada rasio invertase terhadap sukrosa 1 : 2500, dengan konsentrasi CuSO4 0.125 mM. Analisis

sidik ragam menunjukkan bahwa perubahan suhu berpengaruh nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji statistik tersebut dapat dilihat pada Lampiran 9. Perubahan suhu menghasilkan konsentrasi gula pereduksi pada rentang 140.75 µM hingga 3537 µM. Konsentrasi tertinggi pada suhu 50°C dengan perlakuan tanpa CuSO4 dan

konsentrasi terkecil pada suhu 70°C dengan penambahan CuSO4

0.125 mM. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap aktivitas invertase dapat dilihat pada Gambar 22.