KEMENTERIAN PERTANIAN REPUBLIK INDONESIA

(1)

Nomor SOP :

Tangal Pembuatan : 11 September 2019 Tanggal Revisi : -

Tanggal Efektif : 1 Oktober 2019 Disahkan Oleh :

Nama SOP :

Dasar Hukum Kualifikasi Pelaksana

1. Undang-undang No. 16/1992 tentang Karantina Hewan, Ikan dan Tumbuhan 1. Memahami peraturan perundang-undangan tentang karantina Hewan 2. Peraturan Pemerintah No. 82/2000 tentang Karantina Hewan 2. Pernah mengikuti pendidikan dan pelatihan dasar karantina

3. Pernah mengikuti pendidikan dan pelatihan laboratorium 4. Memahami SNI ISO/IEC 17025:2017

5. Memahami Dokumen Mutu BBKP Tanjung Priok

Keterkaitan dengan SOP lain: Peralatan yang digunakan:

1. SOP Alur Pengujian Laboratorium 1. ATK

2. SOP Penanganan Contoh Uji 3. Alat Laboratorium

Peringatan Pencatatan dan Pendataan

Apabila SOP ini tidak dilaksanakan maka akan menghambat SOP 1. Form Distribusi Contoh Uji

pengujian dan hasil Laboratorium 2. Form Hasil Pengujian Laboratorium

REPUBLIK INDONESIA BADAN KARANTINA PERTANIAN

BALAI BESAR KARANTINA PERTANIAN TANJUNG PRIOK BIDANG KARANTINA HEWAN

/OT.210/L7.A/1/2019

Kepala,

Ir. Purwo Widiarto MMA NIP. 19611219 198903 1 001 Pengujian Deteksi Virus Avian Inluenza dengan Metode RT- PCR

KEMENTERIAN PERTANIAN

(2)

Penyelia Analis Kelengkapan Output Waktu

1 2 3 4 5 6 7 8

1 Mendistribusikan pengujian ATK dan Komputer Distribusi Contoh

Uji (FM.28)

5 menit

2 Menyiapkan Alat dan bahan deteksi Avian Influenza

BSC, Mikropipet, pipet tips, microtube, spidol, gelas ukur, erlenmyer, aquadest, sentrifus,

thermalycler, eletroforesis, kit extraksi, mastermix, primer

Alat dan bahan uji PCR AI

10 menit

3 Mensterilisasi pcr cabinet dan peralatan didalamnya

menggunakan lampu UV pada ruang extraksi RNA

BSC , laminar air flow, micropipet, pipet tips, microtube

pcr cabinet dan kelengkapannya

steril

30 menit

4 Menyiapkan kit extraksi dan contoh uji (extraksi

menggunakan metode collom) * beda metode beda step lagi ada 3 jenis metode extraksi ini yang tak pilih pakai kollom

kit extraksi, swab contoh uji, BSC, micropipet, pipet tis,

sentrifus, vortex

kit siap dipergunakan

10 menit

5 Menyiapkan layout pengujian dan perhitungan kebutuhan bahan extraksi, master mix, agar rose (tempatkan contoh uji sesuai layout)

layout PCR layout PCR 10 menit

Uraian Kegiatan Pelaksana Mutu Baku Keterangan

Pengujian Deteksi Virus Avian Influenza dengan Metode RT- PCR No

(3)

1 2 3 4 5 6 7 8

6 Mengisolasi RNA

menggunakan KIT QiAmp Viral RNA, tambahkan 310 ul carrier RNA ke dalam lautan Buffre RNA (AVL) kedalam 310 ul Carrier RNA untuk memperolah

konsentrasi 1ug/ul

* beda merek kit extraksi beda step lagi ini yang dipilih pakai kit qiagen

sentrifus, vortex

sampel siap untuk tahap selanjutnya

20 menit

7 Memindahkan 560 ul buffer AVL yang telah berisi carrir RNA ke dalam microtube 1,5 ml

sentrifus, vortex

5 menit

8 Menambahkan 140 ul plasma /serum/urine/supernatan kultur ke dalam campuran buffer AVL- carrier RNA , dan dihomogenkan

swab contoh uji, BSC, micropipet, pipet tis, sentrifus, vortex, Buffer AVL- carrier RNA

10 menit

9 Menspindown cairan pada mcrotube , kemudian

menginkubasi pada suhu 25 ^oC selama 10 menit

BSC, micropipet, pipet tis, sentrifus, vortex

10 menit

Mutu Baku Keterangan

No Uraian Kegiatan Pelaksana

(4)

1 2 3 4 5 6 7 8

10 Menambahkan 560 ul ethanol absolute, dihomogenkan selama 15 detik

BSC, ethanol, vortex, micropipet, pipet tips

5 menit

11 Memindahkan 560 ul larutan diatas kedalam QIAamp mini spin collom tanpa membasahi tepi bulatan tabung , lalu tutup tabung disentrifus kecepatan 8000 rpm selama 1 menit

QiAamp mini spin, micropipet, pipet tips, sentrifus

5 menit

12 Membuka collum QIAmp mini spin dan menambahkan 500 ul buffer AW1, disentrifus

kecepatan 8000 rpm selama 1 menit, menempatkan QIAmp mini spin ke dalam 2 ml tabung koleksi yang baru dan buang tabung sebelumnya yang berisi filtrat

5 menit

13 Membuka collum QIAmp mini spin dan menambahkan 500 ul buffer AW2, disentrifus

kecepatan 14000 rpm selama 3 menit, menempatkan QIAmp mini spin ke dalam 2 ml tabung koleksi yang baru dan buang tabung sebelumnya yang berisi filtrat

5 menit

No Uraian Kegiatan Pelaksana Mutu Baku Keterangan

(5)

1 2 3 4 5 6 7 8

14 Membuka collum QIAmp mini spin dan menambahkan 60 ul buffer AVE, tuttup dan biarkan selama 1 menit, lalu disentrifus kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Proses extraksi RNA selesai

5 menit

15 Mensterilisasi pcr cabinet dan peralatan didalamnya

menggunakan lampu UV pada ruang master mix

5 menit

16 Membuat master mix sesuai dengan jumlah total contoh uji menggunakan one step RT- PCR invitrogen untuk primer

matrik sbb:

1. RT -PCR mix -- 25 u l

2. Platinum tag -- 1 ul 3. Primers - primer R -- 10

uM -- 1 ul ; - primer F -- 10 uM -- 1 ul; 4.

Nuclease Free Water (ddH2O)-- 17 ul 6. Template -- 5 ul

TOTAL VOL : 45 ul

15 menit

Keterangan

No Uraian Kegiatan Pelaksana Mutu Baku

(6)

1 2 3 4 5 6 7 8

17 Membuat master mix sesuai dengan jumlah total contoh uji menggunakan A. one step RT-PCR invitrogen

untuk primer H5 sbb:

1. RT -PCR

mix -- 25 u l

2. Platinum tag -- 2 ul

3. Primers - primer R -- 10 uM -- 2 ul ; - primer F -- 10 uM -- 2 ul;

4. Nuclease Free Water

(ddH²O)-- 16 ul 6. Template -- 3

ul TOTAL VOL : 47 ul

15 menit

18 Menghomogenkan master mix dan membaginya kedalam microtube 0,2 ul sesuai dengan jumlah template, - Primer Matrix : - Primer H5 kemudiaan di vortex hingga homogen

15 menit

(7)

1 2 3 4 5 6 7 8

19 masukan tabung RT PCR ke dalam mesin electroforesis untuk dilakukan proses PCR dengan ketentuan sbb :

DETEKSI MATRIK 1. denaturasi --

1 siklus (60 oC, 30 menit (95 oC, 2

menit);

2. Annaleing -- 35-40 siklus

95 oC, 40 detik;

50 oC, 40 detik;

72 oC, 1 menit;

3. Elongasi -- 1 siklus

pcr cabinet, vortx, spindown DNA tamplate 15 menit

20 Masukan tabung RT PCR ke dalam mesin electroforesis untuk dilakukan proses PCR dengan ketentuan sbb : DETEKSI H5 1. denaturasi -- 1 siklus (45 oC, 60 menit

(95 oC, 5 menit);

2. Annaleing -- 35

siklus 95 oC, 30 detik;

50 oC, 30 detik; 72 oC, 40 menit; 3.

Elongasi -- 1 siklus (72 oC, 10 menit; 4 oC, ∞)

thermalycler amplikon 120 menit

(8)

1 2 3 4 5 6 7 8

21 Melakukan proses elektoforesis dengan mencampur produk PCR (amplikon) 9-10 µl dengan dengan 1-2 µl loading dye hingga homogen

micropipet, filter tips, parafilm amplikon 15 menit

22 Menseparasi amplikon

menggunakan 2% agarose yang telah ditambahkan ethidium bromide (0,5 µg/ml pada tegangan 100 V selama 45-100 menit dengan menggunakan marker 100 bp DNA ladder.

elektoforesis pcr band 30 menit

23 Membaca hasil elektroforesis selanjutnya dilihat dengan menggunakan gel

documentatiom system atau UV transilluminator.

gel doc, printer pcr band 10 menit

24 Membuat arsip contoh uji , apabila diperoleh hasil positif

contoh uji 10 menit

25 Menulis hasil pengujian pada form hasil pengujian

Form Laporan Hasil Pengujian

Laboratorium (FM.29)

10 menit

26 Melakukan verifikasi hasil pengujian laboratorium

Form Laporan Hasil Pengujian

Laboratorium (FM.29)

5 menit

400 menit

Total