1 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PROTEIN DARI MAKROALGA COKLAT (Padina
australis) SERTA POTENSINYA SEBAGAI ANTIKANKER
ABSTRAK
Telah dilakukan studi tentang bioaktivitas fraksi protein yang diisolasi dari alga coklat Padina australis yang terdapat di pulau Lae-lae Makassar Sulawesi Selatan sebagai agen antikanker. Protein diisolasi menggunakan Buffer Tris (hidroksimetil) aminometana pH 8,3. Fraksinasi protein dari ekstrak kasar menggunakan metode salting out dengan penambahan Amonium sulfat pada tingkat kejenuhan 0-20 %, 20-40 %, 40-60 %, dan 60-80 %. Pra pemurnian protein dilakukan dengan cara dialisis menggunakan kantong selofan. Kadar protein ditentukan berdasarkan metode Lowry dengan menggunakan BSA (Bovine Serum Albumin) sebagai standar. Uji aktivitas antikanker menggunakan uji pendahuluan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi protein dari ekstrak kasar alga coklat Padina australis yaitu 3,33 mg/mL. Konsentrasi tertinggi pada fraksi protein ditunjukkan oleh fraksi 40-60 % sebesar 1,345 mg/mL. Hasil uji toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) menunjukkan fraksi protein yang diperoleh memiliki nilai LC50 > 1000 µg/mL. Fraksi
protein alga coklat Padina australis tidak memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai alternatif agen antikanker.
Kata Kunci: antikanker, BSLT, fraksi protein, metode Lowry, Padina australis.
ABSTRACT
Abstract. A study have been conducted about bioactivity of protein fractions isolated from brown algae Padina australis contained in Lae-Lae island, Makassar South Sulawesi as an anticancer agent. Protein was isolated using Buffer Tris (hydroxymethyl) amino methane pH 8.3. Fractionation of proteins from crude extract using the salting out method with the addition of ammonium sulphate at a saturation rate of 0-20 %, 20-40 %, 40-60% and 60-80 %. Pre-purification of protein was done by dialysis using cellophane bags. Concentration of protein determined by the Lowry method using BSA (Bovine Serum Albumin) as a standard. Anticancer activity test using preliminary test methods Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). The results showed that the protein concentration of the crude extract of brown algae Padina australis is 3,33 mg/mL. The highest concentration of protein fractions indicated by the 40-60 % fraction of 1,345 mg/mL. The results from toxicity tests using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) showed the values from protein fraction had LC50 values was >1000 µg/mL. Protein fractions of the brown algae Padina australis
had not potential to be developed as an alternative anticancer agents.
Key words: anticancer, BSLT, Lowry method, Padina australis, protein fraction.
PENDAHULUAN
Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, mempengaruhi pola hidup masyarakat. Pola hidup masyarakat yang tidak benar menyebabkan munculnya berbagai macam penyakit degeneratif. Pola
makan masyarakat di daerah yang banyak mengkonsumsi lemak, gula dan garam, ternyata ditemukan menderita banyak penyakit degeneratif dibandingkan masyarakat di wilayah yang banyak mengkonsumsi karbohidrat, serat dan vitamin.1
2 Kanker adalah penyebab utama
kematian di seluruh dunia, sekitar 13 % kematian pada tahun 2008 disebabkan oleh kanker. Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan terjadinya pembentukan jaringan baru yang abnormal dan bersifat ganas serta tidak terkendali. Kematian akibat kanker di seluruh dunia diperkirakan akan terus meningkat, dengan perkiraan 13,1 juta kematian pada tahun 2030.2
Berbagai macam senyawa telah dikembangkan untuk melawan kanker, akan tetapi tak satupun jenis senyawa-senyawa tersebut menghasilkan efek yang memuaskan dan tanpa efek samping yang merugikan.3
Senyawa antikanker yang ideal mempunyai sifat sebagai antioksidan, antiproliferasi, menaikkan sistem perbaikan DNA, menginduksi apoptosis pada sel kanker, menghambat angiogenesis dan menaikkan sistem imun. Ini berarti agen antikanker yang ideal dapat beraksi pada tahap pencegahan maupun pengobatan.4
Beberapa jenis alga dilaporkan menunjukkan aktivitas sebagai antikanker. Senyawa-senyawa yang telah berhasil diisolasi dari alga sebagai antikanker antara lain Kahalalide F dari alga Bryopsis, senyawa peptida dari alga Chlorella vulgaris, β-karoten dari alga Rhodymenia pseudopalmata, Eucheuma serra agglutinin (ESA) yang merupakan senyawa lektin dari alga Eucheuma serra, fraksi protein dari alga merah, Eucheuma spinosum serta Ekstrak kasar Fucoidan yang diisolasi dari alga coklat Sargassum polycystum.5-10
Telah banyak penelitian yang dilakukan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi protein aktif dari berbagai golongan alga seperti alga merah, alga hijau dan golongan alga coklat dari spesies sargassum sp. yang menunjukkan potensinya sebagai antikanker namun, sejauh ini belum banyak data penelitian yang mengeksplorasi senyawa bioaktif protein dari alga coklat, khususnya alga coklat Padina australis sebagai bahan baku obat antikanker, sehingga dianggap perlu dilakukan eksplorasi yang lebih luas terhadap potensi yang dimiliki oleh alga coklat tersebut. Selain itu pada penelitian ini diharapkan senyawa protein yang berhasil diisolasi dari alga coklat Padina australis
menunjukkan adanya efek toksisitas yang menandakan adanya protein yang aktif dan dapat dilanjutkan ke tahap selanjutnya.11,12
Salah satu contoh protein aktif yang telah diketahui dapat dikembangkan sebagai agen antikanker adalah parasporin dan RIP. Alga coklat Padina australis Pada penelitian ini diisolasi dan diidentifikasi protein bioaktif yang berpotensi sebagai antikanker melalui serangkaian proses ekstraksi, fraksinasi dan pemurnian. Padina australis merupakan salah satu genus alga yang banyak diteliti kandungan dan aktivitas senyawa bioaktifnya. Fraksi protein yang diperoleh diuji toksisitasnya menggunakan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) terhadap larva udang Artemia salina Leach.
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari-Juni 2015 di Laboratorium Biokimia, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin, Makassar.
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alga cokelat Padina australis, Buffer A (Tris (hidroksimetil) aminometana 0,1 M pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2
0,01 M; β-mercaptoetanol 1%, Triton X-100 0,5%), Buffer B (Tris (hidroksimetil) aminometana 0,1 M pH 8,3; NaCl 0,2 M; CaCl2 0,01 M), Buffer C (Tris (hidroksimetil)
aminometana 0,01 M pH 8,3; NaCl 0,2 M; CaCl2 0,01 M), akuades, BSA (Bovine Serum
Albumin), Amonium sulfat, Lowry A (follin clocalteus, Larutan asam phosphotungstat-phosphomolybdat dengan akuades 1:1), Lowry B (Na2CO3 2%; NaOH 0,1 N;
CuSO4.5H2O 1%, Natrium kalium tartrat 2%),
HCl 1 M, air laut, telur udang Artemia salina Leach, Vinkristin, kantong selofan, kertas saring Whatman no. 42, kain saring.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain neraca analitik, sentrifugen Universal 320R, magnetik stirrer fisher, pisau, blender, mikropipet (10-1000 μL), lup, vial, lampu pijar/neon 40-60 watt, Spektronik
3 20D+, botol semprot dan alat-alat gelas yang
umum digunakan di laboratorium. Prosedur Penelitian
Preparasi Sampel
Isolasi protein bioaktif dari alga menggunakan prosedur dari metode sebelumnya yang dimodifikasi sebagai berikut: Alga yang telah diseleksi dipotong kecil-kecil dan ditimbang sebanyak 500 g berat segar, kemudian dihaluskan dengan blender menggunakan 1000 mL pelarut Buffer A lalu disaring menggunakan kain saring. Filtrat yang diperoleh dibeku/cairkan sebanyak 2-3 kali dan disentrifugasi pada 6000 rpm, suhu 4 ºC selama 20 menit.13
Fraksinasi
Ekstrak kasar difraksinasi menggunakan Amonium sulfat pada tingkat kejenuhan 0-20%, 20-40%, 40-60% dan 60-80%.
Dialisis
Endapan-endapan yang diperoleh setelah fraksinasi dari masing-masing tingkat kejenuhan amonium sulfat dilarutkan dalam sejumlah Buffer B dan selanjutnya didialisis dalam sejumlah Buffer C. Fraksi protein tersebut dimasukkan ke dalam kantong selofan dengan dipastikan bahwa kantong selofan tidak bocor atau rusak. Selofan yang telah diisi dengan fraksi protein dimasukkan ke dalam gelas kimia yang berisi larutan Buffer C lalu diaduk dengan pengaduk magnetik stirrer. Dialisis terus dilakukan hingga larutan buffer tidak berwarna.
Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein setiap fraksi menggunakan metode Lowry dengan menggunakan larutan standar bovine serum albumin (BSA).14
Uji Toksisitas dengan Menggunakan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Penyiapan Larva Udang
Telur udang dimasukkan ke dalam wadah yang berisi air laut untuk ditetaskan, kemudian diaerasi di bawah cahaya lampu
pijar/neon 40-60 watt agar suhu penetasan tetap terjaga pada kisaran 25-30 oC. Lampu dinyalakan selama 48 jam, setelah telur menetas diambil larva udang yang akan diuji.15
Pelaksanaan Uji
Uji toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) menggunakan prosedur dari metode sebelumnya yang dimodifikasi. Fraksi protein dibuat dalam konsentrasi 1 μg/mL, 10 μg/mL, dan 100 μg/mL, dimana setiap konsentrasi ditempatkan dalam 3 vial. Pengerjaan yang sama juga dilakukan pada Buffer B tanpa sampel sebagai kontrol negatif dan untuk Vinkristin sebagai kontrol positif dan Ekstrak kasar Padina australis dibuat dalam 6 konsentrasi, dimana setiap konsentrasi ditempatkan dalam 6 vial berbeda. Sebanyak 10 ekor larva udang dimasukkan ke dalam senyawa uji dan ditambahkan air laut hingga 5 mL, kemudian disimpan di bawah pencahayaan selama 24 jam. Jumlah larva yang mati dan yang hidup diamati dan dihitung serta ditentukan nilai LC50 dengan menggunakan analisis Probit.
Adapun persentase kematian larva udang dapat ditentukan dengan menggunakan rumus Abbot:16,17
% Kematian larva
=∑larva yang mati x 100 % ∑larva uji
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Protein dari Alga
Sampel makroalga coklat yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Pulau Lae-lae, Makassar, Sulawesi Selatan. Alga coklat Padina australis dipotong-potong kecil dan ditimbang sebanyak 500 g. Proses lisis sel dilakukan dengan cara homogenisasi dengan menggunakan blender dan dilarutkan dengan Buffer A. Hal ini bertujuan untuk memecahkan sel-sel dari alga sehingga protein yang terdapat pada sel dapat larut dalam Buffer A. Adanya kandungan Triton-X 100 0,5 % dalam Buffer A berfungsi untuk membantu proses lisis sel secara kimia dengan menegangkan plasma sehingga dengan adanya gesekan fisik sel akan
4 terpecah. Proses beku-cair dilakukan untuk
menyempurnakan proses lisis sel. Dalam keadaan beku, molekul air dipenuhi dengan rongga sehingga volumenya akan meningkat, sedangkan dalam keadaan cair, molekul air akan merapat sehingga mengakibatkan volumenya menurun. Dengan demikian air yang membeku di dalam sel akan lebih mudah memecahkan sel tersebut.
Pemisahan endapan dan supernatan dilakukan melalui proses sentrifugasi. Adapun prinsip dari sentrifugasi yaitu memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan berada di atas.18
Isolasi protein alga dilakukan pada suhu rendah 0-4 ˚C dengan menggunakan Buffer A. Hal ini disebabkan karena protein sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan. Oleh karena itu, suhu dan pH larutan perlu dijaga agar tidak merusak protein.
Pra pemurnian protein dilakukan dengan cara fraksinasi menggunakan Amonium sulfat dan selanjutnya didialisis menggunakan membran selofan. Fraksinasi bertujuan untuk memisahkan protein berdasarkan perbedaan kelarutannya di dalam air. Proses fraksinasi protein dilakukan dengan penambahan Amonium sulfat pada tingkat kejenuhan 0-20 %, 20-40 %, 40-60 % dan 60-80 %. Fraksinasi ini merupakan fraksinasi bertingkat. Pengendapan protein menggunakan prinsip salting out karena air berikatan dengan garam Amonium sulfat.
Penambahan garam Amonium sulfat dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi menyebabkan berbeda pula jenis protein yang mengendap. Fraksinasi menggunakan Amonium sulfat menghasilkan protein dengan kadar garam yang tinggi, oleh karena itu garam-garam yang tersisa dalam proses pengendapan dipisahkan dengan cara dialisis di dalam larutan Buffer C menggunakan membran semipermeabel (kantong selofan). Metode dialisis merupakan metode yang paling popular untuk menghilangkan molekul-molekul pengganggu, seperti garam atau ion-ion lain yang berukuran kecil. Proses dialisis dilakukan pada suhu 4 ˚C
untuk mencegah terjadinya kerusakan protein yang dimurnikan. Protein yang dihasilkan dalam proses dialisis merupakan protein murni yang bebas dari garam Amonium sulfat.
Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Lowry, yaitu didasarkan pada reaksi protein dengan asam fosfotungstat-fosfomolibdat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru dimana intensitas dari warnanya bergantung pada konsentrasi dari protein tersebut. Selanjutnya pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan Spektronik 20D+.
Berdasarkan pengukuran yang telah dilakukan, konsentrasi protein dan total protein dari alga cokelat Padina australis pada ekstrak kasar dan fraksi protein pada fraksinasi berbagai tingkat kejenuhan Amonium sulfat dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Data hasil penentuan konsentrasi protein dan total protein pada ekstrak kasar dan fraksi protein pada berbagai tingkat kejenuhan Amonium sulfat dari Alga cokelat Padina australis No Fraksi protein Volume setiap fraksi (mL) Konsentrasi Protein (mg/mL) 1 Ekstrak Kasar 390 3,33 2 0-20 % 5 0,935 3 20-40 % 5 0,275 4 40-60 % 5 1,345 5 60-80 % 5 0,765
Tabel 1 menunjukkan bahwa konsentrasi protein dari ekstrak kasar adalah 3,33 mg/mL, sedangkan konsentrasi untuk fraksi protein diperoleh konsentrasi protein tertinggi yaitu pada fraksi 40-60 % sebesar 1,345 mg/mL dan konsentrasi protein terendah ditemukan pada fraksi 20-40 % sebesar 0,275 mg/mL. Adanya perbedaan konsentrasi pada setiap fraksi menunjukkan bahwa berbeda pula jenis protein yang mengendap. Beberapa protein memiliki kelarutan yang berbeda di dalam air. Semakin
5 tinggi kelarutannya, maka semakin sedikit
protein yang mengendap, sebaliknya semakin rendah kelarutannya maka semakin banyak protein yang mengendap.18
Uji Aktivitas Antikanker metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Penentuan nilai LC50 dilakukan untuk
mengetahui efek toksik dari fraksi protein pada alga coklat Padina australis. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah kematian larva udang, selanjutnya ditentukan nilai LC50 dengan
menggunakan grafik probit-log konsentrasi. Nilai LC50 menunjukkan besarnya konsentrasi
sampel yang dapat menyebabkan kematian 50 % hewan uji.
Perhitungan LC50 didasarkan pada
rumus Peluang yang didefinisikan sebagai berikut:19
P = 1
Y adalah Probit dan P adalah Peluang, Logit adalah bentuk lain dari mengubah data binomial menjadi linearitas dan sangat mirip dengan probit. Fungsi logit dengan mengambil log dari logit (P) = log P / (1-P).19
Pengujian dilakukan pada larva udang Artemia salina L. yang berumur 48 jam adalah karena pada umur tersebut Artemia salina L. mengalami pertumbuhan yang cepat sehingga diasumsikan sebagai pertumbuhan sel yang abnormal.
Hasil pengamatan kematian Artemia salina L. setelah 24 jam pemberian ekstrak kasar Padina australis terlihat dalam Tabel 2.
Tabel 2. Data hasil perhitungan nilai LC50
terhadap larva udang (Artemia salina Leach) dari beberapa fraksi protein Alga coklat Padina australis dan Vinkristin
No. Senyawa uji Nilai LC50 (µg/mL) Tingkat Toksisitas 1. Ekstrak kasar 53 Sangat Toksik 2. 0-20% >1000 Tidak Toksik 3. 20-40% >1000 Tidak Toksik 4. 40-60% >1000 Tidak Toksik 5. 60-80% >1000 Tidak Toksik 6. Vinkristin 1,01 Sangat Toksik Nilai LC50 yang diperoleh (Tabel 2)
menunjukkan bahwa ekstrak kasar bersifat sangat toksik sedangkan fraksi Protein Padina australis tidak toksik. Menurut Marliyana dkk. (2012), suatu zat dikatakan aktif atau bersifat toksik jika nilai LC50:< 1.000 μg/mL
untuk suatu ekstrak dan < 30 μg/mL untuk suatu senyawa.
Gambar 1. Diagram nilai LC50 terhadaplarva
udang (Artemia salina Leach) dari beberapa fraksi protein Alga coklat Padina australis dan Vinkristin
Berdasarkan Gambar 1 fraksi protein dari Alga coklat Padina australis
menunjukkan nilai LC50 sebesar
>1000 µg/mL. Ekstrak kasar Alga coklat Padina australis menunjukkan nilai toksisitas yang sangat tinggi yaitu 53 µg/mL.
Fraksi Protein yang diperoleh dan diuji toksisitas terhadap Artemia salina L. tidak menunjukkan adanya senyawa protein yang aktif karena nilai toksisitasnya lebih besar dari 1000 µg/mL sehingga tidak memiliki potensi sebagai antikanker. Sejauh ini belum ditemukan adanya literatur yang membahas mengenai adanya protein aktif yang
Y-5
-∞
6 berpotensi sebagai antikanker pada alga
coklat Padina australis berbeda dengan golongan alga lainnya seperti alga merah Eucheuma spinosum yang menunjukkan aktivitas tertinggi dalam uji antikanker fraksi 0-20% kejenuhan dengan nilai LC50 sebesar
55,62 µg/mL dan nilai IC50 sebesar 53,80
µg/mL. Fraksi protein 0-20% kejenuhan cukup potensial untuk dikembangkan sebagai alternatif agen antikanker20, pada penelitian Isolasi dan Karakteristik protein bioaktif dari Alga Merah Gelidium amansii dan Alga hijau Turbinaria deccurens antikanker yang dilaporkan oleh Indra Sari Maya (2011), menunjukkan bahwa fraksi protein dari alga Turbinaria decurrens memiliki respon toksisitas terkuat terdapat pada fraksi protein 60-80 % dengan LC50 sebesar 141,25 µg/mL
dan Untuk respon toksisitas Alga merah Gelidium Amansii terdapat pada fraksi protein 20-40 % dengan nilai LC50 28,84 µg/mL.21
Sejauh ini literatur yang diperoleh hanya mengenai protein aktif dari bakteri yang bersimbion dari alga coklat spesies sargassum sp. memiliki aktivitas sebagai antibakteri22.Ekstrak kasar alga coklat Padina australis yang juga diuji toksisitas terhadap Artemia salina L. diperoleh nilai LC50 sebesar
53 µg/mL yang menunjukkan bahwa dalam ekstrak kasar Padina australis terdapat senyawa yang berpotensi sebagai antikanker namun belum diketahui secara pasti senyawa apa yang berpotensi sebagai antikanker pada ekstrak kasar alga coklat Padina australis.
Rumput laut coklat secara umum mengandung senyawa fukosantin. Fukosantin merupakan senyawa golongan karotenoid yang dapat menginduksi apoptosis pada sel hidup. Selain karotenoid terdapat kemungkinan bahwa senyawa-senyawa dari golongan steroid yang terdapat dalam rumput laut coklat bertanggung jawab atas aktivitas sitotoksiknya.23,24
KESIMPULAN
Kadar Protein yang diperoleh dari alga coklat Padina australis untuk fraksi protein 0-20 %, fraksi protein 0-20-40 %, fraksi protein 40-60 % dan fraksi protein 60-80 % berturut-turut adalah 0,935 µg/mL; 0,275 µg/mL; 1,345 µg/mL dan 0,765 µg/mL.
Nilai LC50 fraksi protein alga coklat
Padina australis 0-20 %, 20-40 %, 40-60 % dan 60-80 % adalah >1000 µg/mL (tidak toksik) sangat berbeda dengan nilai LC50 yang
diperoleh pada ekstrak kasar yaitu sebesar 53 µg/mL (toksik).
Tidak ada Fraksi protein yang berpotensi sebagai antikanker.
SARAN
Adapun saran pada penelitian ini yaitu Perlu dilakukan isolasi dan identifikasi lebih lanjut terhadap ekstrak kasar Padina australis untuk mendapatkan senyawa toksik terhadap Artemia salina L. dan dilanjutkan uji sitotoksisitasnya terhadap sel zigot bulubabi atau sel biakan kanker lainnya. DAFTAR PUSTAKA
1
Ardiansyah, 2007, Antioksidan dan Peranannya Bagi Kesehatan, (Online),(https://islamicspace.wordpre ss.com/2007/01/24/antioksidan-dan-peranannya-bagi-kesehatan/, diakses 15 Desember 2014).
2
World Health Organization, 2012, Cancer (online),(http://www.who.int/mediacen tre/factsheets/fs297/en/index.html,diak ses 15 Desember 2014).
3
Sukardiman, R., Abdul, dan Fatma, P.N., 2004, Uji Praskrining Aktivitas Antikanker Ekstrak Eter dan Ekstrak Metanol Marchantia planiloba Steph Dengan Metode Uji Kematian Larva Udang dan Profil Densitometri Ekstrak Aktif, Majalah Farmasi Airlangga, 4 (3), 97–100.
4
Sudjadi dan Sismindari, 2011, Perkembangan Ribosome-inactivating Protein (RIP) sebagai Antikanker, Traditional Medicine Journal, 16, 1-7.
5
Smit, A. J., 2004, Medical and Pharmaceutical Uses of Seaweed Natural Product: A Review, Journal of Applied Phycology, 16 (4), 245-262.
7
6
Sheih, C., Fang, T.J., Wu, T.K., and Lin, P.H., 2010, Anticancer and Antioxidant Activities of the Peptide Fraction from Algae Protein Waste, J. Agric. Food Chem,58, 1202-1207.
7
Astutiningsih, C., Limantara, L., dan Radjasa, O.K., 2010, Uji Mutagenik β-Karoten Alga Merah Rhodymenia Pseudopalmata terhadap Mencit Jantan Galur Balb/C yang Diinduksi 7,12-Dimetilbenzen (A) Antrasen (DMBA), Biosaintifika, 2 (1), 1-9.
8
Fukuda, Y., Sugahara, T., Ueno, M., Fukuta, Y., Ochi, Y., Akiyama, K., Miyazaki, T., Masuda, S., Kawakubo, A., and Kato, K, 2008, The anti-tumor effect of Euchema serra agglutinin on colon cancer cells in vitro and in vivo, Anti-Cancer Drugs, 17 (8), 943-947.Atta-ur-Rahman, Choudhary, M. I., and Thomson, W. J., 2001, Bioassay Technique for Drug Development, Harword Academic Publisher, Singapore. 8-9, 35.
9
Nurhajrah, 2013, Isolasi dan Identifikasi Protein Bioaktif dari Alga Merah Euchema spinosum, Jurnal tidak diterbitkan, Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Hasanuddin, Makassar, Sulawesi selatan.
10
Ningrum, R.D.S., Hardoko, dan Bambang , B.S., 2013, Pengaruh Ekstrak Kasar Fucoidan Alga Coklat Sargassum polycystum terhadap Vibialitas Sel hela, THPi Student Journal, 1 (1), 83-92.
11
Ortiz, J., Romer, E., Robert, P., Aray, J., Lopez, J., Bonzo, C., Navret, E., Osori., A., dan ang Rios, A., 2006, Dietary Fiber, Amino Acid, Faty Acid and Tocpherol Contes of The Edible Seaweds Ulva lactua and Durvilae Antarctia, Fod Chemistry, Santiago,Chile, 99, 98–104.
12
Dawczynski, C., Schubert, R., and Jahreis, G., 207, Amino Acids, Fatty Acids, and Dietary Fibre In Edible Seaweed Product, Food Chemistry, Friedrich Schiller University of Jena, Instiute of Nutrition, Dornburge Strase 24, D-0743 Jena, Germany, 103 (8), 89–91.
13
Dali, S., Natsir, H., Usman, H., dan Ahmad, A., 2011, Bioaktivitas Antibakteri Fraksi Protein Alga Merah Gelidium amansii dari Perairan Cikoang Kabupaten Takalar, Sulawesi Selatan, Majalah Farmasi dan Farmakologi, 15 (1): 47-52.
14
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., and Randall, R.J., 1951, Protein Measurement with The Folin Phenol Reagent, The Journal of Biological Chemistry, 193, 265-275.
15
Juniarti, Osmeli, D. dan Yuhernita, 2009, Kandungan Senyawa Kimia, Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) dan Antioksidan (1,1-diphenyl-2-pikrilhydrazil) dari Ekstrak Daun Saga (Abrus precatorius L.), Makara Sains, 13 (1): 50-54.
16
Meyer, B.N., N.R. Ferigni, J.E Putnan, L.B. Jacobsen, D.E. Nicholas, J.L. cLaughlin 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioasay for Active Plant Constiuent. Departement of
Medical Chemistry and
Pharmakognocy, Schol of Pharmacy and pharmacal science, and Cel Culture Libratory, Perdue Cancer Center, West lavayete, USA.
17
Faatih, M., 2009, Isolasi dan Digesti DNA Kromosom, Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi, 10 (1): 61-67.
18
Poedjiadji, A., dan Supriyanti, F.M.T., 2005, Dasar-Dasar Biokimia, UI Press, Jakarta.
8
19
Finney, D. J., 1952, Probit Analysis, Cambridge, Cambridge University Press, England.
20
Marliyana, S.D., Rakhman, F.W., Nesari, H., dan Rakhmawati, R., 2012, Uji Toksisitas Secara Brine Shrimp Lethality Ekstrak Buah Merah (Pandanus Conoideus Lamk.), Alchemy Jurnal Penelitian Kimia, 8 (1), 24-33.
21
Maya, I.S., 2011, Isolasi dan Karakteristik protein bioaktif dari Alga Merah Gelidium amansii dan Alga hijau Turbinaria deccurens sebagai antibakteri dan antikanker, Skripsi tidak diterbitkan, Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Hasanuddin, Makassar, Sulawesi Selatan.
22
Sartika, Ahmad, A., dan Natsir, H., Potensi Antimikroba Fraksi Protein yang Diisolasi dari Bakteri Simbion Alga Coklat Sargassum sp Asal Perairan Pulau Lae-Lae, Jurusan Kimia Fakultas MIPA, Universitas Hasanuddin, Makassar, Sulawesi Selatan.
23
Nursid, M., Wikanta, T., dan Susilowati, R., 2013, Aktivitas Antioksidan, Sitotoksisitas, dan Kandungan Fukosantin Ekstrak Rumput Laut Coklat Dari Pantai Binuangeun, Banten, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, KKP, Jakarta.
24
Sheu, J.H., Wang, G.H., Sung, P.J., dan Duh, CY., 1999, New cytotoxic oxygenated fucosterols from the brownalga Turbinaria conoides, J. Nat. Prod,62 (2): 224–227.
