3 Lampiran 1
RINGKASAN PENGKAJIAN KEAMANAN PAKAN KEDELAI PRG EVENT A5547-127
I. PENDAHULUAN
Kedelai PRG event A5547-127 merupakan tanaman produk rekayasa genetik dari PT BASF Indonesia. Kedelai ini mengandung gen phosphinothricin-N-acetyltransferase (pat) yang menyandikan enzim PAT untuk sifat toleran terhadap herbisida yang berbahan aktif amonium glufosinat, yang umum digunakan dalam pengendalian gulma pada tanaman kedelai.
Kedelai PRG event A5547-127 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 20 negara, yaitu Amerika Serikat (1998); Kanada (2000); Jepang (2002); Meksiko (2003); Australia dan Selandia Baru (2004); Rusia (2008); Brazil dan Taiwan (2010); Argentina, Filipina, dan Korea Selatan (2011); Uni Eropa (2012); Cina, India, dan Malaysia (2014); Singapura dan Vietnam (2015); Iran (2016). Indonesia juga telah memberikan sertifikat aman pangan pada Kedelai PRG event A5547-127 berdasarkan Keputusan Kepala BPOM No. HK.02.02.1.5.07.20.297 Tahun 2020.
Sertifikat aman pakan telah diperoleh di 17 negara, yaitu Amerika Serikat (1998); Kanada (2000); Jepang (2003); Rusia (2007); Brazil (2010); Argentina, Filipina, dan Korea Selatan (2011); Kolombia dan Uni Eropa (2012); Cina, India, dan Malaysia (2014); Singapura, Turki, dan Vietnam (2015); Nigeria (2018). Sertifikat aman lingkungan telah diperoleh di 6 negara, yaitu Amerika Serikat (1998), Kanada (1999), Jepang (2006), Brazil (2010), Argentina (2011), dan Uruguay (2012).
Berdasarkan Peraturan Menteri Pertanian No. 36/Permentan/LB.070/8/2016 Tahun 2016 tentang Pengkajian Keamanan Pakan PRG dan Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian No. 466.2/Kpts/OT.210/H/11/2016 Tahun 2016 tentang Pedoman Teknis Tata Cara dan Mekanisme Pengkajian Keamanan Pakan PRG, TTKH PRG Bidang Keamanan Pakan telah melakukan pengkajian keamanan pakan Kedelai PRG event A5547-127 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pakan sebagaimana diuraikan berikut ini.
4 II. INFORMASI GENETIK
II.1 Elemen Genetik
Kedelai PRG event A5547-127 mengandung satu gen sisipan yaitu pat yang diisolasi dari Streptomyces viridochromogenes strain Tü494. Gen pat menyandikan enzim PAT untuk memberikan sifat toleran terhadap herbisida amonium glufosinat. Gen pat ini mempunyai promotor 35S CaMV (P-35S CaMV) dan terminator 35S CaMV (T-35S CaMV). Hasil analisis Southern Blot menunjukkan bahwa Kedelai PRG event A5547-127 mengandung satu kopi gen pat (Verhaeghe, 2012).
II.2 Sumber Gen Sisipan
Gen sisipan pada Kedelai PRG event A5547-127 adalah gen pat yang berasal dari bakteri S. viridochromogenes strain Tü494. Bakteri S. viridochromogenes merupakan bakteri yang tidak berbahaya, saprofit, Gram-positif, aerob, dan secara alami dapat ditemukan di dalam tanah (Freyssinet, 2002). Gen pat pada Kedelai PRG event A5547-127 dikendalikan oleh promotor 35S dan terminator 35S yang berasal dari Cauliflower mosaic virus (CaMV) (Strauch et al., 1994). II.3 Sistem Transformasi
Kedelai PRG event A5547-127 dirakit dengan metode particle bombardment menggunakan eksplan embrio muda somatik dengan plasmid pB2/35SSAcK yang mengandung gen pat (McCabe et al., 1988). Embrio muda somatik yang telah tertransformasi kemudian dipindahkan ke media tanam hingga tanaman tumbuh sempurna untuk selanjutnya diseleksi toleransinya terhadap herbisida amonium glufosinat (Verhaeghe, 2012).
II.4 Stabilitas Genetik
Analisis molekuler menggunakan Southern Blot telah dilakukan untuk melihat stabilitas gen sisipan dari generasi ke generasi (Beuckeleer, 1998). Kedelai PRG event A5547-127 mengandung gen pat. Hasil analisis menunjukkan bahwa gen sisipan tersebut stabil sampai lima generasi. Dari pola segregasi diketahui bahwa Kedelai PRG event A5547-127 mengikuti pola pewarisan hukum Mendel (Wert, 1998). Selain itu, analisis Southern Blot juga menunjukkan tidak terdeteksinya sekuen backbone dari plasmid pB2/35SSAcK.
Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa:
a. Kedelai PRG event A5547-127 mengandung satu kopi gen pat dan tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pB2/35SSacK. b. Gen pat pada Kedelai PRG event A5547-127 stabil sampai lima generasi dan
5 III. INFORMASI KEAMANAN PAKAN III.1 Kesepadanan Substansial
Pengkajian kesepadanan substansial Kedelai PRG event A5547-127 dan kedelai non-PRG (A5547) dilakukan pada biji, berdasarkan dokumen Nutritional Impact Assessment Report on Glufosinate Ammonium Tolerant Soybean Transformation event A5547-127, Bayer CropScience AG Regulatory Science– Human and Animal Safety, 65926 Frankfurt, Jerman (Oberdoerfer, 2012).
Sampel biji Kedelai PRG event A5547-127 dan kontrol kedelai konvensionalnya (A5547) telah diuji di laboratorium Bayer Crop Science yang telah mendapatkan sertifikat Good Laboratory Practice (GLP). Pengujian lapangan dilakukan pada tahun 2006 dan 2007 di 14 lokasi pada lima wilayah di Amerika Serikat, yaitu Georgia, Arkansas, Mississippi, Louisiana, dan Texas.
Penilaian komposisi dilakukan sesuai dengan dokumen konsensus OECD tentang senyawa untuk varietas kedelai baru (OECD, 2001; OECD, 2012). Analisis pada sampel biji meliputi proksimat (air, abu, karbohidrat, protein, dan lemak), serat, 6 jenis mineral (kalsium, fosfor, kalium, magnesium, natrium, dan besi), 4 jenis vitamin (vitamin B1, vitamin B2, asam folat, dan vitamin E), 5 jenis zat antinutrisi (rafinosa, stakiosa, asam fitat, penghambat tripsin, dan lektin), 18 jenis asam amino (alanin, arginin, asam aspartat, sistein, asam glutamat, glisin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirosin, dan valin), 11 jenis asam lemak (asam miristat, asam palmitat, asam margarat, asam stearat, asam arasidat, asam bahenat, asam lignoserat, asam palmitoleat, asam oleat, asam gadoleat, dan asam erusat), serta 6 jenis isoflavon (daidzein, daidzin, genistein, genistin, glisitein, dan glisitin).
Hasil analisis pada biji kedelai menunjukkan tidak ada perbedaan pada hasil analisis proksimat, serat, mineral, vitamin, asam amino, asam lemak, antinutrisi dan isoflavon antara Kedelai PRG event A5547-127, kedelai kontrol (A5547), dan kedelai komersial. Semua nilai hasil analisis berada pada rentang normal (Oberdoerfer, 2012).
Berdasarkan pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa biji Kedelai PRG event A5547-127 sepadan dengan biji kedelai non-PRG (A5547) dan kedelai komersial.
III.2 Toksisitas
Uji toksisitas dilakukan melalui studi bioinformatika, uji kecernaan in vitro, dan uji toksisitas oral akut.
6
III.2.1 Studi bioinformatika toksisitas protein PAT
Studi bioinformatika Kedelai PRG event A5547-127 dilakukan berdasarkan report number TXSRS002 (Capt, 2017). Analisis dilakukan dengan membandingkan sekuen asam amino protein PAT dengan protein pada basis data National Center for Biotechnology Information (NCBI) yang mengandung sekuen dari GenBank CDS translations, Protein Data Bank (PDB), UniProtKB/Swiss-Prot, Protein Information Resource (PIR), dan Protein Research Foundation/Protein Sequence Database (PRF/SEQDB). Selain itu, sekuen protein PAT juga dibandingkan dengan 49.681 sekuen protein pada basis data toksin yang dimiliki oleh Bayer (Bayer BCS 2017). Uji kemiripan sekuen dilakukan menggunakan perangkat FASTA dengan E-value <0,1 untuk protein dari basis data NCBI dan E-value <10 untuk basis data toksin Bayer BCS 2017. Hasil analisis menunjukkan tidak ada kemiripan sekuen antara protein PAT dan protein toksin pada basis data tersebut.
III.2.2 Uji kecernaan in vitro protein PAT
Uji kecernaan in vitro protein PAT dilakukan dengan metode Simulated Gastric Fluid (SGF) dan Simulated Intestinal Fluid (SIF). Penelitian dilakukan di laboratorium Bayer Crop Science yang telah mendapatkan sertifikat GLP. Uji dilakukan dengan menggunakan protein rekombinan PAT (21,5 kDa) yang diproduksi oleh E. coli, dengan tingkat kemurnian 87,5% (batch number ADW040708, produksi BioAnalytics, Bayer CropScience NV, Swijnaarde, Belgia). Uji kecernaan in vitro protein PAT dengan metode SGF dilakukan berdasarkan laporan Rascle tahun 2015. Sebagai kontrol digunakan protein horseradish peroxidase (HRP, 46 kDa) dan ovalbumin (OVA, 45 kDa). HRP merupakan protein yang dapat tercerna dengan cepat, sementara OVA dicerna dengan lambat. Kedua protein tersebut diuji secara paralel. Simulasi cairan lambung (SGF) pada mamalia digunakan untuk menilai kepekaan protein PAT terhadap pencernaan proteolitik oleh pepsin secara in vitro. Formulasi SGF, rentang waktu, dan parameter percobaan yang dilakukan dalam evaluasi PAT mengikuti kondisi yang digunakan oleh International Life Sciences Institute (ILSI) (Thomas et al., 2004), berdasarkan metode United States Pharmacopeia (USP-NF, 1990).
Protein PAT diinkubasi dalam SGF yang mengandung pepsin pada pH 1,2 selama interval waktu spesifik (0; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 30; 60 menit) dan dianalisis lebih lanjut dengan SDS-PAGE/pewarnaan Coomassie blue dan Western Blot. Imunodeteksi dilakukan dengan menggunakan antibodi poliklonal yang dirancang untuk mengenali protein PAT.
Hasil uji SGF menunjukkan protein PAT dapat didegradasi secara cepat (>90%) dalam waktu inkubasi 30 detik. Kontrol positif HRP juga terurai dengan cepat
7
(30 detik), sedangkan kontrol negatif OVA bertahan di dalam larutan pepsin dalam waktu lebih dari 60 menit.
Uji kecernaan in vitro protein PAT dengan metode SIF dilakukan berdasarkan laporan Rascle tahun 2009. Simulasi cairan usus halus (SIF) digunakan untuk menilai kepekaan protein PAT terhadap pencernaan proteolitik oleh pankreatin secara in vitro. Protein PAT diinkubasi dalam SIF yang mengandung pankreatin mengikuti metode United States Pharmacopoeia (USP-NF, 1990) selama interval waktu spesifik (0; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 30; 60 menit), yang kemudian dilanjutkan dengan analisis SDS-PAGE/pewarnaan Coomassie blue dan Western Blot.
Hasil uji SIF yang diikuti oleh SDS-PAGE/pewarnaan Coomassie blue dan analisis Western Blot menunjukkan protein PAT telah terhidrolisis sempurna dalam waktu 10 menit.
III.2.3 Uji toksisitas oral akut protein PAT
Uji toksisitas oral akut Kedelai PRG event A5547-127 dilakukan berdasarkan study number SA 13205 (Blanck, 2014). Bahan uji yang digunakan pada studi ini berupa protein PAT rekombinan yang diproduksi pada bakteri E.coli dengan tingkat kemurnian >99% dan dilarutkan dalam PBS + Tween-20 0,05% (pH 7,3).
Pengujian dilakukan di laboratorium Bayer SAS, Bayer Crop Science, 355 rue Dostoievski CS 90153, Valbonne 06906, Sophia Antipolis Cedex, Prancis, yang menerapkan GLP. Hewan uji yang digunakan yaitu mencit strain C57BL/6J berasal dari Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, Prancis dan telah diaklimatisasi selama 8 hari. Mencit yang digunakan berumur 8 minggu, dengan bobot badan 17,4–19,3 g untuk jantan dan 14,1–16,0 g untuk betina.
Pada uji ini sebanyak 40 ekor mencit dibagi menjadi dua kelompok yang masing-masing terdiri atas 10 ekor mencit jantan dan 10 ekor mencit betina. Mencit pada kelompok perlakuan dicekok protein PAT dengan dosis 2.000 mg/kg bobot badan, sedangkan mencit pada kelompok kontrol dicekok dengan larutan pembawa (PBS + Tween-20 0,05% [pH 7,3]).
Pengamatan pada mencit dilakukan setiap hari terhadap adanya kelainan gejala klinis dan kematian. Selain itu setiap minggu juga diamati jumlah konsumsi pakan dan bobot badan masing-masing mencit. Pada hari ke-15, semua mencit diterminasi dengan inhalasi isofluran, dilanjutkan dengan nekropsi untuk melihat adanya perubahan makroskopik pada organ dalam mencit.
Hasil studi menunjukkan tidak ada kematian, kelainan gejala klinis, perbedaan jumlah konsumsi dan perubahan bobot badan antara kelompok perlakuan dan
8
kontrol, serta tidak ditemukan perubahan makroskopik pada organ mencit. Dapat disimpulkan bahwa pemberian protein PAT secara oral sebanyak 2.000 mg/kg bobot badan tidak menyebabkan toksisitas pada mencit.
Berdasarkan uji toksisitas protein PAT pada Kedelai PRG event A5547-127 yang dilakukan melalui studi bioinformatika, uji kecernaan protein secara in vitro, dan uji toksisitas oral akut, dapat disimpulkan:
a. Tidak ada kemiripan antara protein PAT dan protein toksin atau toksin putatif (putative toxin).
b. Protein PAT dengan cepat didegradasi pada model SGF dan SIF. c. Protein PAT tidak bersifat toksik.
III.3 Studi Pakan
Berdasarkan laporan dari Leeson (1998), telah dilakukan studi pakan pada DOC broiler betina (Gallus domesticus) sebanyak 240 ekor yang dibagi menjadi dua kelompok perlakuan pakan masing-masing terdiri atas enam ulangan. Setiap ulangan terdiri atas 20 ekor. Perlakuan pada ternak mengikuti pedoman The Canadian Council on Animal Care dengan izin dari The University of Guelph Animal Care Committee, Animal Utilization Protocol Number 97R146. Perlakuan pakan terdiri atas pemberian Kedelai PRG event A5547-127 yang toleran terhadap herbisida amonium glufosinat dibandingkan dengan kedelai non-PRG A5547.
Pakan perlakuan diberikan selama masa starter, grower, dan finisher. Komposisi Kedelai PRG event A5547-127 dan kedelai non-PRG A5547 dalam ketiga pakan tersebut adalah 20%. Pakan starter diberikan selama 17 hari, pakan grower diberikan pada umur 17–31 hari, dan pakan finisher diberikan pada hari ke-31 sampai ke-42. Pengamatan dilakukan pada hari ke-17, ke-31, dan ke-42 terhadap bobot badan, konsumsi pakan, dan konversi pakan. Pengamatan terhadap karakteristik karkas yang terdiri atas berat karkas, berat lemak abdominal, bobot daging, dan persentase kematian dilakukan pada hari ke-42. Analisis terhadap semua parameter tersebut dilakukan dengan menggunakan t-test pada level signifikansi p<0,05.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan pada konsumsi pakan, bobot badan, konversi pakan, karakteristik karkas, dan persentase kematian antara kelompok broiler yang diberi Kedelai PRG event A5547-127 dan kelompok broiler yang diberi kedelai non-PRG A5547. Disimpulkan bahwa Kedelai PRG event A5547-127 tidak mempunyai efek negatif terhadap pertumbuhan ayam broiler betina.
9
Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, dan toksisitas, disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. Kedelai PRG event A5547-127 mengandung satu kopi gen pat, stabil sampai lima generasi, dan diwariskan mengikuti hukum Mendel, serta tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi.
2. Kedelai PRG event A5547-127 sepadan secara substansial dengan kedelai non-PRG dan tidak bersifat toksik.
3. Kedelai PRG event A5547-127 adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pakan.
4. Apabila di kemudian hari ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pakan yang diperoleh hingga saat ini, status keamanan pakan Kedelai PRG event A5547-127 perlu dikaji ulang.
5. Apabila setelah ditetapkan aman pakan, kemudian Kedelai PRG event A5547-127 terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan ternak, pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik Kedelai PRG event A5547-127 dari peredaran.
6. Kedelai PRG event A5547-127 tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkan aman lingkungan.
Daftar Pustaka
Beuckeleer, M. De. 1998. Molecular demonstration of the stability of the integration of Glycine max transformation event A5547-127. Testing Facility: Plant Genetic Systems NV Jozef Plateaustraat 22 B-9000 Gent, Belgium.
Blanck, M. 2014. PAT/pat protein–acute toxicity by oral gavage in mice. Company report. Study number: SA 13205. Bayer SAS, Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne 06906, Sophia Antipolis Cedex, France. Bayer Crop Science, AG Alfred Nobel Str. 50, 40789 Monheim, Germany.
Capt, A. 2017. PAT/pat protein amino acid sequence homology search with known allergens and known toxins. Report number: TXSRS002. Bayer SAS, Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne 06906, Sophia Antipolis Cedex, France.
Freyssinet, M. 2002. General description of the bacterial gene pat and its gene product PAT as used for producing plants with a genetically-based tolerance to Liberty herbicide. Report number: C025020. Bayer Crop Science, 55 Avenue Rene-Cassin, 69009, Lyon, France.
Leeson, S. 1998. The effect of glufosinate resistant soybeans (A5547-127) on the growth of female broiler chickens. Department of Animal and Poultry Science. Study number C-30-97.
McCabe, D.E., Swain, W.F., Martinell, B.J., and Christou, P. 1988. Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Bio/Technology, 6:923–926.
10
Oberdoerfer, R. 2012. Nutritional impact assessment report on glufosinate ammonium tolerant soybean transformation event A5547-127. Bayer Crop Science, Bayer Crop Science AG Regulatory Science–Human and Animal Safety 65926, Frankfurt, Germany.
OECD. 2012. Revised consensus document on compositional considerations for new varieties of soybean (Glycine max [L.] Merr.): key food and feed nutrients, anti-nutrients, toxicants and allergens. Series on the Safety of Novel Foods and Feeds No. 25. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris, France.
OECD. 2001. Consensus document on compositional considerations for new varieties of soybean: key food and feed nutrients and anti-nutrients. ENV/JM/MONO(2001)15. Series on the Safety of Novel Foods and Feeds No. 2. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris, France.
Rascle, J.B. 2009. PAT/pat protein: in vitro digestibility study in human simulated intestinal fluid. Bayer SAS, Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne, 06906, Sophia Antipolis Cedex, France. Rascle, J.B. 2015. PAT/pat protein: in vitro digestibility study in human
simulated gastric fluid. Bayer SAS, Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne, 06906, Sophia Antipolis Cedex, France. Strauch E., Arnold, W., Alijah, R., Wohlleben, W., Puhler, A.,Eckes, P., Donn,
G., Uhlmann, E., Hein, F., and Wengenmayer, F. 1994. Phosphinothricin-resistance gene, and its use. United States Patent. Patent number: 5, 276, 268, patent date: 4 January 1994.
Thomas, K., Aalbers, M., Bannon, G.A., Bartels, M., Dearman, R.J., Esdaile, D.J., Fu, T.J., Glatt, C.M., Hadfield, N., Hatzos, C., Hefle, S.L., Heylings, J.R., Goodman, R.E., Henry, B., Herouet, C., Holsapple, M., Ladics, G.S., Landry, T.D., Macintosh, S.C., Rice, E.A., Privalle, L.S., Steiner, H.Y., Teshima, R., Van Ree, R., Woolhiser, M., and Zawodny, J. 2004. A multi-laboratory evaluation of a common in vitro pepsin digestion assay protocol used in assessing the safety of novel proteins. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 39:87–98.
USP-NF. 1990. United States Pharmacopeia. Vol. XXII, pp. 1788–1789. United States Pharmacopeia Convention, Rockville, MD.
Verhaeghe, S. 2012. Detailed insert characterization of Glycine max transformation event A5547-127 by Southern blot analysis. Study number: BBS10-005. Bayer Crop Science NV, Regulatory Science Protein and Product Characterization, Technologiepark 38 B-9052, Gent, Belgium. Wert, S.V. 1998. Mendelian inheritance and agronomic performance of event
