b1j014058 Aktivitas Protease

(1)

PENGUKURAN AKTIVITAS PROTEASE PADA IKAN LELE

(Clarias batrachus) DAN IKAN NILEM (Osteochilus vittatus)

Oleh:

Nama : Dini Darmawati

NIM : B1J014058

Rombongan : I Kelompok : 2

Asisten : Sutri Handayani

LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI NUTRISI

KEMENTRIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO

(2)

I. PENDAHULUAN I.1. Latar Belakang

Perubahan keberadaan pakan yang terjadi pada selama siklus hidup, seringkali dihadapi oleh hewan, termasuk ikan. Kondisi ini dapat terjadi di lingkungan alami maupun pada kondisi budidaya. Pada kondisi budidaya, perubahan keberadaan pakan terjadi karena diterapkannnya strategi pemuasaan dan pemberian pakan. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa strategi pemuasaan dan pemberian pakan kembali dapat memicu munculnya perubahan fisiologi pada ikan (Zhu et al., 2004 dalam Susilo et al., 2013).

Perubahan fisiologi yang dimaksud ialah perubahan aktivitas enzim digesti pada ikan. Metode pembatasan pakan menunjukkan bahwa perubahan keberadaan pakan di lingkungan hidupnya juga menyebabkan perbedaan respon aktivitas enzim yang berkaitan dengan proses digesti. Salah satu enzim yang berkaitan dengan proses digesti ialah enzim protease. Protease merupakan salah satu enzim yang penting untuk kelangsungan makhluk hidup karena berperan dalam sejummlah reaksi biokimia seluler (Roa et al., 1998).

Oleh karena itu tujuan praktikum ini adalah ingin mengetahui perbedaan kapasitas pencernaan ikan yang terukur sebagai aktivitas protease pada ikan yang diberi pemuasan dan pemberian pakan. Praktikum ini menggunakan dua ikan yaitu ikan lele dan ikan nilem, sesuai dengan kelompok masing-masing. Misalnya, kelompok 2 mendapatkan ikan lele. Menurut Arifin (1991), Ikan Lele (Ciarias batrachus) termasuk kelompok ikan siluroid yang sering disebut catfish. Kelompok ini mencakup jenis-jenis ikan yang bertulang keras dengan ciri-ciri bagian luar tidak bersisik, berkumis 2-4 pasang disekitar mulut dan pada sirip dada terdapat sepasang duri (patil).

I.2. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui perbedaan kapasitas pencernaan ikan yang terukur sebagai aktivitas protease pada ikan yang diberi pemuasaan dan pemberian pakan.

(3)

II. MATERI DAN CARA KERJA II.1. Materi

Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah ikan lele (Clarias

batrachus), nilem (Osteochilus vittatus), balok es dan 50 mM Tris-HCl buffer.

Alat yang digunakan adalah alat bedah, bak preparat, homogenizer, ependorf,

sentrifuge, digital scales, glovers, beaker glass, pipet dan tissue.

II.2. Cara Kerja

Prosedur preparasi jaringan 1. Alat dan bahan disiapkan

2. Ikan dibedah diatas balok es, saluran digesti diisolasi dan ditimbang.

3. Larutan 50 mM Tris-HCl buffer ditambahkan pada saluran digesti dengan

rasio 1:8.

4. Saluran digesti yang sudah dicampur dengan Tris-HCl dilumat dengan

homogenizer.

5. Dipindahkan ke eppendoft dan disentrifuge 12.000 rpm, selama 15 menit

dengan suhu 4ºC.

6. Supernatan diambil dan disimpan pada suhu -80 ºC. Pengukuran aktivitas protease

1. Buffer Tris-HCl sebanyak 350 µL dimasukkan ke dalam masing-masing tabung (tabung sampel 1, tabung sampel 2 dan blanko).

2. Ekstrak enzim dimasukkan ke dalam tabung sampel 1 dan sampel 2 sebanyak 50 µL.

3. Seluruh tabung diinkubasi pada suhu 370_{C selama 10 menit.}

4. Subtrat kasein 1% dimasukkan ke dalam masing-masing tabung sebanyak 350 µL.

5. Seluruh tabung diinkubasi kembali selama 20 menit pada suhu 370_C. 6. Reagen TCA 8% ditambahkan ke masing-masing tabung sebanyak 750 µL. 7. Ekstrak enzim ditambahkan sebanyak 50 µL ke dalam tabung blanko. 8. Seluruh tabung dimasukkan ke dalam refrigerator selama 15 menit.

9. Dipindahkan ke dalam tabung ependorf , kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm.

10. Supernatan sebanyak 1000 µL ditambahkan ke dalam tabung berisi akuades sebanyak 1500 µL, kemudian divortex.

(4)

III. HASIL DAN PEMBAHASAN III.1. Hasil

Tabel 3.1.1 Hasil Preparasi Jaringan Digesti

Tabel 3.1.2 Pengukuran Nilai Absorbansi dan Konsentrasi Protease Romb. I Kelompok

/ Ikan No. Tabung Nilai Absorbansi Nilai Konsentrasi

Standard 1 0,125 25.000 Standard 2 0,144 50.000 Standard 3 0,306 100.000 Standard 4 0,422 200.000 Standard 5 0,762 400.000 1/Lele makan dan lele puasa 1 (lele makan) 0,782 406.305 2 (lele makan) 0,325 139.169

3 (Blanko lele makan) 0,206 69.854

4 (lele puasa) 0,396 180.961 5 (lele puasa) 0,316 134.123

6 (Blanko lele puasa) _0,303 126.545

2 / Lele makan dan lele puasa 7 (lele makan) 0,373 167.247 8 (lele makan) 0,287 117.002

9 (Blanko lele makan) 0,168 47.664

10 (lele puasa) 0,238 88.550 11 (lele puasa) 0,217 76.666 12 (Blanko lele puasa) 0,172

50.385

3 / Nilem 13 (nilem makan) 0,854 448.258

Kelompo k Jenis Ikan Berat Usus (gram) Berat Tris-HCl (gram) 1 Lele Makan 0,76 6,08 Lele Puasa 0,32 2,56 2 Lele Makan 0,61 4,88 Lele Puasa 0,44 3,52 3 Nilem Makan 0,57 4,56 Nilem Puasa 0,86 6,88 4 Nilem Makan 0,89 7,12 Nilem Puasa 0,63 5,04 5 Nilem Makan 0,88 7,04 Nilem Puasa 1,02 8,16

(5)

makan dan nilem puasa

14 (nilem makan) 0,748 386.148

15 (Blanko nilem makan) 0,376 169.110

16 (nilem puasa) 0,854 448.060 17 (nilem puasa) 0,787 408.650

18 (Blanko nilem puasa) 0,342

149.213 4 / Nilem makan dan nilem puasa 19 (nilem makan) 1,151 _621.541 20 (nilem makan) 1,376 752.737

24 (Blanko nilem puasa) 0,274

109.767 5 / Nilem makan dan nilem puasa 25 (nilem makan) 0,563 _278.343 26 (nilem makan) 0,681 347.381

30 (Blanko nilem puasa) 0,440 206.707

Data perhitungan Tris-HCl rasio (1:8) :

Kelompok 1 Kelompok 3

Lele makan = berat usus x 8 Nilem Makan = berat usus x 8

= 0,76 x 8 = 0,57 x 8

(6)

Lele Puasa = berat usus x 8 Nilem Puasa = berat usus x 8

= 0,32 x 8 = 0,86 x 8

= 2,56 gram = 6,88 gram

Kelompok 2 Kelompok 4

Lele makan = berat usus x 8 Nilem Makan = berat usus x 8

= 0,61 x 8 = 0,89 x 8

= 4,88 gram = 7,12 gram

Lele Puasa = berat usus x 8 Nilem Puasa = berat usus x 8

= 0,44 x 8 = 0,63 x 8

= 3,52 gram = 5,04 gram

Kelompok 5

Nilem Makan = berat usus x 8 = 0,88 x 8 = 7,04

Nilem Puasa = berat usus x 8 = 1,02 x 8 = 8,16

Data perhitungan aktivitas enzim protease kelompok 2 rombongan I 1. Aktivitas enzim dinyatakan dalam konsentrasi (X)

a. Lele makan = 167.247+117.002₂ -47.664 = 94.460,5 U b. Lele puasa = 88.550 + 76.666₂ - 50.385 = 32.223 U 2. Aktivitas enzim dinyatakan dalam konsentrasi/menit

a. Lele makan = 94.460,5_{2 0} = 4723,025 U/menit b. Lele puasa = 32.223_{2 0} = 1611,15 U/menit

(7)

III.2. Pembahasan

Perubahan strategi pemberian pakan akan berefek pada perubahan fisiologis ikan, salah satunya ialah perubahan aktivitas protease. Hal ini dikarenakan setiap hewan umumnya dipengaruhi oleh pola makan. Misalnya, pada ikan Clarias, diketahui struktur memiliki perut maskulin yang dapat dilembungkan. Hal ini menunjukkan ketergantungan pada pola makan hewani pada ikan Clarias (Hlophe et al., 2014).

Perubahan fisiologis yang terjadi salah satunnya ialah perubahan pada aktivitas enzim protease. Enzim protease merupakan biokatalisator dalam reaksi pemecahan protein. Enzim ini akan mengkatalisis reaksi yang melibatkan unsur air pada ikatan spesifik substrat atau yang biasa disebut reaksi hidrolase (Winarno, 1983). Protease merupakan enzim yang sangat kompleks. Protease memiliki sifat fisiko kimia dan sifat katalitik yang sangat bervariasi. Protease dapat dihasilkan secara ekstraseluler dan intraseluler dan berperan penting dalam metabolisme sel dan keteraturan proses dalam sel (Ward, 1983).

Menurut Winarno (1983), beberapa enzim protease yang terdapat dalam pankreas atau usus halus ikan lele, diantaranya:

1. Tripsin, berfungsi untuk memotong protein pada urutan asam amino setelah asam amino basa, yaitu Lysin dan Arginin.

2. Kimotripsin, berfungsi memotong protein pada urutan asam amino setelah asam amino aromatik, yaitu fenilalanin, Tyronin, dan Triptophan.

3. Elastase, berfungsi memotong protein pada urutan asam amino setelah asam amino non-polar kecil yaitu Alanin dan Serin.

4. Amino peptidase, berfungsi memotong protein pada asam amino ujung-N.

5. Karboksi peptidase, berfungsi memotong protein pada asam amino ujung-C.

Beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim, salah satunya ialah enzim protease, diantaranya :

1. pH

Enzim memiliki pH optimum dimana enzim tersebut mempunyai aktivitas maksimal. Misal enzim protease yang terdapat di dalam usus halus memiliki pH optimum 7,7 berbeda dengan enzim protease yang terdapat di lambung dengan pH optimum 2. Apabila enzim berada pada kondisi pH di atas atau di bawah pH optimum, maka aktivitas enzim berkurang (Nelson et al., 2008). Perubahan pH dapat

(8)

mempengaruhi ionisasi pada sisi aktif enzim atau mempengaruhi struktur tersier dari apoenzim. Selain itu, perubahan pH yang drastis dapat menyebabkan denaturasi protein (Lehninger, 1982).

2. Suhu

Enzim rpotease memiliki suhu optimum 470_{C. Sehingga, jika} suhunya dibawah suhu optimum, aktivitas enzim protease tidak optima. Namun, jika suhu melebihi suhu optimum dapat menyebakan denaturasi enzim; aktivitas enzim akan berkurang (Lehninger, 1982). 3. Inhibitor

Inhibitor adalah senyawa yang bersifat menghambat katalisis, memperlambat atau menahan reaksi enzimatik. Inhibisi aktivitas enzim dapat bersifat irreversibel, yaitu terikat secara kovalen pada enzim atau reversibel yaitu dapat terdisosiasi dari enzim (Lehninger, 1982).

Metode yang digunakan untuk mengukur aktivitas protease pada praktikum ini ialah metode hidrolisis kasein. Buffer Tris-HCl sebanyak 350 µL dimasukkan ke dalam masing-masing tabung (tabung sampel 1, tabung sampel 2 dan blanko). Buffer Tris-HCl ini berfungsi sebagai larutan penyangga. Kemudian, Ekstrak enzim dimasukkan ke dalam tabung sampel 1 dan sampel 2 sebanyak 50 µL, sedangkan pada tabung blanko, ekstrak enzim dimasukkan setelah inkubasi. Ekstrak enzim ini ialah protease yang berfungsi memecah protein. Seluruh tabung diinkubasi pada suhu 370_{C selama 10 menit. Inkubasi dilakukan untuk} meningkatkan aktivitas enzim, karena masing-masing enzim memiliki aktivitas berbeda-beda pada suhu tertentu. Selanjutnya, subtrat kasein 1% dimasukkan ke dalam masing-masing tabung sebanyak 350 µL. Kasein berfungsi sebagai substrat yang akan terikat pada sisi aktif enzim sehingga pengukuran aktivitas enzim dapat dilakukan.Seluruh tabung diinkubasi kembali selama 20 menit pada suhu 370_{C untuk memulai aktivitas enzim menghidrolisis substrat. Reagen TCA} 8% ditambahkan ke masing-masing tabung sebanyak 750 µL. TCA (Tri

Chloroacetat Acid) berfungsi sebagai inhibitor yang menghentikan reaksi antara

enzim dan substrat. Seluruh tabung dimasukkan ke dalam refrigerator selama 15 menit agar terbentuk natan dan supernatan. Dipindahkan ke dalam tabung ependorf , kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Hal ini bertujuan akan supernatan benar-benar terpisah dari natan. Supernatan sebanyak 1000 µL ditambahkan ke dalam tabung berisi akuades sebanyak 1500

(9)

µL agar tidak terlalu pekat, sehingga dapat diukur absorbansinya menggunakan spektrofootometer, kemudian divortex agar homogen. Selanjutnya diukur pada 280 nm. Hasil absorbansi kemudian dihitung unit aktivitas enzimnya. Unit aktivitas enzim merupakan jumlah enzim yang menyebabkan kenaikan 0,001 A unit/menit (Schenk, 1981).

Berdasarkan hasil perhitungan, diketahui aktivitas enzim protease yang dinyatakan dalam konsentrasi (x) ikan lele yang diberi pakan memiliki hasil yang lebih tinggi, yaitu 94.460,5 U sedangkan hasil dari ikan lele yang dipuasakan adalah 32.223 U. Begitu juga dengan hasil perhitungan aktivitas enzim protease per menit. Ikan lele yang diberi pakan memiliki hasil yang lebih tinggi yaitu 4723, 025 U/ menit, sedangkan ikan lele puasa ialah 1611,15 U/menit. Hasil ini sesuai dengan pustaka. Menurut Hanum et al., (2013), pada saluran digesti, pakan akan bertindak sebagai penginduksi aktivitas enzim. Oleh sebab itu ikan yang diberi pakan akan memiliki aktivitas enzim yang lebih tinggi daripada ikan yang dipuasakan.

(10)

IV. KESIMPULAN DAN SARAN IV.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pengamatan sebelumnya, dapat disimpulkan bahwa :

1. Kapasitas pencernaan ikan yang terukur sebagai aktivitas protease

pada ikan lele yang diberi pakan memiliki aktivitas yang lebih tinggi yaitu 94.460,5 U dan 4723,025 U/menit, sedangkan ikan lele yang dipuasakan aktivitas enzim proteasenya lebih rendah yaitu 32.223 U dan 1611,15 U/menit.

IV.2. Saran

Seharusnya praktikum dimulai tepat waktu, sehingga tidak terjadi keterlambatan waktu saat selesai praktikum yang terlalu lama.

(11)

DAFTAR REFERENSI

Arifin, M.Z. 1991. Budidaya Lele. Semarang : Dohara prize.

Hanum, Wieka Mahalida., Untung Susilo., & Slamet Priyanto. 2013. Aktivitas Protease dan Kadar Protein Tubuh Ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus) pada Kondisi Puasa dan Pemberian Pakan Kembali. Jurnal.pp. 1-7.

Hlophe, S. N., N. A. G. Moyo., & I. Ncube. 2014. Postprandial changes in pH and enzyme activity from the stomach and intestines of Tilapia rendalli (Boulenger, 1897), Oreochromis mossambicus (Peters, 1852) and Clarias gariepinus (Burchell, 1822). J. Appl. Ichthyol. Vol. 30, pp. 35–41.

Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia, diterjemahkan oleh M. Theniwidjaja. Jakarta : Erlangga.

Nelson, D.L. & M.C. Michael. 2008. Principle of Biochemistry Fifth edition. New York : W.H. Fremann and Company.

Roa, R.L. & H.J. Vicente. 2009. Compensantory Weight Gain and Muscle Tissue Biochemical Composition of GET Excel Tilapia (Oreochromis niloticus) Juvenniles. Journal of Environment and Aquatic Resources. Vol 1(1), pp. 99-111.

Schenk, G.H. 1981. Quantitative Analytical Chemistry. New Jersey : Prentice Hall.

Susilo, Untung., Nuning Setyaningrum., & Farida Nur Rachmawati. 2013. Aktivitas Protease dan Komposisi Proksimat Tubuh Ikan Sidat (Anguilla

bicolor Mcclelland) pada Kondisi Puasa dan Pemberian Pakan Kembali. Jurnal, pp. 1-8.

Ward, O.P. 1983. Proteinases In Fogatory Microbial Enzymes and Biotechnology. New York : Applied Science Publisher.

Winarno, F.G. 1983. Enzim Pangan. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama.

Zhu, X., S. Xie., Z. Zou., W. Lei., Y. Cui., Y. Yang., & R.J. Wootton. 2004. Compensantoryy growth and food consumption in gibel carp Carrassius

auratus gibelio and Chinese longsnout catfish Leiocassis longirostris,

Experiencing cycles of feed deprivation and re-feeding. Aquaculture. Vol. 241, pp. 235-247.