ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN
TAKSONOMI MIKROBA
Medium dan Biakan
•Medium: Nutrien yang digunakan organisme
untuk tumbuh di luar habitat alaminya
•Biakan: Perbanyakan mikroorganisme
menggunakan berbagai media
Komponen Media
Makronutrien (C, N, P, K)
Mikronutrien (Fe, Mg, Ca, Na)
Macam Media Mikrobiologis
Media Kimia Tertentu (defined)
Komposisi kimia penyusun media
diketahui dengan pasti
Media Kompleks (undefined)
Komposisi kimia penyusun media
tidak diketahui dengan pasti
Sering tersusun dari ekstrak tanaman
atau hewan seperti ekstrak kedelai,
ekstrak kecambah, protein susu, dll.
Macam Media Mikrobiologis
Media Padat
Media yang tersusun dari bahan padat
Media Cair
Media yang bahan-bahan penyusunnya
dilarutkan dalam air
Media Semipadat
Media yang telah diberi bahan pembuat gel
Agar (paling sering digunakan) Gelatin
Silika gel (digunakan bila membutuhkan pembuat gel
Tujuan Penggunaan Media
Umum
Nutrien Broth/Agar, Luria Bertani
Selektif & Pembeda
Medium bebas N
Pengayaan
Medium plus senyawa tertentu
Pengujian
Media Seletif & Pembeda
Media Selektif
Mengandung bahan yang menghambat pertumbuhan mikroba tertentu tetapi tidak yang lain
Seringkali digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme tertentu dari populasi mikroorganisme lainnya
Media Pembeda
Mengandung indikator yang menghasilkan reaksi
berbeda antar mikroorganisme (contoh, warna koloni berbeda)
Dimaksudkan untuk memacu pertumbuhan mikrobia
yang dikehendaki dan menghambat mikrobia yang tidak dikehendaki
Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC): antibiotik yang menghambat pertumbuhan bakteri. Cocok untuk isolasi Fungi
Brilliant Green Agar: Senyawa kimia cat Green
menghambat bakteri Gram (+). Cocok untuk isolasi bakteri Gram (-)
Bismut Sulfite Agar: Cocok untuk isolasi Salmonella typhi, menghambat bakteri lain
Coliform pada media Lauryl Tryptone Broth
pada suhu 30
oC mampu menghasilkan gas,
sedangkan non-Coliform tidak tumbuh atau
tumbuh tapi tidak menghasilkan gas
Baird Parker Agar: untuk membedakan
Staphylococcus aureus
Egg Yolk: S. aureus mampu memecah egg yolk
dan menberikan zona bening sekitar koloni
Memungkinkan pertumbuhan mikroba yang
diinginkan
Contoh: Di dalam tanah hanya terdapat sejumlah
kecil mikroba pendegradasi fenol di antara berjuta-juta mikroba lainnya
Medium yang mengandung fenol diinokulasi tanah tersebut
dan diinkubasi
Biakan yang mulai tumbuh dipindahkan/reinokulasi ke
medium baru (diulang beberapa kali)
Hanya mikroba yang mampu memetabolisme fenol yang
tumbuh dalam medium tersebut
Inokulasi media mengandung agar
untuk memperoleh koloni tunggal
Biakan campuran
Goresan di permukaan media yang
mengandung agar
IDENTIFIKASI MIKROBA
YANG TELAH DIISOLASI
Taksonomi Konvensional vs.
Molekular
Karakter Fenotipik
Termasuk di dalamnya karakter fisik dan
biokimia
Dua mikroba yang tak berhubungan bisa
memiliki fenotipe yang sama
Filogeni
70% DNA terhibridisasi?
97% kesamaan pada 16S rRNA?
Mikroba dengan fenotipe berbeda dapat
Karakter Fenotipik yang Digunakan
dalam Taksonomi Konventional
Morfologi, reaksi pengecatan Gram, dinding sel, lipida,
organela inklusi dan penyimpan produk, pigment,
penggunaan sumber karbon, penggunaan sumber
nitrogen, penggunaan sumber sulfur, produk
fermentasi, kebutuhan gas, kisaran suhu, kisaran pH,
patogenisitas, hubungan simbiotik, habitat.
Prosentasi G+C
“Komposisi basa DNA merupakan salah satu
karakter yang perlu diketahui untuk melakukan
deskripsi
minimal
dari suatu genera dan spesies”
(Lévy-Frébault & Portaels, 1992; Goodfellow&
O’Donnell,1993).
Seringkali,
nisbah GC
juga digunakan.
Jika dua mikroba yang diduga berkerabat dekat
berdasarkan kriteria fenotipiknya tidak memiliki kemiripan nilai GC, maka pada kenyataannya mereka tidaklah berkerabat dekat.
Kandungan GC
Struktur duplek DNA : G-C dan A-T
Kandungan G+C (mol% GC) beragam dalam mikroorganisme
Titik denaturasi oleh panas meningkat OD260 meningkat.
Kesimpulan:
1. Beda kandungan G+C<5% dalam spesies yang sama 2. Perbedaan %GC hubungan kekerabatan jauh
3. Komposisi basa DNA bermanfaat untuk melihat/mengukur keberagaman genetik
Peranan 16S rRNA
70S ribosom 50S subunit 30S subunit 16S rRNA 34 protein 21 protein 23S rRNA 5S rRNAOperon Ribosomal RNA (rRNA)
16S rDNA 23S rDNA 5S
1500 bp 3000 bp 120 bp
ITS
16S rRNA 23S rRNA 5S rRNA Pemrosesan
Inti
Sitoplasma
16S-23S 23S-5S
Filogenetik dalam Mikrobiologi
1.
Memahami hubungan evolusioner
(=
filogenik
)
antar organisme
Cukup berbeda daripada yang semula
dipahami
2.
Ekologi Mikroba
Kemampuan untuk membuktikan
struktur
Skema Penentuan Urutan Basa (sequencing)
Gen 16S rRNA
Cloning or single-strand prep DNA 16S rRNA gene PCR Vector + 16S rRNA Sequencing Database search Phylogenetic tree DNA extractionAmplifikasi Gen 16S rRNA
menggunakan PCR
DNA Genom atau lisat sel
95 C, 1 min 60 C, 1 min 72 C, 2 mins 35 daur Primer PCR dNTP
Taq DNA polymerase
Primer 9F
(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
Primer 1542R
(5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)
16S rRNA gene
Gambar hasil elektroforesis pada gel agarosa dari gen 16S
rRNA yang diamplifikasi menggunakan PCR
1636 bp
Urutan basa (sequence) gen 16S rRNA dari
galur Chj707
T1 gtttgatcct ggctcaggat gaacgctagc ggnaggccta acacatgcaa gccgagcggt 61 atggatagct tgctatccag agagcggcgt acgggtgcgt aacacgtgtg caacctgcct 121 ttatctgggg gatagccttt cgaaaggaag attaataccc cataatatgg tgtccggcat 181 cggtcgcatt gaaagcctcg gcggatagag atgggcacgc gcaagattag atagttggcg 241 gggtaacggc ccaccaagtc gatgatcttt aggggtcctg agagggagat cccccacact 301 ggtactgaga cacggaccag actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat tggacaatgg 361 gtggaagcct gatccagcca tcccgcgtga aggatgacgg tcctatggat tgtaaacttc 421 ttttgtacag ggataaacct gccctcgtga gggcagctga aggtactgta cgaataagca 481 ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcgagcgtt atccggattt 541 attgggttta aagggtccgt aggcgggcct gtaagtcagt ggtgaaatct catagcttaa 601 ctatgaaact gccattgata ctgcaggcct tgagtaaatt tgaagtggct ggaataagta 661 gtgtagcggt gaaatgcata gatattactt agaacaccga ttgcgaaggc aggtcactaa 721 gatttaactg acgctgatgg acgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 781 gtccacgccg taaacgatgc taactcgttt ttggacttcg ggttcagaga ccaagcgaaa 841 gtgataagtt agccacctgg ggagtacgtc cgcaaggatg aaactcaaag gaattgacgg 901 gggcccgcac aagcggtgga ttatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttacca 961 agacttaaat gggaattgac agatttagaa atagatcctc cttcgggcaa ttttcaaggt 1021 gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgttagg ttaagtcctg caacgagcgc 1081 aacccctgcc aacagttgcc atcattcagt tggggactct gttgggactg cctacgcaag 1141 tagagaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcacggccc ttacgtcttg ggccacacac 1201 gtaatacaat ggccggtaca gagggcagct acctggtgac aggatgcgaa tctcgaaagc 1261 cggtctcagt tcggattgga gtctgcaact cgactctatg aagctggaat cgctagtaat 1321 cgcgcatcag ccatggcgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag 1381 ccatggaagt ctggggtacc tgaagtcggt gaccgtaata ggagctgcct agggtaaaac 1441 aggtaactag ggctaagtcg taacaagggg gg
Panjang Total: 1472bp
Hasil Pembandingan terhadap Database
NCBI menggunakan program BLAST
Hasil Pembandingan terhadap Database
NCBI menggunakan program BLAST
Chryseobacterium gleum ATCC35910T (M58772)
Chryseobacterium indologenes ATCC29897T (M58773)
Chryseobacterium joostei LMG18212 (AJ271010) Chryseobacterium proteolyticum 9670 (AB039830) Chryseobacterium defluvii B2T (AJ309324)
Chryseobacterium indoltheticum ATCC27950T (M58774)
Chryseobacterium balustinum ATCC33487T (M58771)
Chryseobacterium scophthalmum LMG13028T (AJ271009)
Chj707T
Ko2 Ko10
Bergeyella zoohelcum ATCC43767T (M93153)
Riemerella anatipestifer ATCC11845T (U10877)
Riemerella columbina LMG11607T (AF181448)
Chryseobacterium meningosepticum ATCC13253T (M58776)
Empedobacter brevis ATCC14234T (M59052)
Weeksella virosa ATCC43766T (M93152)
Ornithobacterium rhinotracheal LMG9086T (U87101)
Coenonia anatina LMG14382T (Y17612)
Cellulophaga lytica ATCC23178T (M62796)
Flavobacterium aquatile ATCC11947T (M62797)
82 100 100 59 100 95 98 100 98 62 75 98 89 75 46 27 59 0.02 Pohon filogenetik (cabang Chryseobacterium- Bergeyella-Riemerella)
Resolusi Taksonomik (yang saat ini digunakan)
PEMONITORAN
DAN
Plate Counts: Dengan membuat pengenceran
berseri dari cuplikan
Pengukuran Pertumbuhan Mikroba
menggunakan Pembiakan
Media agar dalam
cawan Petri
diinokulasi
(dicampurkan dengan
agar pada pour plate
atau diratakan di
permukaan agar pada
plate count) dengan
pengenceran berseri
Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang
muncul di media agar dihitung. Hanya berlaku
untuk agar yang memiliki 30-300 koloni (CFUs)
Menggunakan
banyak tabung
Yang dihitung
adalah tabung
yang
menunjukkan
positif dan
dibandingkan
dengan tabel
statistik MPN
Pengukuran Pertumbuhan Mikroba
Senyawa
Organik (CH
2O)
+ O
2CO
2+ H
2O +
senyawa
antara
metabolisme +
materi sel +
energi (ATP)
Pengukuran Pertumbuhan Mikroba
dengan Pembiakan
CO
2+ 2 NaOH
Na
2CO
3+ H
2O
ATP + D-lusiferin + O
2oksilusiferin + AMP + pirofosfat + CO
2+ sinar
(562 nm)
lusiferase
Pengukuran Pertumbuhan Mikroba
tanpa Pembiakan
DETEKSI MIKROBA
TANPA PEMBIAKAN
Metoda Molekular untuk
Mendeteksi Mikroba
Komponen dinding sel, Protein,
Lipopolisakarida
RNA
Asam Nukleat
DNA
LMW RNA Teknik menggunakan PCR
LMW (Low Molecular Weight) RNA
Molekul RNA yang berberat molekul rendah, memiliki nilai yang tinggi untuk mempelajari keragaman dalam populasi karena karakter khususnya.
Karakter LMW RNA
Stabil selama masa pertumbuhan sel, dan tidak tergantung
komposisi media pertumbuhan.
Dimiliki oleh semua jenis sel hidup: prokaryot maupun eukaryot.
Memiliki fungsi yang sama di semua sel hidup: Untuk sintesis protein.
LMW RNA
Molekul yang mana saja?
5S rRNA
5.8S rRNA
tRNA class 1
tRNA class 2
LMW RNA PROFILING:
PROFIL LMW RNA
Kenapa bisa disebut
sidik jari molekular
mikroba?
Spesies prokaryot dari genus yang
sama menunjukkan 5S rRNA yang identik.
Spesies eukaryot dari genus yang
sama menunjukkan kombinasi zona 5S-5.8S rRNA yang identik.
Galur-galur dari spesies prokaryot
maupun eukaryot yang sama menunjukkan profil tRNA yang identik
METODA ANALISIS DNA
Ukuran dan struktur suatu molekul DNA
Derajat kekerabatan antar molekul menggunakan prosedur hibridisasi DNA Plasmid DNA Kromosom Kelemahan:
i. Kurang stabil di beberapa galur
ii. Beberapa galur tak memiliki plasmid
iii. Dapat terjadi transfer plasmid antar galur
Teknik terkait PCR
Penentuan urutan basa DNA
(sequencing) suatu gen
Profiling dari produk PCR yang
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
PROFILING DNA PLASMID
Plasmid adalah molekul asam nukleat yang paling mudah diuji.
Molekul-molekul tersebut berperan penting karena membedakan kemampuan galur mikroba.
Kemampuan galur mikroba untuk menjadi simbion atau patogen ditentukan oleh plasmid yang dimilikinya.
DNA plasmid mudah diekstrak dan dielektroforesis menggunakan gel agarosa sederhana.
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Thermal Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)
Prinsip:
Berdasarkan amplifikasi zona GC berkeragaman tinggi (hyper-variable) dari 16S rDNA, dan pemisahan fragmen DNA yang dihasilkannya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida dengan keberadaan senyawa denaturan atau suhu bergradien linier
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Thermal Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)
Keunggulan: dapat dipercaya, reproducible,
cepat dan relatif murah
Pembatas: Baru dimanfaatkan untuk prokaryot.
Sidik jari tidak terkait langsung dengan
informasi taksonomi
Analisis perbandingan urutan DNA dengan
database 16S rDNA
Analisis pola hibridisasi dengan probe
oligonukleotida spesifik taxon terhadap
16SrRNA
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
Prinsip:
Berdasarkan pembentukan struktur melipat dari benang DNA untai tunggal yang tergantung urutan DNA
penyusunnya. Biasanya terdapat di daerah berkeragaman tinggi dari gen 16S rRNA.
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
Keunggulan: Cepat dan
dapat membedakan di
tingkat spesies
Pembatas: Sidik jari tidak
dapat digunakan
untuk analisis
filogenetik
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Metoda terkait PCR Prinsip:
Berdasarkan pola
pemotongan menggunakan enzim endonuklease restriksi terhadap produk PCR.
Produk PCR dihasilkan menggunakan
oligonukleotida primer yang didesain untuk menempel di urutan basa DNA konsensus di berbagai gen (yang paling sering digunakan adalah gen 16S rRNA)
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Metoda terkait PCR
Keunggulan: Telah digunakan
baik pada prokaryot
maupun eukaryot.
Pembatas
:
Kadang-kadang
tidak diperoleh
pembedaan pada
tingkatan taksonomik,
tergantung pada zona
diterapkannnya enzim
endonuklease restriksi.
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Metoda terkait PCR Prinsip:
Berdasarkan keragaman alami dari panjang gen 16SrRNA (atau gen lain).
Oligonukleotida berfluoresen
digunakan sebagai primer forward, bersama primer reverse yang tidak berlabel, untuk mengamplifikasi daerah berkeragaman tinggi dari gen 16 rRNA. Fragmen yang
dihasilkan dideteksi berdasarkan fluoresensi yang diinduksi laser dengan deteksi menggunakan sequencer otomatis.
Length heterogeneity-PCR (LH-PCR)
Pembatas: Tingkat
pembedaan lebih rendah daripada teknik T-RFLP, karena kelompok
taksonomi yang berbeda dapat menghasilkan
produk dengan panjang yang sama
Operon Ribosomal RNA (rRNA)
16S rDNA 23S rDNA 5S
1500 bp 3000 bp 120 bp
ITS
16S rRNA 23S rRNA 5S rRNA Pemrosesan
Inti
Sitoplasma
16S-23S 23S-5S
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Metoda terkait PCR Prinsip:
Berdasarkan kespesifikan DNA
ribosom pada spesies bakteri. Fragmen yang teramplifikasi pada PCR
kemudian dielektroforesis. Pola yang diperoleh dianalisis secara matematis.
Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA)
Tingkat pembedaan pada aras
spesies berguna untuk dimanfaatkan pada studi filogenetik dan ekologis
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Metoda terkait PCR Prinsip:
Berdasarkan perbedaan panjang daerah antara (spacer) gen 16S dan 23S rRNA yang teramplifikasi. Spacer ini sangat beragam dalam ukuran dan urutan basanya.
rDNA Internal Spacer Analysis (RISA)
Keunggulan: Teknik yang sangat baik untuk
mempelajari keragaman populasi, dan dapat
membedakan hingga aras spesies. Dapat digunakan untuk karakterisasi galur
karena ada perbedaan sangat besar antar galur
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Metoda terkait PCR Prinsip:
Berdasarkan pola yang terbentuk dari elektroforesis langsung hasil PCR menggunakan satu primer pendek dan suhu annealing rendah, yang menghasilkan
amplifikasi acak.
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Metoda terkait PCR
Prinsip:
Berdasarkan hasil amplifikasi 16S
rDNA menggunakan dua primer
universal pada konsentrasi tinggi (10 kali) dengan suhu annealing 50-55ºC
Two-primers RAPD (TP-RAPD)
Teknik ini sangat bermanfaat untuk
mempelajari taksonomi dan keragaman
dengan pembedaan hingga aras spesies pada bakteri dan jamur
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba
Metoda terkait PCR Prinsip: Berdasarkan pola elektroforesisi langsung hasil PCR menggunakan primer untukmengamplifikasi urutan DNA pendek berulang (short
repetitive sequence) yang
banyak ditemukan di jasad prokaryot.
Repetitive element sequence-based PCR (rep-PCR)
Keunggulan: These techniques show intraspecific variations among microorganisms, and have resolution at species level, so their
DNA Fingerprinting of Microorganism Populations
PCR-based methods Principle:
Depending on the number of primers used, there are different techniques based on repetitive sequences:
Repetitive element sequence-based PCR
1 primer:
BOX-PCR
2 primers:
