PENELITIAN KECIL
PROYEK FISIOLOGI MIKROBA
Perbandingan Konsentrasi Amilase
Bacillus subtilis
yang Terpisahkan dari
Induksi dengan Pati dan Tepung Kulit Pisang
KELOMPOK 4
Katalis hidrolisis protein melalui pelepasan
ikatan peptida
banyak digunakan dalam proses pengolahan makanan, pengembangan agen terapeutik, dan bidang medis lainnya, serta industri detergen dan tekstil
(Mukhtar, dkk., 2012)
PROTEASE
AMILASE
Pemutus
ikatan
α
-1,4 antara unit
glukosa yang berdekatan
(Bano, dkk., 2011)
secara umum digunakan pada industri pembuatan kertas, tekstil, farmasi, maupun
pangan
LATAR BELAKANG
AMILASE
&
PROTEASE
Merupakan dua enzim
yang penting dalam
industri enzim
(Lebih dari 70% total pasar
industri enzim dunia)
(Mukhtar, dkk., 2012)
Bacillus subtilis
dapat
memproduksi
amilase dan
LIMBAH KULIT PISANG
Sumber karbon, seperti dekstrin, fruktosa, glukosa,
laktosa, maltosa, dan pati tergolong mahal untuk
produksi enzim secara komersial.
(Unakal, 2012)
- Mengandung pati
- Dibuat menjadi tepung
- Dipakai untuk menggantikan pati murni
dalam induksi amilase
- Lebih murah
TUJUAN
1. Mengisolasi amilase dan protease dari
B. subtilis
.
2. Memekatkan amilase dan protease dengan
presipitasi ammonium sulfat.
3. Memisahkan amilase dari protease menggunakan
metode purifikasi afinitas dengan memanfaatkan
insoluble starch
dan maltosa.
4. Menentukan pengaruh induksi variasi pati (pati dan
tepung kulit pisang) terhadap produktivitas enzim
HIPOTESIS
1.Amilase dan protease dapat diisolasi dari
B. subtilis.
2.Amilase dan protease dapat dipekatkan dengan
presipitasi oleh ammonium sulfat.
3.Amilase dapat dipisahkan dari protease
menggunakan metode purifikasi afinitas dengan
memanfaatkan adsorbsi oleh
insoluble starch
dan
elusi oleh maltosa.
ALAT
No Alat Jumlah
1 Sentrifuga suhu dingin 1
2 Erlenmeyer 100 ml 2
3 Microtube 2 ml 180
4 Tabung reaksi 25
5 Falcon tube 6
6 Gelas kimia 100 ml 8
7 Magnetic stirer 2
8 Gelas kimia 50ml 2
No Alat Jumlah
9 Spektrofotometer 1
10 Coolbox 1
11 Kuvet 32
12 Waterbath 30°C 1
13 Erlenmeyer 250 ml 3
14 Gelas ukur 100 ml 1
15 Micropippete 1 mL 1
BAHAN
No
Bahan
Jumlah
1 kultur murni Bacillus subtilis ~
2 NB 6 g
3 Pati 200 g
4 Aseton 60 ml
5 Maltosa 10% 4 g
6 Ammonium sulfat 10 g
7 Na2HPO4 397,5 mg
8 KH2PO4 72 mg
8 Maizena 100 g
NaCl 4,5 g
HCl 3 ml
9 NA 0,5 gr
10 Larutan KI 0,3 % 18 mg 11 Larutan I2 0,2% 12 mg
No
Bahan
Jumlah
14 Butanol 60 ml
15 BSA 1 mg/ml 20 mg
16 Ninhidrin 8 g
17 Tips Kuning 50
18 Tips Biru 50
19 Kapas lemak 200 g
21 Alumunium foil 1 pack 22 Tepung kulit pisang 6, 67 g
CARA
KERJA
PENYIAPAN ENZIM
Bacillus subtillis
(NA-stok kultur)
Bacillus subtilis
50 ml NB / 250 ml 24 jam
Sampel P
Bacillus subtilis
50 ml NB + 0,2% Pati / 250 ml 24 jam, 180 rpm, 30°C
Sampel B
Bacillus subtilis
CARA
KERJA
PENYIAPAN ENZIM
Sentrifugasi dingin 8000g, 20 menit
Supernatan hasil sentrifugasi
sampel P, dinamakan SP1P, diletakkan pada
ice bath selama 5 menit
Supernatan hasil sentrifugasi
sampel B dinamakan SP1B,
diletakkan pada
CARA
KERJA
PRESIPITASI PROTEIN
25 ml SP1P dan SP1B ditambahkan
BSA hingga konsentrasi akhir
0,2 mg/ml
Ditambahkan 5 g ammonium sulfat hingga konsentrasi akhir mencapai
85% (suhu tetap 0°C), diaduk 10 menit
Disentrifugasi 10000 g 10 menit, supernatan
dibuang
Pellet digabung dan diresuspensi dengan 5mL pBS pH 6.5 serta
CARA
KERJA
PURIFIKASI AMILASE
DENGAN
INSOLUBLE STARCH
Dipindahkan 5 ml ke
Falcon tube
Cb (banana)
20 ml SP1P dan
SP1B dalam gelas kimia 100 ml
diaduk
CARA
KERJA
PURIFIKASI AMILASE
DENGAN
INSOLUBLE STARCH
Supernatan yang
dihasilkan dipindahkan ke
Falcon tube
Ub (banana)
masing-masing 15 ml
SP1P dan SP1B ditambah 4 gram insoluble starch,
diaduk 30 menit
Up (pati)
CARA
KERJA
PURIFIKASI AMILASE
DENGAN
INSOLUBLE STARCH
Supernatan yang
dihasilkan dipindahkan ke
Falcon tube
Pb (banana) Pp (pati)
Pellet hasil sentrifugasi sebelumnya, diresuspensi dengan 10mL maltosa 10%,
diaduk 30 menit
Maltosa
CARA
KERJA
PROTEASE
ASSAY
Ditambahkan 0.2 mL reagen ninhidrin ke seluruh tabung, diinkubasi 10 menit pada 37°C
Ditambahkan 0.4 mL BSA 1 mg/mL ke setiap tabung reaksi
kosong yang telah dinamai sesuai dengan jenis sampel (Cp,Up,Pp,Np,Cb,Ub,Pb,Nb)
Ditambahkan 0.2 mL sampel enzim sesuai label ke tabung
reaksi dan sampel enzim digantikan oleh deion untuk
blanko dengan BSA dan diinkubasi 30 menit pada
30°C
seluruh larutan diukur
CARA
KERJA
AMILASE
ASSAY
Diambil 1 mL dari setiap tabung, dimasukkan ke tabung reaksi berisi
iodin 0,5 mL serta ditambahkan akuades 3,5 ml
Disiapkan tabung-tabung reaksi dan setiap tabung ditambahkan 5 mL buffer
fosfat 0.1M dan 75 µL larutan pati soluble 2%
25 µL sampel enzim, masing-masing ditambahkan ke dalam tabung reaksi dan sampel enzim diganti deion untuk blanko (untuk waktu inkubasi 0 dan 20
menit masing-masing dibuat duplo), kemudian dihomogenisasi
BSA
I2
/K
I
Untuk tabung dengan waktu inkubasi 0 menit
segera diukur absorbansinya pada λ=550nm, dengan blanko
CARA
KERJA
AMILASE
ASSAY
Larutan dengan waktu inkubasi 20 menit, diinkubasi pada water
bath 30°C
Setelah inkubasi 20 menit, diukur absorbansinya pada
HASIL
Selisih Absorbansi Amylase Assay yang Diinkubasi pada Waktu Inkubasi 0 menit dan
20 menit (Pati)
AMYLASE ASSAY
Selisih Absorbansi Amylase Assay yang Diinkubasi pada Waktu Inkubasi 0 menit
dan 20 menit (Kulit Pisang)
HASIL
AMYLASE ASSAY
Hasil Penghitungan
Aktivitas Enzim
Aktivitas Enzim (
Pati
)
0,74 0,7
Enzim tidak berhasil terisolasi 0,26
Aktivitas Enzim (
Kulit Pisang
)
Dengan:
Unit enzim = Kenaikan absorbansi / Volume
HASIL
AMYLASE ASSAY
Perbandingan
Aktivitas Enzim
Perbandingan Unit Enzim pada Pati dan Kulit
Pisang
HASIL
PROTEASE ASSAY
Absorbansi Protease Assay (
Pati
)
0,4327
Absorbansi Protease Assay (Kulit
PEMBAHASAN
C U P N
Komponen selain sel
Bagian yang tidak terikat oleh
maizena
Bagian yang terikat oleh
maizena
Semua protein yang
terendapkan
PEMBAHASAN
Amylase Assay
Cp Terdapat aktivitas enzim
amilase melalui nilai aktivitas enzim
yang positif
Up Nilai aktiivtas enzim negatif, menunjukkan
tidak adanya enzim amilase pada sampel ini (tidak terserap oleh
maizena)
Pp Terdapat aktivitas enzim amilase karena dapat diserap oleh maizena dan terelusi
oleh maltosa
Np Terdapat aktivitas enzim
amilase yang sangat tinggi karena
terendapkan oleh amonium sulfat
Aktivitas enzim amilase pada Pp lebih rendah dari Np karena tidak semua
enzim dapat terelusi oleh maltosa, walaupun telah teradsorbsi oleh
PEMBAHASAN
Amylase Assay
Ub Nilai aktiivtas enzim positif, menunjukkan adanya enzim
amilase pada sampel ini
Pb Aktivitas enzim negatif karena pati dari pisang tidak begitu soluble sehingga enzim
amilase cenderung terikat pada pati ini dan tidak dapat
teradsorbsi oleh maizena
Nb Terdapat aktivitas enzim
karena dapat diendapkan oleh amonium
sulfat
Cb Terdapat aktivitas enzim
amilase melalui nilai aktivitas enzim
PEMBAHASAN
Protease Assay
Up Nilai
absorbansi tinggi karena
merupakan bagian yang tidak
dapat diadsorbsi oleh maizena
Pp Terdeteksi adanya aktivitas
enzim protease yang terbawa pada pellet (tidak
murni hanya amilase) oleh amonium
sulfat
Cp
Mengandung protease karena berupa
campuran yang tidak dipurifikasi
Cb
Mengandung protease karena berupa
campuran yang tidak dipurifikasi
Ub Nilai absorbansi positif karena protease
merupakan bagian yang tidak dapat
diadsorbsi oleh maizena sehingga tidak terendapkan,
Pb Nilai
absorbansi positif, ada protease yang terbawa
pada pellet
bersama dengan maizena oleh amonium
KENDALA
1.
Saat melakukan sentrifugasi, sampel perlu dimasukkan ke
dalam
microtube
1,5 ml terlebih dahulu sehingga diperlukan
waktu yang lebih banyak dan memengaruhi
timeline
pengerjaan.
2.
Pati pada pisang kurang
soluble
dan menyebabkan metode
purifikasi melalui afinitas menunjukkan hasil yang tidak sesuai
dengan hipotesis awal sehingga hasil perbandingan dengan
pati murni menjadi bias.
3.
Terjadi kesulitan pada beberapa pemisahan antara
pellet
dan supernatan.
KESIMPULAN
1.Amilase dan protease dapat diisolasi dari
B. subtilis.
2.Amilase dan protease dapat dipekatkan dengan ammonium
sulfat.
3.Amilase dapat dipisahkan dari protease dengan metode
purifikasi afinitas dengan memanfaatkan adsorbsi oleh
insoluble starch
dan elusi oleh maltosa (untuk induksi dengan
pati
soluble
).
SARAN
1. Sebelum pisang digunakan untuk menginduksi amilase, sebaiknya ditentukan terlebih
dahulu kadar patinya.
2. Untuk memisahkan protease dengan amilase pada hasil induksi dengan tepung kulit
pisang diperlukan metode lain selain purifikasi dengan insoluble starch dan elusi maltosa,
atau dapat pula dengan cara menyaring pati yang insoluble dengan metode yang
DAFTAR PUSTAKA
BBC. 2014. Temperature, pH, and Enzymes. [online], www .bbc .co .uk, diakses pada 21 April 2018 pukul 03.02 WIB
Emaga, T. H., Andrianaivo, R. H., Wathelet, B., Tchango, J. T., & Paquot, M.2007. Effects of the stage of maturation and varieties on the chemical composition of banana and plantain peels. Food chemistry, 103(2), 590-600.
Hadisoewignyo, L., 1Foe, K. dan Tjandrawinata, R.R. 2017. Isolation and characterization of Agung banana peel starch from East Java Indonesia International Food Research Journal 24(3): 1324-1330
Hang T. Vu, Christopher J. Scarlett, Quan V. Vuong. (2018) Phenolic compounds within banana peel and their potential uses: A review. Journal of Functional Foods40, pages 238-248.
Happi Emaga, T. ; Bindelle, J. ; Agneesens, R. ; Buldgen, A. ; Wathelet, B. ; Paquot, M., 2011. Ripening influences banana and plantain peels composition and energy content. Trop. Anim. Health Prod., 43 (1): 171-177
Ophardt, C. 2017. Starch and Iodine. [online], https:// chem .libretexts .org, diakses pada 21 April 2018 pukul 02.41 WIB
Ramli, S., Ismail, N., Alkarkhi, A. F. M., & Easa, A. M. (2010). The Use of Principal Component and Cluster Analysis to Differentiate Banana Peel Flours Based on Their Starch and Dietary Fibre Components. Tropical Life Sciences Research, 21(1), 91–100.
Schwimmer , S. & Balls, A. K. 1949. STARCHES AND THEIR DERIVATIVES AS ADSORBENTS FOR MALT α -AMYLASE.J. Biol. Chem.180:883-894 Tkachuk, R. 1975. COMPETITIVE AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF WHEAT a-AMYLASE. FEBS Letters. 52(1):66-68
McDonald, A. M. L., Stark, J. R. 1987. A CRITICAL EXAMINATION OF PROCEDURES FOR THE ISOLATION OF BARLEY STARCH. J. Inst. Brew. 94:125-132 Zamri, Y. 2016. Production of Biodegradeable plastics of banana peel. Journal of Petrochemical Engineering Volume 1
Thermofisher. 2018. Covalent Immobilization of Affinity Ligands. [online] http:// www .thermofisher .com. Diakses 21 April 2018 pukul 12.20. Priest, F. G. 1977. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriology. Review. 41:711-753.
Morikawa, M. "Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species". Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006; Vol.101, No.1, 1-8. Coleman, G. & Grant, M. A. 1966. Characteristics of a-amylase formation by Bacillus subtilis. Nature. 211: 306.
Mukhtar H., Haq I.U. Concomitant production of two proteases and alpha-amylase by a novel strain of Bacillus subtilis in a microprocessor controlled bioreactor. Braz J Microbiol. 2012;43:1072–1079.
Unakal C., Kallur R.I., Kaliwal B.B. Production of α-amylase using banana waste by Bacillus subtilis under solid state fermentation. Eur J Exp Biol. 2012;2:1044–1052 Berg, J., Tymoczko, J., Gatto, G., Styryer, L. 2015. Biochemistry 8th Edition. USA. Jogn Wiley and Sons. halaman 68 dan 73
Wingfield, P. T. (2001). Protein Precipitation Using Ammonium Sulfate. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et Al.], APPENDIX 3, Appendix–3F. http://doi.org/10.1002/0471140864.psa03fs13
Entrez Genome Project, 2003.Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168[online] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject?cmd=Retrieve&dopt=Overview&list_uids=76diakses 21 April 2018
Friedman, M. 2004. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino
