UJI PERMUTASI EFEK SINERGIS BAHAN AKTIF TANAMAN OBAT BERBASISKAN JEJARING DENGAN PROTEIN TARGET NUR HILAL A. SYAHRIR

UJI PERMUTASI EFEK SINERGIS BAHAN AKTIF

TANAMAN OBAT BERBASISKAN JEJARING DENGAN

PROTEIN TARGET

NUR HILAL A. SYAHRIR

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Uji Permutasi Efek Sinergis Bahan Aktif Tanaman Obat Berbasiskan Jejaring dengan Protein Target adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, November 2015

Nur Hilal A. Syahrir

RINGKASAN

NUR HILAL A. SYAHRIR. Uji Permutasi Efek Sinergis Bahan Aktif Tanaman Obat Berbasiskan Jejaring dengan Protein Target. Dibimbing oleh FARIT MOCHAMAD AFENDI dan BUDI SUSETYO.

Tanaman obat merupakan tanaman yang mengandung berbagai bahan aktif yang bermanfaat untuk mencegah dan menyembuhkan penyakit serta melakukan fungsi biologis tertentu. Berbeda dengan obat-obatan sintesis yang melibatkan satu senyawa kimia tunggal (one drug-one target), tanaman obat mengerahkan efek yang menguntungkan dengan tindakan aditif atau sinergis dari beberapa senyawa kimia yang bekerja pada satu atau beberapa target

(multicomponent-network target) yang terkait dengan proses fisiologis. Suatu kombinasi bahan aktif

menunjukkan efek sinergis ketika efek bahan aktif secara bersama-sama lebih besar daripada efek masing-masing bahan aktif secara terpisah. Efek sinergis bahan aktif tanaman obat dapat diidentifikasi dengan pendekatan jejaring dengan protein target. Metode NIMS (Network target-based Identification of

Multicomponent Synergy) adalah metode yang dapat digunakan untuk melihat

potensi efek sinergis dan menilai kekuatan sinergis antar kombinasi bahan aktif pada tingkatan molekular dengan mengkuantifikasi kekuatan sinergis bahan aktif yang disebut dengan skor sinergi.

Kajian efek sinergis diterapkan pada ramuan jamu yang sedang dikembangkan di Pusat Studi Biofarmaka untuk pengobatan diabetes mellitus tipe 2 yang terdiri atas 55 bahan aktif pada empat tanaman (Bratawali, Pare, Jahe, dan Sembung). Skor sinergi yang relatif tinggi ditunjukkan oleh pasangan bahan aktif antar tanaman Jahe. Efek sinergi antar tanaman yang berbeda namun mempunyai skor sinergi yang juga relatif tinggi adalah pasangan beberapa bahan aktif tanaman Jahe dan Pare, serta pasangan beberapa bahan aktif tanaman Bratawali dan Jahe. Berdasarkan hasil uji permutasi, skor sinergi tersebut signifikan.

SUMMARY

NUR HILAL A. SYAHRIR. Permutation Test Synergistic Effect of Active Ingredients of Medicinal Plants Based on Network of Protein Target. Dibimbing oleh FARIT MOCHAMAD AFENDI dan BUDI SUSETYO.

Medicinal plants contain inherently active ingredients. Such ingredients are beneficial to prevent and cure diseases, as well as to perform specific biological functions. In contrast to synthetic drugs, which is based on one single chemicals (one drug- one targrt), medicinal plants exert their beneficial effects through the additive or synergistic action of several chemical compounds. Those chemical compound act on single or multiple targets (multicomponent-network target) associated with a physiological process. Active ingredients combinations show a synergistic effect. This means that the combinational effect of several active ingredients is greater than that of individual one acting separately. A network target can be used to identify synergistic effects of plants active ingredients. The method of NIMS (Network target-based Identification of Multicomponent Synergy) is a computational approach to identify the potential synergistics effect of active ingredients. It also assessess synergistic strength of any active ingradients at the molecular level by synergy scores.

We investigate these synergistic on a Jamu formula for diabetes mellitus type 2. The Jamu formula is composed of four medicinal plants, namely

Tinospora crispa , Zingiber officinale, Momordica Charantia, and Blumea balsamivera. Our work succesfully demonstrates that the highest synergy scores

on medicinal plants synergy can be seen in pairs of several active ingredients in

Zingiber officinale. On the other hand, the synergy of pairs of active ingredients in Momordica Charantia and Zingiber officinale posseses a relatively high score.

The same occurs in Tinospora crispa and Zingiber officinale. Permutation test

sucsesfully shows significance scores.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2011

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

pada

Program Studi Statistika Terapan

UJI PERMUTASI EFEK SINERGIS BAHAN AKTIF

TANAMAN OBAT BERBASISKAN JEJARING DENGAN

PROTEIN TARGET

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2015

Judul Tesis : Uji Permutasi Efek Sinergis Bahan Aktif Tanaman Obat Berbasiskan Jejaring dengan Protein Target

Nama : Nur Hilal A. Syahrir NIM : G152130251

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Dr Farit Mochamad Afendi, M.Si

Ketua Dr Ir Budi Susetyo, MS Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Statistika Terapan

Dr Ir Indahwati, M.Si.

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2014 ini ialah jamu informatika, dengan judul Uji Permutasi Efek Sinergis Bahan Aktif Tanaman Obat Berbasiskan Jejaring dengan Protein Target.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Farit Mochamad Afendi M.Si dan Bapak Dr Ir Budi Susetyo MS selaku pembimbing serta Bapak Dr.Eng Wisnu Ananta Kusuma selaku penguji luar komisi. Penghargaan juga penulis sampaikan kepada Bapak Rudi Heryanto M.Si dari Departemen Kimia dan Pusat Studi Biofarmaka, yang telah membantu selama pengumpulan data dan berdiskusi banyak dengan penulis. Teman-teman sejawat di Departemen Statistika terkhusus Rizal Bakri dan Nurul Qomariasih atas kerjasama tim yang baik dalam membuat tesis ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2015

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi DAFTAR GAMBAR vi DAFTAR LAMPIRAN vi 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 1 Tujuan Penelitian 2 Manfaat Penelitian 2

Ruang Lingkup Penelitian 2

2 TINJAUAN PUSTAKA 5

Efek Sinergis 5

Network target-based Identification of Multicomponent Synergy (NIMS) 5

DrugCIPHER-CS 5

Topology Score (TS) 5

Agent Score (AS) 8

Phenotype Similarity (Kesamaan Fenotipe) 8

Uji Permutasi 10

3 METODE 11

Data 11

Metode Analisis 11

Diagram Alir Penelitian 13

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 15

Pengumpulan Data 15

Eksplorasi Data Awal 16

Prediksi Protein Target 19

Pendugaan Skor Sinergis 22

Pengujian signifikansi skor sinergis 28

5 SIMPULAN DAN SARAN 31

Simpulan 31

Saran 31

DAFTAR PUSTAKA 33

LAMPIRAN 35

DAFTAR TABEL

1 Pangkalan data, informasi yang diperoleh, dan hasi penelusuran data 15 2 Daftar bahan aktif pada tanaman, protein target, dan interaksinya 16 3 Tiga ukuran sentralitas jejaring dan skor kepentingan protein target 24

4 Peringkat skor sinergis Pare dan Bratawali 27

DAFTAR GAMBAR

1 Metode NIMS 5

2 Prinsipis dasar drugCIPHER 6

3 Contoh struktur Human Phenotype Ontology (HPO) 9 4 Ilustrasi metode resampling dengan teknik uji permutasi 10

5 Ilustrasi struktur data penelitian 11

6 Diagram alir penelitian 13

7 Jejaring bahan aktif protein target awal 17

8 Degree distribution 18

9 Jejaring Protein-Protein Interaction (PPI) 20

10 Prediksi jejaring bahan aktif dengan protein target 21

11 Degree dari protein target (drugCIPHER) 22

12 Plot betweenness, closeness, dan degree 23

13 Matriks Topology Score, Agent Score,dan Synergy Score 26 14 Skor sinergis bahan aktif pada tanaman Pare dan Bratawali 27 15 Ilustrasi sebaran hipotesis nol yang diperoleh melalui uji permutasi 28 16 P-value skor sinergis pasangan bahan aktif tanaman obat 29

DAFTAR LAMPIRAN

1 Daftar 55 bahan aktif yang terdapat pada empat tanaman 35 2 Interaksi bahan aktif dengan protein target 37 3 Daftar interaksi antar protein (Protein-Protein interaction) 38

1

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Pola penyakit di Indonesia bahkan di dunia telah mengalami pergeseran dari penyakit infeksi ke penyakit-penyakit metabolik degeneratif (Katno & Pramono 2008). Hal tersebut terjadi seiring dengan laju perkembangan tingkat ekonomi dan peradaban manusia serta perkembangan pola hidup yang serba praktis. Penyakit metabolik degeneratif merupakan penyakit yang disebabkan oleh gangguan metabolisme tubuh akibat konsumsi berbagai jenis makanan yang tidak terkendali serta gangguan faal tubuh sejalan dengan proses degenerasi. Beberapa contoh penyakit metabolik degeneratif antara lain: diabetes, kolesterol, hepatitis, dan rematik. Salah satu bentuk pengobatan yang diupayakan mengatasi penyakit metabolik degenaratif adalah dengan penggunaan atau konsumsi obat konvensional. Penggunaan obat konvensional dalam waktu yang lama dapat memberikan efek samping secara akumulatif dan menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan pasien. Berbeda dengan pengobatan berbasis tanaman obat (jamu), efek samping yang ditimbulkan relatif kecil meskipun dikonsumsi dalam waktu yang cukup lama. Selain itu, salah satu keuntungan lain dari pengobatan berbasis tanaman obat adalah kemampuannya yang memiliki lebih dari satu efek farmakologi sehingga penyakit-penyakit metabolik degenaratif yang dipicu oleh mutasi pada banyak gen lebih tepat ditangani dengan tanaman obat (Katno & Pramono 2008). Fenomena ini menjadi daya tarik beberapa peneliti untuk mengembangkan tanaman obat.

Kemampuan tanaman obat yang memiliki lebih dari satu efek farmakologi disebabkan mengandung lebih dari satu komponen bahan aktif atau senyawa aktif. Tanaman obat melibatkan banyak komponen senyawa kimia yang bekerja pada satu atau beberapa target (multicomponent-network target) berbeda dari obat konvensional yang hanya melibatkan satu senyawa kimia tunggal dengan satu target (one drug-one target) (Li & Zhang 2013). Karena terdiri dari banyak komponen senyawa kimia, maka interaksi antar komponen sangat mungkin terjadi. Interaksi antar bahan aktif pada tanaman obat dapat berupa sinergis atau antagonis. Evaluasi mengenai sinergisme bahan aktif pada tanaman obat biasanya dilakukan secara eksperimental dalam pendekatan kasus per kasus. Meskipun beberapa metode eksperimental telah dapat dilakukan untuk menyaring kombinasi bahan aktif yang menguntungkan, evaluasi sinergis secara eksperimental membutuhkan biaya dan tenaga yang besar serta waktu yang relatif lama. Identifikasi efek sinergis kombinasi bahan aktif yang banyak pada ramuan jamu tetap menjadi masalah yang belum terselesaikan. Pendekatan komputasi muncul sebagai alternatif yang mampu mengakomodasi data yang besar dengan lebih cepat serta dapat memberikan metode yang lebih menjanjikan dan diinginkan untuk studi obat multikomponen. Li et al. (2011) mengusulkan pendekatan komputasi untuk melihat potensi efek sinergis antar kombinasi bahan aktif pada tingkatan molekular dengan menggunakan metode NIMS (Network target-based

Identification of Multicomponent Synergy).

NIMS merupakan bagian dari rangkaian jejaring farmakologi yang melihat intervensi bahan aktif pada sistem biologi yang kompleks sehingga metode NIMS

2

merupakan metode yang tepat digunakan untuk melihat sinergi pasangan bahan aktif pada studi obat multikomponen. NIMS mengkuantifikasi kekuatan sinergis pasangan bahan aktif dengan mempertimbangkan keterkaitan mekanisme kerja obat yang melibatkan peran protein target serta peran penyakit. Li et al. (2011) menginisiasikan metode NIMS dan menunjukkan bahwa metode NIMS memiliki performa yang baik dalam mengkuantifikasi dan menyaring sinergisme bahan aktif pada formula TCM (Traditional Chinese Medicine). Beberapa penelitian sebelumnya menggunakan metode NIMS untuk mengungkap mekanisme kerja formula TCM pada penyakit tertentu seperti diabetes mellitus tipe 2 (Li et al. 2014) dan penyakit rematik (Li et al. 2015). Penelitian ini merupakan langkah awal evaluasi sinergis bahan aktif dengan pendekatan komputasi menggunakan metode NIMS pada ramuan Jamu.

Metode NIMS hanya menyediakan informasi mengenai kekuatan sinergi antar pasangan bahan aktif tanaman obat. Pasangan bahan aktif mana yang perlu ditelusuri lebih lanjut (signifikan) masih menjadi tantangan dalam pendekatan komputasi ini. Pendekatan statistika menjawab permasalahan tersebut dengan pengujian hipotesis. Pengujian hipotesis yang ada pada umumnya berangkat dari asumsi sebaran tertentu (pendekatan parametrik). Salah satu pendekatan non parametrik yang mampu menangani permasalahan pengujian signifikansi pada sebaran skor sinergi yang tidak diketahui memiliki sebaran tertentu ialah metode

resampling. Metode resampling dengan teknik uji permutasi merupakan

pendekatan yang tepat dalam menguji signifikansi hubungan yang melibatkan dua peubah. Ide dasar uji permutasi yang sederhana biasanya diterapkan pada pengujian signifikansi korelasi. Pada tulisan ini, ide dasar tersebut digunakan untuk melihat menguji signifikansi hubungan sinergis pasangan bahan aktif dengan melibatkan peubah yang diasumsikan menjadi faktor yang mempengaruhi sinergisme pasangan bahan aktif.

Perumusan Masalah

Penelitian mengenai bioaktivitas obat atau analisis komponen bahan aktif yang terdapat dalam tanaman obat telah banyak dilakukan bahkan telah terdokumentasi dengan baik dalam satu pangkalan data bioinformatika. Namun penjelasan detail mengenai mekanisme kerja pada tingkat molekular dan aktifitas farmakologi dari masing-masing senyawa yang terkandung dalam tanaman obat tersebut serta interaksi senyawa yang terkandung dalam tanaman obat khususnya pada ramuan jamu masih perlu dikembangkan (Sari 2014). Berbeda dengan TCM (Traditional Chinese Medicine), perkembangan mekanisme kerja pada ramuan jamu pada tingkatan molekuler belum banyak dikaji. Salah satu upaya mengungkap mekanisme kerja jamu pada tingkatan molekuler dapat dilakukan dengan pendekatan komputasi. Pendekatan komputasi pada penilitian ini mengkaji sinergisme antar pasangan bahan aktif.

3

Tujuan Penelitian

Tujuan utama penelitian ini adalah:

1. Menduga kekuatan sinergis antar kombinasi bahan aktif melalui pendekatan komputasi berbasis jejaring dengan protein target dengan metode NIMS

2. Menguji signifikansi kekuatan sinergis antar kombinasi bahan aktif menggunakan metode resampling dengan teknik uji permutasi

Manfaat Penelitian

Penelusuran pasangan bahan aktif mana yang yang berinteraksi secara bersinergi dapat dimanfaatkan dari kajian ini. Penelitian ini merupakan inisiasi awal dalam upaya mengungkap mekanisme kerja jamu pada tingkatan molekular melalui pendekatan komputasi. Pendekatan komputasi yang digunakan pada penelitian ini mampu mengurangi biaya dan waktu penelitian dibandingkan dengan melakukan pendekatan eksperimental. Selain manfaat praktis, kajian teoritis statistika pada penelitian ini juga bermanfaat bagi kepentingan pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi.

Ruang Lingkup Penelitian

Kajian sinergis antar bahan aktif pada tulisan ini berfokus pada ramuan jamu yang terdiri atas empat tanaman yaitu: tanaman Bratawali (Tinospora crispa), Jahe (Zingiber officinale), Pare (Momordica charantia), dan Sembung (Blumea

balsamivera). Formula jamu tersebut merupakan hasil penelitian sebelumnya oleh

Nurishmaya (2014) yang memprediksi formula jamu baru yang berkhasiat sebagai antidiabetes. Khasiat ramuan jamu dibuktikan melalui uji di laboratorium menggunakan ikan zebra sebagai hewan uji. Hasil penelitian tersebut cukup menjanjikan sehingga mekanisme kerja formula Jamu tersebut layak untuk ditelusuri lebih lanjut. Penelitian ini mengkaji efek sinergis antara bahan aktif pada tanaman obat dan tidak mengkaji efek antagonis dan toksisitas yang ditimbulkan oleh kombinasi bahan aktif pada tanaman obat.

5

2 TINJAUAN PUSTAKA

Efek Sinergis

Efek sinergis pada bahan aktif merupakan kondisi ketika efek yang dihasilkan oleh bahan aktif secara bersama lebih besar daripada jumlah dari efek tunggal dari masing-masing bahan aktif (Spinella 2002). Evaluasi efek sinergi pada bahan aktif dapat diduga melalui pendekatan komputasi.

NIMS (Network target-based Identification of Multicomponent Synergy)

NIMS merupakan pendekatan komputasi untuk mengidentifikasi pasangan agen sinergis pada tingkat molekuler. Disini “agen” dapat mengacu pada substansi kimia seperti senyawa atau bahan aktif dengan aktifitas farmakologis atau bologis. Konsep dasar NIMS yaitu mentransfer hubungan antar bahan aktif ke dalam konteks topologi jejaring dengan memanfaatkan jejaring protein target dari bahan aktif dan jejaring PPI (Gambar 1).

NIMS mengintegrasikan dua aspek yaitu berdasarkan fitur topologi jejaring protein target bahan aktif dan kesamaan fenotipe (penyakit) dari protein target bahan aktif. Skor sinergis antar dua pasang bahan aktif diperoleh dari perkalian Topology Score (𝑇𝑆) dan Agent Score (𝐴𝑆) S 1,2= TS 1,2 ×AS 1,2.

Gambar 1. Metode NIMS (Li et al. 2011)

DrugCIPHER-CS

Identifikasi profil protein target dari bahan aktif merupakan salah satu langkah penting sebelum dilakukan pendekatan komputasi untuk mengevaluasi pasangan agen sinergis. Profil protein target merupakan protein target yang diduga mempunyai kemungkinan yang besar menjadi protein target dari bahan aktif. Jejaring protein target akan terbentuk dari hasil identifikasi profil protein target yang kemudian akan dimanfaatkan dalam evaluasi sinergis. Zhao S dan Li (2010) mengusulkan metode drugCIPHER-CS untuk memprediksi profil protein target dari bahan aktif dengan menghubungkan ruang farmakologi dan ruang genomik (Gambar 2).

6

Gambar 2. Prinsip dasar drugCIPHER (Zhao & Li 2010)

Pada prinsipnya, drugCHIPER-CS melihat kedekatan bahan aktif terhadap protein target dalam skala genomik yang besar dengan mengkorelasikan informasi kemiripan struktur kimia bahan aktif pada ruang farmakologi dan interaksi antar protein pada tubuh manusia (PPI) pada ruang genomik. Metode ini didasarkan pada asumsi bahwa (i) obat dengan kemiripan struktur yang sama cenderung mengikat protein yang terkait (ii) hubungan fungsional antara protein dapat diukur dengan jarak pada jejaring interaksi protein. Profil protein target dari tiap bahan aktif dihitung dari skor concordance :

ρ_bp= cov CSb,φp σ CSb σ φ_p

dimana 𝑪𝑺𝑏 merupakan matriks kemiripan struktur kimiawi antar bahan

aktif dan 𝝋𝑝 merupakan matriks kedekatan antara protein 𝑝 dan bahan aktif 𝑏

dengan basis jejaring PPI. Profil protein target untuk masing-masing bahan aktif merupakan 100 protein target dengan skor concordance tertinggi pada masing-masing bahan aktif. 100 Protein target dengan skor concordance tertinggi pada masing-masing bahan aktif diasumsikan sebagai likelihood (kemungkinan) dari bahan aktif 𝑏 menargetkan protein target 𝑝. Profil target ini menjadi penyusun jejaring yang disebut jejaring protein target.

Kemiripan struktur kimiawi antar bahan aktif pada ruang farmakologi dihitung dengan mengubah struktur data dua dimensi bahan aktif menjadi data

biner dengan bantuan 4860 fitur sidik jari molekuler unik yang merupakan

substruktur berbagai senyawa melalui berbagai jenis teknik fragmentasi disebut sebagai sidik jari Kr. Data biner merupakan data yang berisikan dua nilai yaitu 0 dan 1. Nilai 0 menunjukkan ketidakhadiran substruktur pada bahan aktif dan nilai 1 menunjukkan kehadiran substruktur pada bahan aktif. Data biner antar dua bahan aktif kemudian dihitung kemiripannya berdasarkan koefisien kemiripan

Tanimoto. Kemiripan dua bahan aktif berdasarkan koefisien Tanimoto:

7

dengan 𝑎 adalah frekuensi substruktur kedua bahan aktif bernilai 1, 𝑏 dan 𝑐

adalah frekuensi substruktur salah satu bahan aktif bernilai 1 dan lainnya bernilai 0. 𝑑 substruktur adalah frekuensi kedua bahan aktif bernilai 0.

Matriks kedekatan antara protein 𝑝 dan bahan aktif 𝑏 dengan basis jejaring PPI mengasosiakan ruang farmakologi dengan ruang genomik juga didefinisikan pada persamaan berikut ini:

φ_bp= e-Lppk2

p_kϵT(b)

dengan 𝑝𝑘 merupakan protein target yang dituju oleh bahan aktif b. 𝐿𝑝𝑝𝑘

merupakan jarak terpendek antara 𝑝 dan 𝑝𝑘 pada jejaring PPI. 𝑒−𝐿2𝑝𝑝𝑘 digunakan

untuk mengkonversi jarak antar protein menjadi kedekatan protein. Persamaan ini menunjukkan bahwa kedekatan antara bahan aktif 𝑏 dan protein 𝑝 sama dengan penjumlahan dari kedekatan antara protein 𝑝 dan semua protein target dari bahan

aktif 𝑏. Jika dua protein tidak berhubungan, didefiniskan 𝐿𝑝𝑝𝑘 = ∞.

Topology Score (TS)

𝑇𝑆 berasal dari fitur topologi jejaring yang dibangun berdasarkan protein target bahan aktif dan interaksi antar protein. Ide dasar dari topology score adalah dengan melihat kedekatan bahan aktif berdasarkan kedekatan protein penting dari masing-masing bahan aktif dalam jejaring protein target. Berdasarkan perspektif jejaring target, diasumsikan bahwa semakin penting protein target sebagai node pada jejaring, maka semakin besar efek pengaruh bahan aktif terhadap protein target tersebut. Skor 𝐼𝑃 𝑛 dapat digunakan untuk menentukan seberapa penting protein target sebagai node dalam jejaring, dengan mengintegrasikan derajat (degree), keantaraan (betweenness), dan kedekatan (closeness).

Tiga indeks sentralitas jejaring tersebut digunakan untuk mendefinisikan sifat jejaring protein target secara terpisah atau bersama. Jika pasangan bahan aktif menghasilkan sinergi, seharusnya protein target dari bahan aktif tersebut berdekatan dalam jejaring. Dengan demikian untuk mengevaluasi skor kepentingan sebuah node 𝐼𝑃 (𝑣) dari protein target dari bahan aktif-1 , protein target dari bahan aktif -2, dan jarak jejaring antara dua set protein target tersebut, 𝑇𝑆 dapat diperoleh dengan persamaan

TS 1,2=1₂

IP1 i ×exp⁡ -min di,j i

IP1

i i +

IP2 j ×exp⁡ -min dj,i j

IP2

j j

di mana 𝐼𝑃1 𝑖 merupakan dari protein target dari bahan aktif-1 dan 𝐼𝑃2 𝑗

merupakan dari protein target dari bahan aktif-2 yang dihitung dengan mengintegrasikan degree, betweenness, dan closeness melalui analisis komponen utama (AKU). Fungsi eksponensial negatif digunakan untuk memboboti interaksi dua protein target berdasarkan panjang lintasan terpendek. min 𝑑𝑖,𝑗 merupakan

lintasan terpendek dari protein target-i dari bahan aktif-1 terhadap semua protein target-2, sementara min 𝑑𝑗 ,𝑖 merupakan lintasan terpendek dari protein target-j

dari bahan aktif-2 terhadap semua protein target-1. Skor topologi juga berada pada kisaran 0-1. Semakin tinggi nilai skor topologi maka semakin tinggi kekuatan sinergi pasangan bahan aktif berdasarkan kedekatan protein target bahan akatif tersebut.

8

Sentralitas Perantara Betweenness Centrality (𝐵𝑖) adalah ukuran sentralitas

node dalam sebuah jejaring. Ukuran ini tidak hanya berisi informasi lokal namun mencerminkan peran sebuah node dalam struktur jejaring global. 𝐵𝑖 dihitung

sebagai pembagian lintasan terpendek antara pasangan node yang melewati node yang diberikan. Untuk graf 𝐺: = (𝑉, 𝐸) dengan n node, 𝐵𝑖 dapat dituliskan sebagai

berikut:

Bi= _(n-1)(n-2)1 sst_s i st s≠i≠t∈V

di mana 𝑠𝑠𝑡 adalah jumlah lintasan terpendek dari 𝑠 ke 𝑡, dan 𝑠𝑠𝑡 𝑖 jumlah

lintasan terpendek dari 𝑠 ke 𝑡 yang melewati node i. Langkah ini dinormalisasi dengan jumlah pasang node tanpa node i, yaitu (𝑛 − 1) (𝑛 − 2).

Sentralitas Kedekatan (Closeness Centrality) ( 𝐶𝑖) mengukur seberapa

dekat node i terhadap semua node lain yang terdapat dalam jejaring yang didefinisikan sebagai rataan lintasan terpendek antara node i dan semua node lain yang dapat dicapai oleh node i:

Ci = n_{d (i, j)} j∈V

di mana 𝑑(𝑖, 𝑗) adalah lintasan terpendek antara node i dan j, dan n adalah jumlah node dalam jejaring. Rataan lintasan terpendek didefinisikan sebagai rata-rata banyaknya langkah sepanjang lintasan terpendek untuk semua kemungkinan pasangan node pada jejaring. Ukuran ini menunjukkan efisiensi arus informasi dalam jejaring (Nacher & Schwartz 2008).

Agent Score (AS)

AS digunakan untuk mengukur nilai kesamaan antar pasangan bahan aktif berdasarkan fenotipe (penyakit) yang dihasilkan dari produk gen (protein target). Pasangan bahan aktif dengan mekanisme kerja yang independen namun mengobati penyakit yang sama akan lebih cenderung untuk menghasilkan efek sinergis. Jika protein target terdokumentasi memiliki eksperesi genetik berupa fenotipe dalam pangkalan data OMIM, fenotipe ini akan diidentifikasi sebagai agen fenotipe untuk agen yang diberikan. AS untuk pasangan bahan aktif-1dan bahan aktif-2

AS 1,2= i,j_NPSi,j

Dimana 𝑃𝑆𝑖,𝑗 adalah nilai kesamaan antara fenotipe-i dari bahan aktif-1 dan

fenotipe-j dari bahan aktif-2, dan N adalah jumlah total pasangan fenotipe (Li et al. 2011).

Phenotype Similarity (Kesamaan Fenotipe)

Fitur fenotipe terkait dengan gen dan penyakit berperan peran penting dalam studi terkait penyakit. Informasi fenotipe dari protein target tertentu tersedia pada pangkalan data OMIM berupa teks. Namun informasi dengan kosakata standar dan terkontrol yang meliputi kelainan fenotipe (penyakit) belum dapat ditemukan pada pangkalan data OMIM. Sehingga diperlukan kosakata standar dan terkontrol yang meliputi kelainan fenotipe pada penyakit manusia, dan menjadi sumber daya yang komprehensif untuk analisis komputasi fenotipe penyakit manusia termasuk dalam melihat kesamaan fenotipe. Human Phenotype

9

Ontology (HPO) menyediakan kosakata standar dan terkontrol yang disusun pada

sebuah struktur HPO berbentuk directed acylic graph (DAG) atau biasa disebut

multitree yang merupakan graf berarah tanpa siklus. Setiap individu dinamakan term. Struktur HPO terdiri atas lebih 10.000 terms dimana sekitar 99% dari HPO terms berada pada sub-ontologi Phenotypic Abnormality (PA). Struktur HPO

memungkinkan terms untuk memiliki beberapa parent terms. Gambar contoh struktur HPO dapat dilihat pada Gambar 3.

Kesamaan antara dua fenotipe dapat dihitung berdasarkan kesamaan berpasangan dari dua set HPO term yang menjelaskan kedua fenotipe tersebut. Lord dalam Deng Y et al. 2015 mengusulkan metode untuk menggabungkan beberapa kesamaan antara dua terms menjadi satu kesamaan antara dua fenotipe dengan konsep maksimum. Misalkan fenotipe 𝑓1 dijelaskan oleh set HPO term

HPO₁ = {t₁₁, t₁₂, . . . , t_1𝑚} dan fenotipe 𝑓2 dijelaskan oleh set HPO term HPO2 =

{t21, t22, . . . , t2𝑛}. Maka matriks kesamaan terms T= tij _m×n berisi semua skor

kesamaan berpasangan dari terms pada HPO1 dan HPO2. Kesamaan fenotipe

dihitung dengan skor maksimum dari semua pasangan HPO terms pada dua set

terms, didefinisikan sebagai berikut:

PSi,j= max_{1≤i≤m, 1≤j≤n}tij

Cara yang lazim digunakan untuk mengukur kesamaan pada sebuah taxonomi ialah dengan cara mengevaluasi jarak antar node yang ingin dibandingkan. Semakin pendek lintasan dari satu node ke node yang lainnya, maka semakin besar kesamaan antar node tersebut. Resnik 2010 mengusulkan kesamaan antara dua node dengan konsep peluang serta mempertimbangkan sejauh mana kedua node tersebut memiliki informasi yang sama. Sehingga ukuran untuk mendefinisikan kesamaan antara dua terms ialah IC dari ancestors yang paling informatif untuk kedua terms.

HPO terms sim ti, tj =IC(tcommon)

10

dimana 𝑡𝑐𝑜𝑚𝑚𝑜𝑛 adalah ancestors yang paling informatif untuk term 𝑡1 dan term 𝑡₂. IC dari terms t dalam HPO dapat didefinisikan sebagai berikut:

IC t =-log⁡ p t

dimana p 𝑡 adalah probabilitas pada terms 𝑡 yang diamati dan keturunannya di semua gen / penyakit yang terhubung dengan sub-ontologi tertentu pada HPO.

Uji Permutasi

Pengujian adalah langkah penting dari statistik inferensia yang memungkinkan seseorang dalam menarik kesimpulan bahwa apakah dugaan (statistik) yang diperoleh dari data yang diamati merupakan cerminan dari populasi atau tidak. Dalam konteks pengujian skor sinergi yang diperoleh dari pendekatan komputasi, uji signifikansi dilakukan untuk melihat pasangan bahan aktif yang nyata bersinergi. Pengujian hipotesis pada skor sinergi tidak bisa dilakukan dengan pendekatan parametrik karena informasi sebaran skor sinergi yang tidak diketahui. Uji permutasi merupakan salah satu teknik untuk melakukan pengujian hipotesis dengan metode resampling pada data yang tidak memenuhi asumsi normal atau sebaran tertentu kecuali pengamatan yang menyebar independen dan identik pada sebaran hipotesis nol (Smyth dan Phipson 2010).

Uji permutasi dapat digunakan untuk menguji signifikansi hubungan yang melibatkan dua peubah (korelasi, regresi, dan hubungan lainnya yang terdifinisi dengan jelas). Ide dasar uji permutasi pada dua peubah ialah dengan mengubah urutan salah satu peubah dengan pengacakan secara konsisten pada data yang diamati. Sehingga jika diasumsikan bahwa kedua peubah mempunyai hubungan, maka diharapkan setelah dilakukan pengacakan maka hubungan antar dua peubah tersebut hilang. Hipotesis nol menyatakan tidak ada hubungan antar dua peubah. Ketika pengacakan dilakukan berulang-ulang maka diperoleh sebaran statistik uji yang merupakan kondisi sebaran hipotesis nol. Sebaran hipotesis nol sebaiknya dibangun dalam jumlah yang besar. 𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 − 𝑃 merupakan proporsi data resampling permutasi dengan nilai statistik uji ≥ statistik amatan (Hesterberg et al. 2003).

11

3 METODE

Data

Penelitian ini berfokus pada ramuan jamu yang sedang dikembangkan di Pusat Studi Biofarmaka untuk pengobatan diabetes mellitus tipe 2. Struktur data yang digunakan secara komperehensif dapat diilustrasikan pada Gambar 5.

Gambar 5. Ilustrasi struktur data penelitian

Ramuan jamu terdiri atas empat tanaman yaitu tanaman Bratawali (Tinospora crispa), Jahe (Zingiber officinale), Pare (Momordica charantia), dan Sembung (Blumea balsamivera). Ramuan jamu tersebut merupakan hasil prediksi formula jamu baru yang berkhasiat sebagai antidiabetes oleh Nurishmaya (2014). Prediksi tersebut menggunakan model PLSDA, metode support vector machine (SVM), dan koefisien PLSDA multiways. Ramuan jamu dipilih sebagai upaya untuk mengungkap mekanisme kerja ramuan jamu yang telah dibuktikan khasiatnya sebagai ramuan jamu antidiabetes melalui uji di laboratorium. Khasiat dibuktikan menggunakan ikan zebra sebagai hewan uji.

Pengumpulan data dilakukan dengan mengumpulkan informasi dari berbagai sumber pangkalan data (Lihat 4.1 Tahapan Pengumpulan Data). Tahapan tersebut terdiri atas : 1) mengumpulkan daftar bahan aktif yang terkandung pada masing-masing tanaman formula jamu, 2) mengumpulkan daftar protein target yang terdokumentasi memiliki interaksi dengan bahan aktif, 3) mengumpulkan daftar fenotipe (penyakit) yang dihasilkan dengan terlibatnya protein target pada tahapan ke-dua, 4) mengumpulkan kosa kata terstandar mengenai fenotipe (penyakit) pada tahapan ke-tiga. Upaya ini merupakan pendekatan komputasi dalam mengukur seberapa mirip fenotipe (penyakit) satu dengan fenotipe (penyakit) lainnya (Lihat 2 Tinjauan Pustaka).

Metode Analisis

I. Prediksi protein target yang merupakan dugaan protein target dari bahan aktif menggunakan metode drugCIPHER-CS

a. Menghitung matriks kesamaan struktur kimiawi antar dua bahan aktif 𝑪𝑺_55×55

Kemiripan struktur kimiawi antar bahan aktif dihitung dengan mengubah struktur dua dimensi menjadi data biner dengan bantuan 4860 fitur

12

sidik jari Kr. Data biner antar dua bahan aktif kemudian dihitung kemiripannya berdasarkan koefisien kemiripan Tanimoto, yaitu :

CSi,j=_a+2(b+c)+da+b ;i=1,2,…,55 ;j=1,2,…,55

b. Menghitung matriks kedekatan antara protein 𝑝 dan bahan aktif 𝑏 𝝋_55×9650 φ_bp= e-L_ppk2

p_kϵT(b)

c. Menghitung matriks skor concordance 𝝆55×9650

ρ_bp= cov CSb,φbp

σ CSb σ φ_bp

d. 100 Protein target dengan skor concordance tertinggi pada masing-masing bahan aktif diasumsikan sebagai likelihood dari bahan aktif 𝑏 menargetkan protein target 𝑝.

II. Pendugaan skor sinergi 𝑺_55×55 antar kombinasi bahan aktif menggunakan metode NIMS merupakan perkalian antara skor topologi (TS) dan skor agen (AS)

a. Menghitung skor topologi yang merupakan skor kedekatan protein target penting pada bahan aktif berdasarkan topologi jejaring

1. Membuat jejaring topologi yang terdiri atas jejaring protein target yang telah diprediksi pada langkah I dan jejaring PPI.

2. Menghitung tiga indeks sentralitas, 𝐷1×9650 derajat (degree), 𝐵1×9650

keantaraan (betweenness), 𝐶1×9650kedekatan (closeness).

Bi= _(n-1)(n-2)1 sst_s i

st

s≠i≠t∈V dan Ci = n_{d (i, j)}

j∈V dimana 𝑖 = 1,2, … 9650 3. Mengukur tingkat kepentingan node 𝐼𝑃1×9650 dengan menggunakan metode

analisis komponen utama pada jejaring topologi berdasarkan tiga skor indeks sentralitas di atas.

IP1×9650=PCA ( B1×9650 , C1×9650 , D1×9650 )

4. Menghitung lintasan terpendek antar kombinasi bahan aktif min 𝑑𝑖,𝑗 dan

min 𝑑𝑗 ,𝑖

5. Menghitung matriks skor topologi 𝑻𝑺55×55

TS 1,2=1₂

IP1 i ×exp⁡ -min di,j i

IP1

i i +

IP2 j ×exp⁡ -min dj,i j

IP2

j j

b. Mengukur skor agen yang merupakan kesamaan bahan aktif berdasarkan fenotipe (penyakit) berdasarkan struktur HPO

1. Menghitung Information Content (IC) untuk setiap terms pada struktur HPO IC t =-log⁡ p t dimana 𝑡 = 1,2, … ,1000

2. Mengukur kesamaan antar HPO terms 𝑠𝑖𝑚𝑟𝑒𝑠𝑛𝑖𝑘 𝑡𝑖, 𝑡𝑗

HPO terms sim ti, tj =IC(tcommon) 𝑖 = 𝑗 = 1,2, … ,1000

3. Mengukur kesamaan antar fenotipe 𝑃𝑆346×346

PSi,j= max_{1≤i≤m, 1≤j≤n}tij

4. Mengukur kesamaan antar bahan aktif berdasarkan fenotipe penyakit 𝑨𝑺_55×55 AS 1,2= i,j_NPSi,j

13 III. Pengujian signifikansi skor sinergi menggunakan menggunakan metode

resampling dengan teknik uji permutasi.

1. Identifikasi hipotesis. Hipotesis nol H0: Si,j=0 (bahan aktif-i dan bahan aktif-j

tidak bersinergi) dan hipotesis alternatif H1: Si,j>0 (bahan aktif-i dan bahan

aktif-j bersinergi).

2. Statistik uji pada dataset asli merupakan skor sinergi S_{aktual (55×55)} yang

diperoleh melalui pendekatan komputasi apada langkah II. 3. Menyusun ulang pengamatan

a. Menyusun set protein baru secara acak sehingga setiap bahan aktif memiliki pasangan set protein baru setiap kali pengacakan

b. Menghitung ulang skor sinergi

c. Mengulang langkah 3a dan 3b sebanyak 1000 kali sehingga diperoleh dataset matriks S_{permutasi (55×55)} sebanyak 1000

4. Menghitung proporsi setiap elemen Si,j (permutasi)≥ Si,j (aktual)

5. Menghitung p-value dengan membandingkan dataset asli dan 1000 dataset permutasi.

p-value = P S_permutasi ≥ S_aktual 1000

i=1

/1000 6. Tolak 𝐻0 jika p-value < α

7. Menarik kesimpulan

Diagram Alir Penelitian

Metode analisis di atas dapat dilihat secara ringkas pada diagram alir penelitian di bawah ini:

15

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengumpulan Data

Pengumpulan data dilakukan dengan menelusuri beberapa pangkalan data yang menghimpun informasi dari publikasi ilmiah mengenai objek yang terkait. Data dikumpulkan dari berbagai pangkalan data. Tabel 1 mendeskripsikan berbagai jenis data, pangkalan data yang digunakan dalam penelusuran data tersebut, sebagian informasi yang diperoleh dari pangkalan data (khususnya informasi yang diperlukan dalam metode), dan hasil penelusaran pada pangkalan data.

Tabel 1. Pangkalan data, informasi yang diperoleh, dan hasil penelusuran data Jenis

data Pangkalan data Informasi yang diperoleh dari pangkalan data Hasil penelusuran data Senyawa KNApSAcK family dan The Dictionary of Natural Products (DNP)

Daftar senyawa alami yang terdapat pada tanaman tertentu. (Afendi

et al. 2012; Running 1993) 595 senyawa pada 4 tanaman yaitu 18 pada Bratawali, 291 pada Jahe, 245 pada Pare, dan 41 pada Sembung. Bahan aktif PubChem Informasi lebih rinci

mengenai bahan aktif berupa struktur kimia,

nama kanonik

(Canonical SMILES),

Nomor CID (PubChem

CID), serta aktifitas

farmakologisnya. (Wang et al. 2009) 595 senyawa tersebut ditelusuri dan diperoleh 55 senyawa sebagai senyawa aktif (bahan aktif) yang mempunyai aktifitas farmakologis. Interaksi bahan aktif dengan protein target PubChem BioAssay

Daftar protein yang menjadi target dari bahan aktif dengan identitas protein sebagai “gi

numbers” (Wang et al. 2009)

Terdapat 1297 interaksi dari 55 bahan aktif yang menuju 205 protein yang menjadi target bahan aktif Interaksi antar protein target Human Protein Reference Database (HPRD)

Daftar protein yang saling berinteraksi (Goel

et al. 2012)

Interaksi antar protein (PPI) sebanyak 37.080 dari 9.650 protein yang terdapat pada HPRD Integrasi pangkalan data biological DataBase network (bioDBnet) Kumpulan informasi mengenai ID protein target pada database yang berbeda (Mudunuri et al. 2009)

Konversi ID protein target pada

PubChem berupa

“gi numbers”

16

Jenis

data Pangkalan data Informasi yang diperoleh dari pangkalan data Hasil penelusuran data Protein target Universal

Protein Resource (UniProt)

Informasi rinci mengenai protein target termasuk keterlibatannya dalam penyakit (Apweiler et al. 2004)

Daftar gen dan fenotipe yang terkait dengan protein target Fenotipe Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) dan Human Phenotype Ontology Kumpulan informasi mengenai penyakit pada gen/protein lebih rinci. (Hamosh et al. 2005; Robinson dan Mundlos 2010) Masing-masing protein target ditelusuri daftar fenotipe (penyakit) sebanyak 346 jenis fenotipe serta interaksi antar protein target-fenotipe sebanyak 358

Eksplorasi data awal

Prediksi protein target diawali dengan tahapan pengumpulan data awal yaitu daftar senyawa yang dikandung pada ramuan jamu pada pangkalan data

KNApSAcK family dan The Dictionary of Natural Products (DNP). Penyaringan

senyawa menghasilkan 55 senyawa aktif dari 595 senyawa yang dikumpulkan dari kedua pangkalan data tersebut. 55 bahan aktif tersebut diidentifikasi sebagai senyawa yang mempunyai aktifitas farmakologis (Lampiran 1). Masing-masing bahan aktif kemudian ditelusuri interaksinya terhadap protein target yang telah terdokumentasi pada pangkalan data PubChem. Daftar bahan aktif pada ramuan jamu, jumlah protein target yang dituju oleh bahan aktif, dan interaksi pasangan bahan aktif -protein target (Lampiran 2) secara ringkas disajikan pada tabel berikut:

Tabel 2. Daftar bahan aktif pada tanaman, protein target, dan interaksinya.

Tanaman Bahan _aktif Jumlah protein _target Interaksi bahan aktif _{- protein target}

Bratawali (Tinospora crispa) 3 63 64

Jahe (Zingiber officinale) 46 146 1064

Pare (Momordica charantia) 3 28 28

Sembung (Blumea balsamivera) 3 95 141

Jumlah 55 332 (205) 1297

Bahan aktif, protein target, dan interaksi bahan aktif dengan protein target dapat dideskripsikan dalam bentuk jejaring. Jejaring mampu merepresentasikan informasi “hubungan” antar bahan aktif dan protein target. Jejaring terdiri atas dua komponen utama, yaitu node dan edge. Node merupakan individu yang terlibat di dalam sebuah jejaring yang dilambangkan dengan bentuk lingkaran. Edge

17 merupakan hubungan atau interaksi antar masing-masing individu yang dilambangkan dengan garis yang menghubungkan antar dua individu yang saling berhubungan. Dalam konteks farmakologi, sebuah node pada jejaring farmakologi biasanya menunjukkan: (i) gen, produk gen seperti : protein target atau entitas biologis pada jejaring biomolekuler (ii) tanaman, bahan aktif atau obat dalam jejaring ramuan; (iii) fenotipe klinis penyakit dalam jejaring fenotipe (Li & Zhang 2013). Edge pada jejaring farmakologi biasanya menunjukkan interaksi antara entitas gene, produk gen, bahan aktif, fenotipe, dsb.

Gambar 7 merupakan jejaring yang terdiri atas 55 node sebagai bahan aktif dan 205 node sebagai protein target unik. Protein target unik berasal dari 332 protein target yang tereduksi menjadi 205 protein target disebabkan oleh adanya protein yang overlapping antara protein target yang berasal dari bahan aktif pada tanaman yang berbeda. Masing-masing bahan aktif menargetkan paling sedikit sebanyak satu dan paling banyak sebanyak 57 protein target. Hubungan interaksi bahan aktif dan protein target tersebut dapat direpresentasikan sebagai edge pada jejaring. Jumlah interaksi antar bahan aktif dan protein target yang diperoleh dari dokumentasi pangkalan data PubChem sebanyak 1297.

18

Karakterisasi jejaring bahan aktif dengan protein target yang diperoleh dari bahan aktif pada empat tanaman dapat dilihat dengan degree distribution (Lihat Gambar 8). Degree distribution merupakan peluang dari sebuah node pada jumlah

degree tertentu. Degree sendiri merupakan banyaknya node yang terhubung

langsung dengan suatu node. Sebuah node pada jejaring dapat memiliki degree yang tinggi maupun degree yang rendah. Node yang memiliki degree yang tinggi pada umumnya jumlahnya sangat sedikit sementara node yang memiliki degree yang rendah pada umumnya jumlahnya banyak. Jejaring yang memiliki karakteristik tersebut ialah jejaring yang alamiah terjadi disebut juga scale-free

network. Gambar 8 merupakan upaya dalam mengungkap karakter jejaring pada

Gambar 7.

Pola scale-free network pada degree distribution dicirikan dengan

power-law distribution dimana pola yang dibentuk adalah trend linier kebawah. Gambar

8(b) menunjukkan bahwa degree dari protein target mengikuti power-law

distribution. Artinya, banyak protein target tertentu dituju oleh bahan aktif dalam

jumlah sedikit sementara sedikit protein target yang dituju oleh bahan aktif dalam jumlah banyak. Sebaliknya, degree dari bahan aktif tidak menunjukkan pola

scale-free network. Hal tersebut disebabkan oleh terbatasnya ketersediaan

informasi kandungan bahan aktif tertentu dalam tanaman yang terkait dengan popularitas tanaman.

Ketersediaan bahan aktif pada tanaman seperti pada Tabel 2 terkait dengan popularitas tanaman. Jahe merupakan tanaman yang terdokumentasi mengandung banyak bahan aktif. Hal tersebut dikarenakan Jahe memiliki popularitas yang tinggi dibandingkan dengan tanaman lainnya. Penelitian ini merupakan inisiasi awal untuk menyaring pasangan bahan aktif yang bersinergi dengan pendekatan jejaring dengan protein target. Hasil yang diperoleh pada penelitian ini masih bersifat sementara seiring dengan berkembangnya penelitian lain yang memungkinkan bertambahnya jumlah daftar bahan aktif pada masing-masing tanaman tersebut.

19

Prediksi protein target dari bahan aktif

Prediksi protein target dari bahan aktif ramuan jamu diperoleh dengan menggunakan metode drugCIPHER-CS. Metode ini digagas oleh Zhao dan Li (2010) untuk memprediksi protein target dari bahan aktif dalam skala genomik yang besar dengan performa yang baik. Metode drugCHIPER-CS mengurutkan kemungkinan protein target tertentu yang menjadi target dari bahan aktif dengan mengkorelasikan kemiripan struktur kimiawi pada bahan aktif dan kedekatan antar protein target dalam jejaring PPI.

Kemiripan struktur kimiawi antar 55 bahan aktif dihitung dengan koefisien

Tanimoto berdasarkan struktur 2D berupa canonical smiles yang diperoleh dari

pangkalan data PubChem. Koefisien Tanimoto merupakan koefisen yang paling sering digunakan dalam mengukur kemiripan struktur kimiawi. Namun, tidak menutup kemungkinan masih terdapat koefisien lain yang memiliki performa yang lebih baik digunakan selain koefisien Tanimoto. Sidik jari molekular yang digunakan adalah sidik jari Klekota-Roth yang terdiri atas 4860 fitur. Selain sidik jari Klekota-Roth terdapat pula sidik jari PubChem yang terdiri atas 881 fitur, sidik jari estate 166 fitur, dan lainnya. Jumlah fitur sidik jari Klekota-Roth yang lebih banyak diharapkan mampu memberikan prediksi yang lebih akurat dalam mengukur indeks kemiripan struktur kimiawi.

Matriks kedekatan antara protein dan bahan aktif berbasis jarak antar protein dihitung dengan melihat jarak terpendek berdasarkan jejaring PPI (Lampiran 3). Jejaring PPI berbasis pangkalan data HPRD dapat dilihat pada Gambar 9. Jejaring PPI dibangun berdasarkan interaksi antar protein (PPI) sebanyak 37.080 dari 9.650 protein yang terdokumentasi pada Human Protein

Reference Database (HPRD). Beberapa protein target hanya berinteraksi dengan

sedikit protein target tertentu dan berinteraksi dengan protein yang juga tidak memiliki interaksi yang berinteraksi dengan protein target yang lain sehingga terpisahkan dari jejaring utama.

Kemiripan struktur kimiawi dan kedekatan matriks dikorelasikan sehingga menghasilkan skor concordance untuk setiap kemungkinan pasangan masing-masing bahan aktif dan 9650 protein target yang ada. 100 protein target dengan skor concordance tertinggi dari masing-masing bahan aktif dianggap telah mampu mewakili profil dari protein target yang ditargetkan oleh bahan aktif. Hasil prediksi protein target dari bahan aktif tidak hanya berasal dari 205 protein target awal yang telah terdokumentasi. Prediksi protein target bahan aktif target yang diperoleh menggunakan metode drugCIPHER-CS terdiri atas 1055 protein. Protein target tersebut dapat dihimpun dalam sebuah jejaring. Jejaring bahan aktif dengan protein target yang merupakan hasil prediksi metode drugCIPHER-CS terdiri atas 1055 node yang menjadi protein target dan 5500 edge yang merupakan interaksi dari protein target dan bahan aktif (Gambar 10). Banyaknya edge sebanyak 5500 pada protein target yang berjumlah 1055 mengindikasikan adanya protein target yang menjadi target oleh bahan aktif yang berbeda (overlapping). Dengan kata lain bahwa terdapat protein target tertentu yang selalu menjadi target dari bahan aktif yang berbeda. Kondisi tersebut dapat lebih rinci ditelusuri dengan melihat degree dari protein target.

20

21

22

Degree dari bahan aktif (Lihat Gambar 11) menunjukkan pola scale free

network. Artinya, banyak protein target yang dituju oleh bahan aktif yang sedikit

dan sedikit protein target yang dituju oleh bahan aktif yang banyak berdasarkan hasil prediksi. Pola yang ditunjukkan oleh degree dari protein target yang telah diprediksi lebih mulus dibandingkan dengan pola degree dari protein target yang berasal dari hasil dokumentasi pada Gambar 9 (b).

Gambar 11 Degree dari protein target (drugCIPHER)

Pendugaan Skor Sinergis

Untuk melihat potensi efek sinergis dari kombinasi pasangan bahan aktif pada tingkatan molekuler digunakan metode NIMS. NIMS merupakan pendekatan baru yang digunakan untuk mengukur kekuatan sinergis dari pasangan bahan aktif tertentu dari tanaman dengan menentukan interaksi protein target dari bahan aktif tersebut pada jejaring PPI. Kajian NIMS diterapkan pada 55 bahan aktif yang dikumpulkan secara manual pada empat tanaman yang telah diprediksi menuju atau menargetkan protein target tertentu (Lihat Tabel 1) yang yang terbentuk pada NIMS adalah jejaring prediksi protein target berbasis jejaring PPI.

Topologi jejaring pada NIMS digunakan untuk menghitung skor topologi yang merupakan ukuran kedekatan protein target dari masing-masing bahan aktif berdasarkan tingkat kepentingan protein tersebut dalam jejaring. Semakin penting protein target dalam jejaring maka semakin kuat pula efek yang dihasilkan oleh bahan aktif yang menargetkan protein tersebut. Jejaring topologi NIMS dibangun dari prediksi jejaring protein target dari bahan aktif berbasis jejaring PPI namun

node yang menjadi pusat perhatian adalah 1055 node yang diperoleh dari prediksi

drugCIPHER-CS. Jejaring PPI dimanfaatkan untuk melihat node tersebut secara komprehensif melihat skor kepentingan suatu node.

Tiga ukuran sentralitas yang digunakan untuk melihat skor tingkat pentingnya protein target sebagai sebuah node di dalam jejaring yaitu,

betweenness, closeness, dan degree. Gambar 12 menunjukkan plot antara ketiga

ukuran sentralitas pada 9.673 protein target pada jejaring PPI. Ukuran degree menunjukkan fitur jejaring yang umum digunakan dan hanya mampu menangkap informasi lokal dari sebuah node dengan melihat tetangga terdekat sementara ukuran sentralitas betweenness tidak hanya berisi informasi lokal namun

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 0.5 1 1.5 2 Log (bany ak ny a pr ot ei n tar get )

Log ( banyaknya bahan aktif)

Bratawali Jahe Pare Sembung

23 mengidentifikasi sebuah node dalam sebuah struktur jejaring global (Nacher dan Schwartz 2008). Gambar 12 menunjukkan bahwa protein target dengan ukuran sentralitas betweenness yang tinggi juga mempunyai jumlah degree yang tinggi. Hal tersebut mengindikasikan adanya korelasi linear positif antara ukuran

betweenness dan ukuran degree pada jejaring ini. Semakin banyak jumlah edge

atau jumlah protein target tetangga yang terhubung dengan protein target tertentu semakin besar kecenderungan protein tersebut mempunyai pengaruh pada struktur jejaring secara global. Ukuran yang lain yaitu ukuran kedekatan (closeness) merupakan ukuran seberapa dekat sebuah node tertentu terhadap node yang lainnya. Pada beberapa konteks, ukuran ini dapat dipahami sebagai ukuran seberapa cepat arus informasi yang dapat tersebar dari sebuah node tertentu ke semua node yang jauh pada jejaring.

Gambar 12 Plot betweenness, closeness, dan degree

Tiga ukuran sentralitas pada jejaring tersebut tidak dapat digantikan antara satu dengan yang lain. Ketiga ukuran tersebut mengukur tingkat kepentingan sebuah node dari aspek yang berbeda (Li et al. 2011). Oleh karena itu, ketiga ukuran tersebut diintegrasikan dengan menggunakan analisis komponen utama (AKU). AKU digunakan untuk mengintegrasi ketiga ukuran tersebut menjadi satu skor yang mencerminkan tingkat kepentingan protein target. Skor dengan satu komponen utama diperoleh dengan mengakomodir 63.6 % keragaman dari tiga ukuran tersebut. Tabel 3 menunjukkan tiga ukuran sentralitas jejaring protein target dan skor IP.

24

Tabel 3. Tiga ukuran sentralitas jejaring dan skor kepentingan protein target HPRD

ID (Betweenness) Keantaraan (Closeness)Kedekatan

Derajat (Degree) Skor IP 01859 2076572.0149 4.93915E-09 270 37.3263 05639 1627436.5529 4.93912E-09 247 31.1040 01819 1044518.2163 4.93913E-09 208 22.5823 01498 1097085.1307 4.93912E-09 172 21.4240 04078 879726.5869 4.93911E-09 209 20.7595 04380 964110.2090 4.93912E-09 182 20.4014 03333 1059068.0446 4.93908E-09 159 20.3584 00589 924379.8618 4.93913E-09 188 20.2427 00277 996849.1576 4.93912E-09 168 20.0906 02534 860588.8373 4.93911E-09 198 20.0058 00579 989001.2363 4.93912E-09 161 19.6602 05670 1013615.5288 4.93908E-09 148 19.3059 03221 895070.1069 4.93912E-09 166 18.8372 00150 743737.2228 4.93910E-09 193 18.4349 02995 780247.6140 4.93911E-09 152 16.8505 01822 765853.1845 4.93908E-09 154 16.7846 02437 768921.1592 4.93913E-09 150 16.6244 03382 771028.1936 4.93909E-09 145 16.4045 00592 877210.1434 4.93908E-09 117 16.2453 ⋮ ⋮ ⋮ ⋮ ⋮ 18482 0 2.60348E-09 0 0

Jarak terpendek antar protein target dari semua kemungkinan pasangan bahan aktif juga diukur untuk melihat kedekatan antara protein target satu dengan yang lain. Skor topologi mengintegrasi ukuran tingkat pentingnya protein target dan skor kedekatan antar protein target. Gambar 13(a) menunjukkan skor topologi dalam bentuk matriks heat map dari kombinasi 55 bahan aktif-x dengan 55 kandidat bahan aktif. Warna merah menunjukkan skor tertinggi dan warna kuning menunjukkan skor terendah. Pasangan kombinasi dari dua bahan aktif yang berbeda sebanyak 1430. Skor topologi berada pada rentang (0.0191;1). Skor topologi ini bergantung pada jejaring yang dibentuk. Jejaring protein target berbasis jejaring PPI bukan satu-satunya jejaring yang dapat dibentuk pada metode NIMS. Li et al. (2010) memanfaatkan jejaring protein target yang berbasis jejaring penyakit tertentu untuk melihat sinergi bahan aktif dalam mengobati penyakit tertentu, namun pada penelitian tersebut jejaring protein target yang digunakan bukan jejaring protein target yang diprediksi menggunakan metode drugCIPHER. Penggunaan jejaring protein target yang diprediksi melalui drugCIPHER diharapkan mampu memberikan hasil yang lebih presisi.

Gambar 13(a) menunjukkan bahwa skor topologi dari bahan aktif Sembung terhadap bahan aktif tanaman lain cenderung rendah. Prediksi jejaring menggambarkan posisi protein target dari bahan aktif Sembung relatif jauh daripada protein target dari bahan aktif lainnya. Namun terdapat indikasi kedekatan protein target Sembung dari bahan aktif tertentu terhadap bahan aktif

25 yang berasal dari Pare. Selain dari hubungan protein target bahan aktif Pare dan Sembung di atas, kecenderungan protein target pada bahan aktif Pare memiliki kedeketan dengan protein target pada bahan aktif tanaman Jahe. Jumlah identifikasi bahan aktif Jahe yang lebih banyak dari bahan aktif lainnya menunjukkan sebagian besar pasangan bahan aktif tanaman Jahe mempunyai kedekatan protein target. Bahan aktif dari tanaman Bratawali menunjukkan kedekatan protein targetnya dengan tanaman Jahe dan antar bahan aktif Bratawali sendiri.

Selain melihat skor topologi, skor sinergi dapat ditelusuri melalui sejauh mana kemiripan pasangan bahan aktif tanaman obat dalam hal mengobati penyakit tertentu yang dikuantifikasi dengan Agent Score seperti pada Gambar 13(b). Agent

Score ini diperoleh dari identifikasi keterlibatan protein pada penyakit tertentu

pada pangkalan data OMIM. Agent Score diperoleh dengan menghitung kemiripan pasangan fenotipe dari bahan aktif. Beberapa metode yang dapat digunakan untuk menghitung kemiripan pasangan fenotipe dengan memanfaatkan diagram HPO dan menerapkan metode text mining. Pada penelitian ini, ukuran kemiripan yang digunakan adalah ukuran standar (default) yang tersedia pada

package HPOSim pada perangkat lunak R-Languange yaitu ukuran kemiripan Resnik untuk kesamaan HPO terms dan metode funSimMax untuk skor kemiripan

fenotipe. Beberapa konsep peluang yang berbeda pada ukuran kemiripan lain yaitu Ukuran Lin, Jiang-Contrath, ukuran graph IC, dan ukuran Wang serta metode kemiripan fenotipe seperti Max, Mean, funSimAvg, dan BMA dapat digunakan sebagai bahan perbandingan untuk penelitian selanjutnya.

Agent Score dari 1430 pasangan bahan aktif berada pada rentang

(0.105195; 0.353001). Kemiripan pasangan bahan aktif berdasarkan penyakit yang diobati memiliki skor yang lebih rendah dibanding berdasarkan skor kedekatan protein target. Informasi dari pangkalan data mengenai gen atau produk gen memang tidak selalu menunjukkan bahwa setiap gen atau produk gen memiliki atau mengeskpresikan fenotipe (penyakit) tertentu. Kemiripan bahan aktif dalam hal melihat kesamaan fenotipe ini lebih cenderung terlihat pada bahan aktif antar tanaman Jahe.

Dengan melihat dua aspek secara bersama dalam mengkuantifikasi sinergi antar bahan aktif diperoleh skor sinergi seperti pada Gambar 13(c). Skor sinergi yang diperoleh berada pada rentang (0.00251; 0.353). Skor sinergi berada pada kisaran nilai 0-1. Skor yang kira-kira dianggap valid ialah pada rentang 0-0.9. Jika skor melebihi 0.9 maka kemungkinan besar bahan aktif tersebut bekerja pada set gen yang persis sama. Untu pasangan bahan aktif yang sperti itu membutuhkan informasi lebih jauh untuk membedakan interaksi antar keduanya (Li et al. 2011). Skor sinergi relatif rendah dibanding dengan skor topologi disebabkan sedikitnya kemiripan bahan aktif berdasarkan kelainan fenotipe oleh protein target dari bahan aktif. Skor sinergi tertinggi pada ramuan dapat dilihat pada pasangan bahan aktif antar tanaman Jahe. Sementara sinergi antar tanaman yang berbeda namun mempunya skor sinergi yang relatif tinggi adalah pasangan beberapa bahan aktif tanaman Jahe dan Pare, serta pasangan bahan aktif tanaman Bratawali dan Jahe.

26

Gambar 13 (a) Matriks Topology Score (b) Matriks Agent Score (c) Matriks Synergy Score Kandidat bahan aktif

Ba ha n ak tif -x

Kandidat bahan aktif

Ba ha n ak tif -x Ba ha n ak tif -x

Kandidat bahan aktif

(a) (b)

27

Formulasi jamu pada penelitian ini terdiri atas empat tanaman. Obat tradisional berbasis tanaman di Cina yang dikenal dengan TCM (Traditional

Chinese Medicine) umumnya membuat formula jamu dengan prinsip kombinasi Jun-Chen-Zuo-Si. Prinsip kombinasi tersebut digunakan dalam pembagian peran

masing-masing tanaman. Tanaman Jun bertindak sebagai tanaman obat yang mengobati penyakit utama, tanaman Chen bertindak untuk meningkatkan kinerja tanaman utama, tanaman Zuo-Shi bertindak sebagai tanaman yang mengurangi efek samping dari tanaman utama (Li & Zhang 2013). Jika diasumsikan bahwa tanaman utama disini ialah tanaman Bratawali atau Pare, maka skor sinergi tanaman tersebut jika berpasangan dengan empat tanaman lainnya (Gambar 14).

Potensi skor sinergi antar bahan aktif dengan Pare dan Bratawali sebagai tanaman utama dapat lebih jelas terlihat pada Tabel 4. Terdapat 324 pasangan bahan aktif dari tanaman Bratawali dan Pare terhadap semua bahan aktif pada empat tanaman. Berikut skor sinergi dari enam bahan aktif yang terdapat pada Bratawali dan Pare sebagai bahan aktif utama dengan 3 bahan aktif dengan peringkat teratas.

Tabel 4 Peringkat skor sinergi Pare dan Bratawali terhadap seluruh kandidat bahan aktif

Bahan aktif Utama Kandidat bahan aktif Skor Sinergi Peringkat

B013 J127 0.1270 13 B013 B018 0.0888 20 B013 J153 0.0883 21 B015 J091 0.1568 2 B015 J249 0.1568 3 B015 J036 0.1566 4 B018 J127 0.1398 10 B018 J270 0.1017 14 B018 J153 0.0965 17 P044 P195 0.1759 1 P044 P183 0.1004 15 P044 S002 0.0859 24 P183 P195 0.0648 33 P183 S002 0.0154 45 P183 S031 0.0112 69 P195 S002 0.0840 25 P195 S031 0.0088 88 P195 S030 0.0073 125 B aha n a kti f-x

28

Tabel 4 menunjukkan bahwa bahan aktif yang berasal dari tanaman Bratawali memiliki peluang yang besar untuk bersinergi dengan bahan aktif yang terdapat pada tanaman Jahe. Contoh: Bahan aktif (-)-Secoisolariciresinol (B013) dengan bahan aktif 1,7-Bis(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-heptanediol; (3S,5S)-form,

3',3''-Di-Me ether (J127) dan seterusnya. Daftar bahan aktif dapat dilihat pada

Lampiran 1.

Pengujian Signifikansi Skor Sinergi

Metode NIMS hanya menyediakan informasi mengenai kekuatan sinergi antar pasangan bahan aktif tanaman obat. Pasangan bahan aktif mana yang perlu ditelusuri lebih lanjut (signifikan) masih menjadi tantangan dalam pendekatan komputasi ini. Uji signifikansi pada skor sinergi bertujuan untuk melihat apakah pasangan bahan aktif signifikan bersinergi atau tidak. Skor sinergi yang diperoleh melalui pendekatan komputasi menggunakan metode NIMS, selanjutnya diuji menggunakan konsep uji permutasi dengan menyusun ulang dengan mengacak kumpulan protein target yang menjadi target dari suatu bahan aktif. Penyusunan kembali dan pengacakan pada set protein target pada masing-masing bahan aktif menghasilkan statistik dari pengulangan dengan pengacakan yang kemudian membentuk sebaran statistik dari skor sinergi. Metode NIMS dilakukan dengan pengulangan sejumlah 1000 kali dengan kumpulan protein target yang berbeda untuk masing-masing 1430 pasangan aktif. Setiap pasangan bahan aktif memiliki skor sinergi permutasi sebanyak 1000 skor. 1000 skor sinergi permutasi tersebut membentuk sebaran hipotesis nol. Skor sinergi permutasi selanjutnya dibandingkan dengan skor sinergi aktual yang diperoleh pada metode NIMS dengan kumpulan protein target asli. Sebaran statistik yang dibentuk untuk setiap pasangan bahan aktif digunakan untuk menguji hipotesis dan menarik kesimpulan pasangan bahan aktif mana yang signifikan. Penarikan kesimpulan pada pengujian hipotesis ialah tolak 𝐻𝑜 jika p-value < 𝛼.

Gambar 15 Ilustrasi sebaran hipotesis nol yang diperoleh melalui uji permutasi.

pe rse ntase Ka ndidat ba ha n a kti f

Skor sinergi permutasi (a)

Skor sinergi = 0.1568

P-value = 0.0000 n = 1000

29 B aha n a kti f x

Kandidat bahan aktif

Skor sinergi permutasi yang diperoleh dari 1000 kali ulangan pada pasangan bahan aktif N-trans-Feruloyltyramine (B018) dan Shogaols;

[8]-Shogaol (J097) ditunjukkan pada Gambar 15 sebagai ilustrasi. Skor sinergi

permutasi diperoleh pada rentang nilai (0.013831546 ;0.049665892) dengan sebaran skor seperti pada Gambar 15. Skor sinergi aktual yang diperoleh untuk pasangan bahan aktif tersebut ialah 0.156777867 dan proporsi sebaran skor sinergi permutasi yang lebih besar daripada skor sinergi aktual pada metode NIMS ialah 0% sehingga p-value yang diperoleh pada sebaran tersebut yaitu 0.000000.

P-value yang diperoleh kemudian dijadikan sebagai dasar untuk menolak hipotesis

nol yang berarti bahwa pasangan bahan aktif N-trans-Feruloyltyramine (B018) dan Shogaols; [8]-Shogaol (J097) signifikan bersinergi. Hal yang sama dilakukan untuk 1430 pasangan bahan aktif pada ramuan Jamu. P-value yang diperoleh dari uji permutasi untuk menguji signifikansi antar 1430 pasangan bahan aktif pada ramuan jamu secara ringkas dapat dilihat pada Gambar 16. Pada taraf uji sebesar 5% maka pasangan bahan aktif nyata bersinergi jika p-value < 0.005.

30

Warna gelap pada gambar heatmap (Gambar 16) menunjukkan pasangan bahan aktif signifikan bersinergi (tolak hipotesis nol), sementara warna terang menunjukkan bahwa belum cukup bukti untuk mengatakan bahwa pasangan bahan aktif signifikan bersinergi. Hasil pengujian terhadap skor sinergi untuk skor yang relatif tinggi antar beberapa bahan aktif tanaman Jahe, antar pasangan beberapa bahan aktif pada tanaman Bratawali dan tanaman Jahe, pasangan beberapa bahan aktif tanaman Sembung dan tanaman Bratawali, pasangan beberapa bahan aktif tanaman Sembung dan tanaman Jahe, serta antar pasangan bahan aktif pada tanaman Pare dan tanaman Jahe menghasilkan skor sinergi yang signifikan pada taraf uji nyata 5%.

Hasil yang diperoleh pada uji permutasi ini merupakan salah satu cara untuk menyaring pasangan bahan aktif mana yang perlu ditelusuri lebih lanjut selain mempertimbangkan peringkat kekuatan skor sinergi yang diperoleh pada tahapan pendugaan skor menggunakan metode NIMS. Secara praktis dari sudut pandang ramuan Jamu, implementasi skor sinergi yang signifikan dapat dilihat lagi secara terpadu pada gerombol-gerombol pasangan bahan aktif. Gerombol tersebut mengindikasikan bahwa pasangan bahan aktif bersinergi pada suatu kondisi tertentu. Penelusuran dapat dilakukan lebih lanjut untuk mengidentifikasi pasangan bahan aktif mana yang bersinergi dengan bekerja pada kondisi yang sama dan pasangan bahan aktif bersinergi pada kondisi yang berbeda namun masih dengan mengejar tujuan yang sama.