Jurusan Kimia
Jurusan Kimia FMIPA, UnivFMIPA, Universitas Hasanudersitas Hasanuddindin ISSN 1411-2132ISSN 1411-2132
EKSTRAKSI DNA RUMPUT LAUT
EKSTRAKSI DNA RUMPUT LAUT Kappaphycus Kappaphycus alvarezii alvarezii DENGAN METODE FENOL KLOROFORM*) DENGAN METODE FENOL KLOROFORM*) Andi Tenriulo, Emma Suryati, Andi Parenrengi,
Andi Tenriulo, Emma Suryati, Andi Parenrengi, dandanRosmiatRosmiat****)) ABSTRAK
ABSTRAK
Telah dilakukan ekstraksi genom DNA rumput laut
Telah dilakukan ekstraksi genom DNA rumput laut Kappaphycus Kappaphycus alvareziialvarezii dengan metode konvensional fenoldengan metode konvensional fenol kloroform dengan modifikasi. Sampel yang digunakan berasal dari lokasi budidaya di Pinrang, Madura dan kloroform dengan modifikasi. Sampel yang digunakan berasal dari lokasi budidaya di Pinrang, Madura dan Lombok. Hasil ekstraksi mem
Lombok. Hasil ekstraksi memperlihatkan pita genom DNA yang relatif bersih. perlihatkan pita genom DNA yang relatif bersih. Penambahan kalium asetaPenambahan kalium asetat dapatt dapat meningkatkan kemurnian genom DNA yang diekstraksi. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian genom DNA meningkatkan kemurnian genom DNA yang diekstraksi. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian genom DNA dilakukan dengan menggunakan Spektrofotmeter UV-VIS, diperoleh konsentrasi DNA sekitar 180-240 ng/ dilakukan dengan menggunakan Spektrofotmeter UV-VIS, diperoleh konsentrasi DNA sekitar 180-240 ng/LL dengan tingkat kemurnian rat
dengan tingkat kemurnian rata-rata 1,89. Hasil elea-rata 1,89. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa ktroforesis menunjukkan bahwa konsentrasi DNA 1.020 ngkonsentrasi DNA 1.020 ng cukup untuk memperlihatkan pita yang jelas.
cukup untuk memperlihatkan pita yang jelas.
Kata Kunci
Kata Kunci: : Ekstraksi Ekstraksi DNA,DNA, Kappaphycus Kappaphycus alvareziialvarezii, Fenol kloroform, Fenol kloroform
DNA EXTRACTION OF SEAWEED,
DNA EXTRACTION OF SEAWEED, Kappaphycus Kappaphycus alvarezii alvarezii BY PHEN
BY PHENOL CHLOOL CHLOROFORMROFORM METHODMETHOD ABSTRACT
ABSTRACT
The extraction DNA of seaweed
The extraction DNA of seaweed Kappaphycus alvarezii Kappaphycus alvarezii by by modification modification of of phenol phenol chloroform chloroform conventionalconventional method has been conducted. Samples were collected from culture area in Pinrang, Madura and Lombok. The method has been conducted. Samples were collected from culture area in Pinrang, Madura and Lombok. The extraction result
extraction result showed genomic DNA band showed genomic DNA band which are cleawhich are clear. The r. The addition of potassium acaddition of potassium acetate can increase theetate can increase the purity
purity of of genomic genomic DNA. DNA. The The concentration concentration and and purity purity of of genomic genomic DNA DNA measurement measurement was was done done by by usingusing spectrophotometer UV-VIS. The analysis exhibited that the concentrat
spectrophotometer UV-VIS. The analysis exhibited that the concentration of genomic DNA was obtained 180ion of genomic DNA was obtained 180 -240-240 ng/
ng/L with the purity of 1,89.L with the purity of 1,89. The electrophoresis result showeThe electrophoresis result showed that the genomic DNA concentratid that the genomic DNA concentration of 1.020 ngon of 1.020 ng is suistainable f
is suistainable for showing of or showing of the clear band.the clear band.
Key word
Key word: DNA extraction,: DNA extraction, Kappaphycus Kappaphycus alvareziialvarezii, Phenol Chloroform, Phenol Chloroform
PENDAHULUAN PENDAHULUAN
Budidaya rumput laut telah berkembang Budidaya rumput laut telah berkembang demikian pesat, terutama dikawasan timur Indonesia dan demikian pesat, terutama dikawasan timur Indonesia dan khususnya di Sulawesi Selatan telah dicanangkan menjadi khususnya di Sulawesi Selatan telah dicanangkan menjadi sentra rumput laut dunia, sehingga perlu dukungan sentra rumput laut dunia, sehingga perlu dukungan teknologi yang cukup untuk meningkatkan dan teknologi yang cukup untuk meningkatkan dan mengendalikan kuantitas, kualitas, dan kontinuitas mengendalikan kuantitas, kualitas, dan kontinuitas produksi. Salah
produksi. Salah satu jenis satu jenis rumput laut rumput laut yang paling banyak yang paling banyak dibudidayakan antara lain
dibudidayakan antara lain Euchema Euchema cottonicottoni yang secarayang secara taksonomi berubah menjadi
taksonomi berubah menjadi Kappaphycus Kappaphycus alvareziialvarezii (Doty,2000)
(Doty,2000) Jenis Jenis ini ini termasuk termasuk alga alga merahmerah (Rhodophyceae) penghasil karaginan yang banyak (Rhodophyceae) penghasil karaginan yang banyak digunakan
digunakan dalam dalam industri makindustri makanan, anan, farmasi, kfarmasi, kosmetik osmetik tekstil, dan cat.(Angka,S.L., dan M.T.Suhartono, 2000). tekstil, dan cat.(Angka,S.L., dan M.T.Suhartono, 2000).
Perbedaan kualitas produksi dan karakteristik Perbedaan kualitas produksi dan karakteristik morfologi pada beberapa lokasi budidaya selain morfologi pada beberapa lokasi budidaya selain dipengaruhi oleh faktor lingkungan juga dipengaruhi oleh dipengaruhi oleh faktor lingkungan juga dipengaruhi oleh faktor genetik rumput laut itu sendiri. Untuk mengetahui faktor genetik rumput laut itu sendiri. Untuk mengetahui karakteristik genetik rumput laut diperlukan tehnik karakteristik genetik rumput laut diperlukan tehnik ekstraksi dan isolasi DNA, kemudian dianalisis untuk ekstraksi dan isolasi DNA, kemudian dianalisis untuk membedakan karakter dari masing-masing spesies rumput membedakan karakter dari masing-masing spesies rumput laut yang kel
laut yang kelak akan menjadak akan menjadi bibit untuki bibit untuk pengepengembangmbanganan
budidaya
budidaya rumput rumput laut laut selanjutnya. selanjutnya. Namun Namun informasiinformasi mengenai teknik ekstraksi dan isolasi DNA, serta mengenai teknik ekstraksi dan isolasi DNA, serta karakteristik genetik rumput laut khususnya
karakteristik genetik rumput laut khususnya K K .. alvareziialvarezii belum
belum cukup tersedia.cukup tersedia.
Metode ekstraksi DNA yang tepat merupakan Metode ekstraksi DNA yang tepat merupakan salah satu faktor keberhasilan dalam amplifikasi DNA salah satu faktor keberhasilan dalam amplifikasi DNA yang akan digunakan dalam analisis karakter genetika yang akan digunakan dalam analisis karakter genetika selanjutnya. Isolat genom DNA yang kurang baik akan selanjutnya. Isolat genom DNA yang kurang baik akan mempengaruhi proses amplifikasi DNA. Untuk itu perlu mempengaruhi proses amplifikasi DNA. Untuk itu perlu dilakukan kajian terhadap metode yang umum digunakan dilakukan kajian terhadap metode yang umum digunakan pada
pada pada pada tanaman tanaman dan dan hewan hewan atau atau modifikasi modifikasi daridari metode yang telah ada untuk mengetahui metode ektraksi metode yang telah ada untuk mengetahui metode ektraksi DNA yang sesuai untuk rumput laut
DNA yang sesuai untuk rumput laut K K ..alvareziialvarezii
BAHAN DAN METODE BAHAN DAN METODE Koleksi Sampel
Koleksi Sampel Rumput laut,
Rumput laut, K K ..alvareziialvarezii dikoleksi dari beberapadikoleksi dari beberapa lokasi budidaya di Pinrang, Madura dan Lombok,dibawa lokasi budidaya di Pinrang, Madura dan Lombok,dibawa dalam bentuk segar ke Laboratorium Bioteknologi Balai dalam bentuk segar ke Laboratorium Bioteknologi Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau, Maros.. Identifikasi Riset Perikanan Budidaya Air Payau, Maros.. Identifikasi secara morfologi dilakukan sebagai dasar pengelompokan secara morfologi dilakukan sebagai dasar pengelompokan
jenis rumput laut sebelum analisis genetika. Sampel ( 50 mg) dipreservasi dengan menggunakan 250 uL TNES-Urea buffer (Asahida et al., 1996) dalam tabung eppendorf 1,5 mL. Sampel disimpan dalam suhu ruangan sampai dilakukan ekstraksi DNA.
Ekstraksi DNA
Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode fenol-kloroform yang telah dikembangkan oleh Parenrengi (2001) dengan sedikit modifikasi. Modifikasi metode dilakukan yaitu dengan penambahan kalium asetat dalam proses ektraksi.
Sampel yang sudah dipreservasi dengan TNES-Urea buffer ditambahkan 500 цL lysis buffer (0,5 M NaCl, 0,001 M EDTA, 1 % (w/v) SDS, 0,8 % (v/v) Triton x-100, dan 0,1 M Tris-HCl pH 9,0) kemudian dimasukkan ke tabung eppendorf dan ditambahkan 40 mL SDS 10 % (w/v) dan 20 цL proteinase K (20 mg/mL larutan), diinkubasi pada 550C selama 1–3 jam, kemudian ditambahkan 12,5 цL RNAse (20 mg/mL larutan) dan disimpan pada suhu ruangan selama 15-30 menit Selanjutnya ditambahkan fenol : kloroform : isoamyl alkohol (PCIA (25:24:1)) dan divortex secara perlahan sampai homogen, disimpan pada suhu ruangan selama 10 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 8 menit. Bagian lapisan atas cairan dipindahkan ke tabung eppendorf baru volume 1,5 mL. Penambahan PCIA ini diulangi sekali lagi seperti di atas. Lapisan atas diambil dan ditambahkan larutan kloroform : isoamyl alkohol (CIA (24:1)), disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit. Lapisan atas dipindahkan lagi ke tabung baru dan ditambahkan 0,1 volume kalium asetat 5 M, 0,25 volume etanol, dan 1 vol CIA (24 : 1) disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit. Lapisan atas kemudian ditambahkan etanol absolut dingin dan digoyang dengan pembalikan secara perlahan beberapa saat. DNA yang mengendap pada dasar tabung berupa pellet warna putih sesudah sentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 30 menit dicuci dengan 1 mL ethanol 70 % dan disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit. DNA dikering-anginkan selama lebih kurang 24 jam pada suhu ruangan dan ditambahkan 100 uL aquadest atau TE buffer (10 mM Tris dan 1 mM EDTA, pH 8,0), disimpan pada suhu –20oC untuk proses selanjutnya.
Untuk mengetahui keberhasilan metode ekstraksi yang digunakan, campuran 7,5 цL genom DNA dan 2,5 цL Loading Dye dielektroforesis dalam 0,8 % gel agarose dalam 1 x TBE (Tris-Boric acid-EDTA) pada tegangan 50 volt. Gel distaining dengan 0,5 цg/mL dalam larutan ethidium bromida. Hind III marker digunakan sebagai standar marker genom DNA yang diekstraksi.
Pengukuran Tingkat Kemurnian dan Kuantitas DNA.
2401 PC Simatdzu. Sampel diukur dengan volume cuvet 3 mL dan faktor pengenceran 200. Untuk mendapatkan konsentrasi DNA untai ganda digunakan rumus :
Konsentrasi DNA(цg/ml) = A260x 50 x faktor pengenceran Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi protein dalam larutan. Kemurnian larutan DNA tersebut dapat dilihat dengan membagi nilai A260 dengan A280. Molekul DNA dikatakan murni jika rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8 – 2,0. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1,8 maka masih ada kontaminasi protein atau fenol di dalam larutan (Sulandari,S dan
M.S.A. Zein. 2003).
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi DNA
Hasil ekstraksi DNA rumput laut menggunakan metode konvensional fenol-kloroform menghasilkan fragmen tunggal genom yang relatif bersih. Hal ini menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA yang telah dikembangkan untuk ikan (hewan) atau tanaman dapat diaplikasikan pada alga khususnya rumput laut K. alvarezii
(Gambar 1.)
Gambar 1. Genom DNA rumput laut G. verrucosayang dieksraksi dengan Metode Fenol-Kloroform, 1=Marker Hind III; 2,3,4 =
Genom DNA
Pita genom DNA yang bersih tanpa latar belakang mengindikasikakan tingkat kemurnian DNA
yang baik (DNA tidak terdegradasi dan terkontaminasi). Kontaminasi oleh fenol dan bahan organik lainnya dapat dilihat dengan munculnya latar belakang yang smear disepanjang jalur pergerakan pita genom DNA. terdegradasi dan kontaminasi RNA ditandai dengan adanya pita yang kabur pada posisi berat molekul yang rendah.
Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti ethyllenediamine tetraacetic (EDTA), Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) dan Triton X-100. EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan aktifitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat). SDS dan Triton X-100 merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membran sel dan menyebabkan pecahnya kromosom . Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein dan enzim RNAse digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh (Muhammad,S.A., dan Praseno. 1991). Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nukleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan fenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan kloroform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan.Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung
ependorf.
Parenrengi (2001) menggunakan metode fenol-kloroform pada ekstraksi ikan Kerapu ( Epinephelus spp) dan menggunakan metode yang sama pada ekstraksi rumput laut Gracilaria verrucosa. Metode fenol-kloroform yang dikembangkan oleh Parenrengi et al.,(2007) pada G.verrucosa menunjukkan hasil yang lebih baik dari metode CTAB yang digunakan pada alga
coklat (Kraan dan Guiry, 1998) dan metode yang digunakan pada Rhodophyta (Wattier et al.,2000). K onsentrasi dan kemurnian DNA
Selain dari hasil elektroforesis, keberhasilan proses ektraksi dapat diketahui dari hasil pengukuran absorban menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Dengan pengambilan sampel secara acak tanpa penambahan kalium asetat didapatkan rata-rata jumlah DNA = 372,0 ng/ цl dengan tingkat kemurnian DNA = 1,4. Pada penggunaan metode fenol kloroform dengan penambahan kalium asetat dihasilkan rata-rata jumlah DNA = 226,0 ng/ цl dengan tingkat kemurnian (purity) = 1,824. Hal ini menunjukkan bahwa penggunaan kalium asetat dapat menanggulangi masalah tingginya kandungan polisakarida pada rumput laut. Penambahan kalium asetat sebanyak 10 % dari volume pengambilan larutan setelah penggunaan kloroform isoamyl alkohol dapat mengurangi kontaminasi polisakarida atau fenol di dalam larutan ( Kraan S. and Guiry M.D, 1998).
Banyaknya radiasi ultraviolet yang diserap oleh larutan DNA berbanding lurus dengan banyaknya DNA dalam sampel. Penyerapan sinar tersebut oleh nukleotida secara maksimal dicapai pada 260 nm, sedangkan
penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada 280 nm.
Hasil pengukuran tingkat kemurnian dan kuantitas DNA dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Tingkat kemurnian dan kuantitas DNA (ng/ цL) pada beberapa sampel rumput laut K. alvarezii, yang diambil secara acak.
Sampel
Tanpa Penambahan K asetat
Sampel Penambahan K asetat Tingkat kemurnian (A260/A280) Kuantitas (ng/ цL) Tingkat kemurnian (A260/A280) Kuantitas (ng/ цL) MH31 1,83 110 PH72 1,92 230 PC66 1,55 170 PH73 1,83 220 MC34 1,05 560 PC79 1,85 240 LH 43 1,19 500 PC80 1,75 210 PH58 1,18 520 PC82 1,77 230 Jumlah 1,36 372 Jumlah 1,824 226
Hasil uji tingkat kemurnian DNA sampel PC66 adalah 1,55 nilai tersebut dihasilkan dengan membagi nilai A260 dengan A280. Molekul DNA dikatakan murni
jika rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8 – 2,0. Kontaminasi protein dan bahan organik lainnya ditandai dengan rendahnya nilai rasio A260/A280(<1,8), sebaliknya
kontaminasi fenol ditandai dengan tingginya nilai rasio tersebut (>2,0). (Linacero et al.,1998 ).
Genom DNA dengan Volume dan Konsentrasi yang berbeda.
Hasil isolasi DNA rumput laut yang dilakukan dengan metode fenol-kloroform diuji kualitasnya dengan elektroforesis gel agarose dan volume genom yang digunakan adalah : 3 цL ; 6 цL; 9 цL; 12 цL; 15 цL; 18 цL.
Pengujian kuantitas DNA sampel PC-66 dengan alat spektrofotometer menunjukkan hasil absorban atau A260= 0,017, sehingga diketahui konsentrasi DNA sampel
PC-66 adalah = 170 ng/ цL yaitu dengan menggunakan rumus = A260 x faktor pengenceran x 50 = 170 ng/ цL
larutan DNA hasil isolasi. Pada sumur nomor 2 dengan volume 3 цL berarti jumlah DNAnya adalah 3 x 170 ng/ цL = 510 ng, sumur 3 konsentrasi DNA = 1.020 ng, sumur 4 konsentrasi DNA = 1.530 ng, sumur 5 konsentrasi DNA = 2.040 ng, sumur 6 konsentrasi DNA = 2.550 ng dan sumur nomor 7 adalah 18 x 170 = 3.060 ng. Kualifikasi beberapa volume DNA sampel dilihat pada gambar 2 :
Uji kualitas DNA memperlihatkan bahwa genom dengan konsentrasi yang lebih tinggi memperlihatkan ketebalan pita yang lebih besar dibandingkan dengan konsentrasi yang lebih rendah (Gambar.2). Pita yang nampak pada sumur 2 (konsentrasi genom 510 ng) sangat tipis dibandingkan dengan sumur lainnya yaitu 3 (1.020 ng), 4(1.530 ng), 5(2.040 ng), 6(2.550 ng),dan 7 (3.060 ng). Hal ini menunjukkan bahwa volume 6 uL (konsentrasi DNA 1.020 ng) cukup untuk memperlihatkan band yang jelas. Semakin besar volume genom yang di loading pada sumur gel, maka semakin tinggi konsentrasi DNA yang terkandung di dalam larutan sampel tersebut.
Gambar 2. Hasil elektroforesis genom DNA rumput laut K. alvarezii
PC66 dengan konsentrasi yang berbeda. Ket: (Konsentrasi DNA = 170 ng/ цL. 1= marker Hind III; 2= genom DNA 3 цL; 3= genom
DNA 6 цL ; 4 = genom DNA 9 цL ; = 5 genom DNA 12 цL ; 6 = genom DNA 15 цL ; Sumur 7 = genom DNA 18 цL).
KESIMPULAN
1. Ekstraksi DNA rumput laut K. alvarezii.dapat dilakukan dengan metode konvensional fenol-kloroform dengan sedikit modifikasi.
2. Penambahan kalium asetat pada metode fenol-kloroform dapat meningkatkan tingkat kemurnian DNA. Pada penggunaan metode fenol kloroform dengan penambahan kalium asetat dihasilkan rata-rata jumlah DNA = 226,0 ng/цL dengan tingkat kemurnian (purity) = 1,824 tanpa penambahan kalium asetat didapatkan rata-rata jumlah DNA = 372,0 ng/цL dengan tingkat kemurnian DNA = 1,36
3. Semakin besar volume genom yang di loading pada sumur gel, maka semakin tinggi konsentrasi DNA yang terkandung di dalam larutan sampel tersebut dan membentuk pita yang lebih tebal.
DAFTAR PUSTAKA
Angka,S.L., dan M.T.Suhartono, 2000. Bioteknologi Hasil Laut. Pusat Kajian Sumberdaya Pesisir dan Lautan Institut Pertanian Bogor. hal 47
Asahida, T., T. Kabayashi, K. Saitoh, and I. Nakayama. 1996. Tissue preservation and total DNA extraction from fish store at ambient temperature using buffer containing high concentration of urea. Fisheries Science 62(5):727-730. Doty, 2000.The Production an Use Eucheuma Departement Of Botany University of Hawaii Honolulu, Hawai, p.45.
Linacero, R., J. Rueda and A.M.Vazquez. 1998. Quantification of DNA. Pages 18-21 in Karp, A., P. G. Isaac, and D. S. Ingram (Eds.) Molecular Tools for Screening Biodiversity: Plants and Animals. Chapman and Hall. London, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras.
Muhammad,S.A., dan Praseno (Eds.). 1991. Pengantar Kloning Gena. Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. Hal 31-33. Parenrengi,A., Sulaeman, E. Suryati dan A.Tenriulo. 2007. Karakteristik Genetik Rumput Laut Gracillari verrucosa dari
Beberapa Sumber. Makalah telah disampaikan pada Konfrensi Masyarakat Akuakultur Indonesia tgl 5 – 7 Juli 2007 di Surabaya. 11 hal.
Parenrengi, A., 2001. Studies on genetic variability of groupers ( Epinephelusspp.) from Indo-Malaysian waters using PCR-RAPD analysis. Master thesis of Kolej University Terengganu, Universiti Putra Malaysia, Malayasia, 174 pp
Sulandari,S dan M.S.A. Zein. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA. Bidang Zoologi Pusat Penelitian Biologi LIPI.hal 72-87
Wattier, R.A., P.A. Prodohl and C.A. Maggs., 2000. DNA isolation protocol for red seaweed (Rhodophyta). Plant Molecular Biology Reporter 18:275-281.
